易明珠，王丹豐，王 勝，潘潔怡，余 慶，安光輝，孫少平，*，梁 娜，*

(1. 哈爾濱師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，哈爾濱 150025；2.黑龍江大學(xué) 化學(xué)化工與材料學(xué)院，哈爾濱 150080)

0 引 言

固相法合成多肽已成為合成30肽以下小肽的主要方法[1],在合成過程中所運(yùn)用的氨基酸保護(hù)策略主要有Fmoc法[2]和Boc[3-4]法。Boc法氨基保護(hù)策略缺點(diǎn)為合成過程中條件苛刻，需要使用強(qiáng)酸HF脫除氨基酸的保護(hù)基團(tuán)，并且不能隨時(shí)監(jiān)測(cè)，因此很難用于小肽的大規(guī)模自動(dòng)合成。相對(duì)于Boc法，F(xiàn)moc法反應(yīng)條件溫和，在接肽過程中可以避免反復(fù)使用強(qiáng)酸，并且每次脫保護(hù)過程中能夠釋放出可檢測(cè)的化合物，可實(shí)現(xiàn)隨時(shí)監(jiān)測(cè)。

細(xì)胞穿膜肽是人類在研究艾滋病的過程中發(fā)現(xiàn)的一種寡肽，一般由陽(yáng)離子氨基酸組成。最具有代表性的穿膜肽為HIV-1 TAT蛋白、寡聚精氨酸，而八聚精氨酸(octaarginine, R8)是在TAT 49-57寡肽的研究基礎(chǔ)上所篩選的具有較強(qiáng)穿膜能力的膜活性肽，能夠高效地穿過與之相接觸的細(xì)胞膜[5-6]。近年來，大量研究表明，經(jīng)八聚精氨酸修飾的載體可以提升藥物入胞效率[7-9]。

本文采用Fmoc方法固相合成八聚精氨酸，以期對(duì)八聚精氨酸合成工業(yè)化以及提高藥用載體的穿膜性提供必要的基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

多肽合成反應(yīng)器(50 mL, 自制)；多肽活化器(50 mL, 自制)；Fmoc-pbf-精氨酸(上海吉爾生化)；N,N-二異丙基乙胺(DIEA，薩恩化學(xué)技術(shù)(上海)有限公司)；王樹脂(晶純生化科技股份(上海)有限公司)；2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU，上海麥克林生化科技有限公司)；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)、哌啶、三氟乙酸(TFA)均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 八聚精氨酸的合成

1) 第一個(gè)氨基酸與樹脂的酯化反應(yīng)：取定量的王樹脂置于多肽合成反應(yīng)器中，加入DMF浸泡2 h，抽干；在活化器中，加入一定量的Fmoc-pbf-精氨酸、HATU、DIEA，使其與王樹脂的摩爾比為3∶2.85∶6∶1，于DMF中活化2 h；將活化器中的溶液加入含有樹脂的多肽反應(yīng)器中，磁力攪拌下繼續(xù)反應(yīng)3 h。將所得產(chǎn)物高速離心，DMF、DCM交替洗滌5次，抽干。

2) 脫除Fmoc保護(hù)基：向抽干后的1)產(chǎn)物中加含有20%哌啶的DMF溶液，反應(yīng)1 h，脫除Fmoc基團(tuán)。

3) 肽鍵的形成：向脫除Fmoc保護(hù)基的樹脂2)中加入活化的Fmoc-pbf-精氨酸繼續(xù)反應(yīng)。理論上每重復(fù)步驟2)～3)，都會(huì)反應(yīng)上一個(gè)精氨酸，直至樹脂上接上8個(gè)精氨酸。

4) 樹脂與八聚精氨酸的分離：將所得到的白色產(chǎn)物置于反應(yīng)瓶中，加入TFA，室溫下攪拌3 h，減壓抽濾，棄去固體，用乙酸乙酯將產(chǎn)品轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙酸乙酯，凍干，即得白色產(chǎn)物，稱重，計(jì)算產(chǎn)率。

1.3 分析與檢測(cè)

采用茚三酮定性顯色法監(jiān)測(cè)反應(yīng)過程，并且用質(zhì)譜分析鑒定產(chǎn)品。理論取代度與酯化效率的計(jì)算方法如下：

采用溴化鉀(KBr)壓片法，于4 000～400 cm-1對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行紅外光譜測(cè)定。

1.4 細(xì)胞膜穿透能力的考察

為考察八聚精氨酸的修飾對(duì)于體系進(jìn)入細(xì)胞能力的影響，借助于FITC熒光標(biāo)記技術(shù)，以FITC為對(duì)照，于倒置熒光顯微鏡下觀察偶聯(lián)八聚精氨酸的FITC的細(xì)胞攝取行為。具體操作如下：精密稱定FITC，配制成濃度為1 mg·mL-1的FITC-DMSO溶液。取八聚精氨酸溶液，加入適量的FITC溶液，室溫下避光攪拌8 h。將反應(yīng)液置于透析袋中(MWCO：3 500 Da)，蒸餾水透析24 h，得到FITC標(biāo)記的八聚精氨酸溶液。

將FITC溶液與偶聯(lián)八聚精氨酸的FITC溶液分別加入到培養(yǎng)板中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育0.5 h，吸去培養(yǎng)液，用PBS溶液沖洗細(xì)胞3次，于熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的攝取情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 王樹脂取代度對(duì)酯化效率的影響

將不同取代度的王樹脂與Fmoc-pbf-精氨酸在相同條件下反應(yīng)，測(cè)定其酯化效率，結(jié)果見表1。由表1可見，在與王樹脂縮合的反應(yīng)過程中，氨基酸與王樹脂的酯化效率隨王樹脂取代度的減小而增大。隨著取代度的減小，王樹脂在DMF中的溶脹度隨之變大，導(dǎo)致樹脂內(nèi)部網(wǎng)格空間變大，反應(yīng)活性點(diǎn)密度變小。因此，已酯化的氨基酸對(duì)樹脂內(nèi)鄰近的其它反應(yīng)活性點(diǎn)的位阻變小，使得氨基酸的進(jìn)一步縮合位阻變小，從而使縮合效率增大。而酯化效率的增大使得產(chǎn)率增大。

表1 王樹脂取代度對(duì)酯化效率的影響

采用Fmoc策略合成的第一步是將一個(gè)Fmoc保護(hù)的精氨酸的羧基通過酯鍵連接到載體樹脂上，此步的連接效率不僅影響到后續(xù)反應(yīng)氨基酸的用量，也影響八聚精氨酸的收率。因此，第一步連接效率在固相多肽合成的研究中至關(guān)重要?？紤]到反應(yīng)效率以及成本等因素，本研究采用取代度1.0 mmol·g-1的王樹脂作為載體。

2.2 攪拌方式對(duì)酯化效率的影響

取同一批王樹脂(取代度1.0 mmol·g-1)分別與Fmoc-pbf-精氨酸反應(yīng)，在其他反應(yīng)條件相同的情況下，考察機(jī)械攪拌(200 rpm)與恒溫振蕩器攪拌(200 rpm)兩種攪拌方式對(duì)酯化效率的影響。

由結(jié)果可見，酯化反應(yīng)效率在機(jī)械攪拌的條件下為71.2%，高于恒溫振蕩器中的61.9%。在固相反應(yīng)的固-液兩相反應(yīng)體系中，F(xiàn)moc-pbf-精氨酸必須與王樹脂內(nèi)部的羥基充分接觸才能發(fā)生反應(yīng)。增加攪拌強(qiáng)度可以提高膜擴(kuò)散速率，機(jī)械攪拌強(qiáng)度遠(yuǎn)大于恒溫振蕩器攪拌強(qiáng)度，因此機(jī)械攪拌的反應(yīng)效率要更高一些。

2.3 王樹脂粒度對(duì)酯化效率的影響

將2批粒度不同、取代度相同的王樹脂(1.0 mmol·g-1)，分別與Fmoc-pbf-精氨酸在相同的條件下反應(yīng)，結(jié)果見表2。由表2可見，王樹脂粒徑越小,酯化效率越高。這是由于粒徑越小,粒子比表面積越大，樹脂表面裸露的羥基相對(duì)更多；另外，王樹脂的粒徑越小，反應(yīng)物擴(kuò)散的路徑越短，越有利于酯化反應(yīng)中Fmoc-pbf-精氨酸及縮合試劑的粒內(nèi)擴(kuò)散和縮合反應(yīng)的進(jìn)行。

2.4 八聚精氨酸粗品的鑒定

將冷凍干燥后的樣品溶解在甲醇中，取3 μL的溶液置于基板中，待其干燥后，用飛行質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見圖1。由八聚精氨酸的結(jié)構(gòu)推斷所合成的產(chǎn)物理論分子量為1 267.6。對(duì)照質(zhì)譜結(jié)果，推斷m/z =1 283.98的峰為[M+OH]-的分子離子峰，所得到的終產(chǎn)物分子量為1 266.98，與八聚精氨酸的理論分子量基本一致，由此可以證明產(chǎn)物中含有八聚精氨酸。

表2 王樹脂粒度對(duì)酯化效率的影響

對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步的紅外分析，結(jié)果見圖2。由圖2可見，在產(chǎn)物的紅外圖譜中，位于3 373 cm-1處的強(qiáng)峰由游離氨基的伸縮振動(dòng)所產(chǎn)生；1 452 cm-1處的吸收峰由精氨酸中胍基的不對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起；位于1 665 cm-1以及1 544 cm-1處的吸收峰分別歸屬于羰基的C-O伸縮振動(dòng)(酰胺I帶)以及仲胺基的N-H彎曲振動(dòng)(酰胺II帶)；于1 213 cm-1處觀察到的信號(hào)峰為酰胺鍵中C-N的吸收峰。這些現(xiàn)象充分證明了酰胺鍵的存在，表明已成功制備了八聚精氨酸。

圖1 八聚精氨酸的質(zhì)譜圖Fig.1 Mass spectrum of crude octaarginine

圖2 八聚精氨酸的紅外圖譜Fig.2 FT-IR spectrum of crude octaarginine

2.5 八聚精氨酸修飾對(duì)于細(xì)胞膜穿透能力的影響

將FITC溶液與偶聯(lián)八聚精氨酸的FITC溶液分別與MCF-7細(xì)胞共孵育0.5 h，于熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的攝取情況，結(jié)果見圖3。

圖3 FITC(a)與八聚精氨酸修飾的FITC(b)在MCF-7細(xì)胞中的攝取行為Fig.3 Fluorescent images of MCF-7 cells incubated with FITC (a) and octaarginine modified FITC (b)

由圖3可見，與單純的FITC相比，經(jīng)八聚精氨酸修飾后的FITC，其進(jìn)入細(xì)胞的能力顯著增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度明顯增大，在細(xì)胞內(nèi)可觀察到聚集的高亮熒光塊，表明八聚精氨酸的修飾能夠顯著增強(qiáng)FITC穿透細(xì)胞膜的能力。

3 結(jié) 論

本文采用Fmoc固相合成法制備八聚精氨酸，并考察八聚精氨酸的修飾對(duì)于體系細(xì)胞攝取能力的影響。研究結(jié)果表明，固相反應(yīng)效率受多種因素的影響，對(duì)于同一種保護(hù)氨基酸而言，王樹脂的取代度越低，樹脂粒度越小，縮合反應(yīng)效率越高；適當(dāng)增強(qiáng)攪拌強(qiáng)度以提高縮合反應(yīng)效率。研究所制備的八聚精氨酸能夠顯著增強(qiáng)體系穿透細(xì)胞膜的能力，其有望用于修飾藥用載體，為增強(qiáng)藥物穿透細(xì)胞膜的能力、提高藥效提供必要的基礎(chǔ)。