吳雅珣，張邢松，鄭桂華

膀胱癌是常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，其中約90%為膀胱尿路上皮癌(urothelial bladder cancer, UBC)，非尿路上皮癌罕見[1-2]。目前，UBC的治療主要包括經(jīng)尿道腫瘤電切、膀胱部分切除、膀胱根治性切除等手術(shù)治療以及灌注化療、全身化療、放療等，但復發(fā)率仍較高[3]。近年以程序性死亡受體-1(programmed death-1, PD-1)/程序性死亡配體-1(programmed death-ligand 1, PD-L1)信號通路為靶點的免疫治療取得突破性進展，給UBC患者帶來新希望[4]。PD-1是一種表達于T細胞表面的受體，可調(diào)節(jié)T細胞活化?，F(xiàn)已證實，PD-L1表達與腫瘤的免疫逃逸有關(guān)，可在多種腫瘤中表達，且PD-L1高表達患者預后不良。近年有文獻報道PD-1的另一配體——程序性死亡配體-2(programmed death-ligand 2, PD-L2)，在腫瘤發(fā)生和免疫逃避中同樣發(fā)揮重要作用。PD-L2又稱B7-DC或CD273，是B7配體家族的一員，與PD-L1同源，兩者在不同組織中的表達不盡相同[3]。本文著重探討UBC組織的腫瘤細胞以及腫瘤浸潤性免疫細胞(tumor-infiltrating immune cell, TIIC)中PD-L1、PD-L2的表達及臨床意義，為臨床與病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料收集2013年3月～2018年3月江蘇省南通市腫瘤醫(yī)院病理科確診的UBC石蠟標本58例，制作成組織芯片；其中男性48例，女性10例；患者年齡32～87歲，中位年齡66.5歲；組織學分級：高級別UBC和低級別UBC各29例。pT分期：pTa-pT1者43例，pT2-pT4者15例。N分期：N0者54例，N1-N3者4例。M分期：M0者57例，M1者1例。

1.2 免疫組化采用免疫組化EnVision法染色，一抗PD-L1(22C3，稀釋度1 ∶50)購自Dako公司，PD-L2(D7U8C，稀釋度1 ∶200)購自Cell Signaling Technology公司，二抗及DAB購自Dako公司，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。用已知陽性組織作為陽性對照，以PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 判斷標準PD-L1陽性染色定位于細胞膜，按陽性細胞百分比進行判讀：分別以1%、10%、50%為cut-off值，評估腫瘤細胞PD-L1的陽性程度；以5%、10%、50%為cut-off值，評估TIIC PD-L1的陽性程度。PD-L2陽性染色定位于細胞膜/細胞質(zhì)，腫瘤細胞PD-L2按染色強度和陽性細胞百分比進行評分，參考Okadome等[5]的標準：將腫瘤細胞PD-L2按染色強度評分：無著色為0分、黃色為1分、棕黃色為2分、棕色為3分；按陽性細胞百分比評分：陽性細胞<10%為0分，10%～29%為1分，30%～49%為2分，≥50%為3分；將兩者得分相乘，總分≥3分為PD-L2陽性。TIIC PD-L2按陽性細胞百分比進行判讀：分別以5%、10%、50%為cut-off值，評估TIIC PD-L2的陽性程度。

1.4 統(tǒng)計學分析采用Pearson χ2、Fisher精確概率法分析腫瘤細胞及TIIC PD-L1、PD-L2表達與UBC臨床病理特征的關(guān)系；利用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，Log-rank檢驗進行差異性比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 UBC中PD-L1、PD-L2表達與臨床病理特征的關(guān)系本組UBC組織中PD-L1可評估57例，1例因點陣脫落無法評估；PD-L2可評估56例，2例因點陣脫落無法評估。cut-off值為1%、10%、50%時，腫瘤細胞PD-L1在高級別UBC(圖1)、pT2-pT4 UBC中的表達高于低級別UBC(圖2)、pTa-pT1 UBC(P均<0.05)。在cut-off值為5%時，TIIC PD-L1在高級別UBC(圖3)、pT2-pT4 UBC中的表達高于低級別UBC(圖4)、pTa-pT1 UBC(P均<0.05)；在cut-off值為10%時，TIIC PD-L1在pT2-pT4 UBC中表達高于pTa-pT1 UBC(P=0.014，表1、2)。腫瘤細胞PD-L2表達與UBC組織學分級、pT分期等均無關(guān)(P均>0.05)。在cut-off值為50%時，TIIC PD-L2在pTa-pT1 UBC中表達低于pT2-pT4 UBC(P=0.044，表3，圖5、6)。

2.2 UBC中PD-L1、PD-L2表達與預后的關(guān)系在cut-off值為1%、10%、50%時，腫瘤細胞PD-L1表達狀態(tài)與UBC患者的總生存期(overall survival, OS)無關(guān)(P均>0.05)。在cut-off值為5%時，TIIC PD-L1高表達患者比低表達患者OS短(P=0.011，圖7)；在cut-off值為10%、50%時，TIIC PD-L1表達狀態(tài)與患者OS均無相關(guān)性(P均>0.05)。腫瘤細胞及TIIC的PD-L2表達與患者OS均無相關(guān)性(P均>0.05)。

表1 膀胱尿路上皮癌中腫瘤細胞PD-L1表達與臨床病理特征的關(guān)系(cut-off)

表2 膀胱尿路上皮癌中腫瘤浸潤性免疫細胞PD-L1表達與臨床病理特征的關(guān)系(cut-off)

表3 膀胱尿路上皮癌腫瘤細胞及腫瘤浸潤性免疫細胞的PD-L2表達與臨床病理特征的關(guān)系(cut-off)

圖1 高級別膀胱尿路上皮癌中腫瘤細胞的PD-L1表達，EnVision法 圖2 低級別膀胱尿路上皮癌中腫瘤細胞的PD-L1表達，EnVision法 圖3 高級別膀胱尿路上皮癌中腫瘤浸潤性免疫細胞PD-L1的表達，EnVision法 圖4 低級別膀胱尿路上皮癌中腫瘤浸潤性免疫細胞PD-L1的表達，EnVision法 圖5 pT1期膀胱尿路上皮癌中腫瘤細胞、腫瘤浸潤性免疫細胞PD-L2的表達，EnVision法 圖6 pT3期膀胱尿路上皮癌中腫瘤細胞、腫瘤浸潤性免疫細胞PD-L2的表達，EnVision法

圖7 腫瘤浸潤性免疫細胞PD-L1表達的Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

PD-1又稱為PDCD1、CD279，是一種重要的免疫抑制分子，屬于共刺激分子B7-CD28家族，廣泛表達于各種免疫細胞和非免疫細胞。PD-L1(又稱為CD274、B7-H1)和PD-L2(又稱為CD273、B7-DC)是PD-1的2個配體，具有不同的表達譜[6-7]。PD-L1可表達于多種不同類型的細胞，在造血細胞(如T細胞、B細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞)以及非造血細胞(如血管內(nèi)皮細胞、胰島細胞、胎盤合體滋養(yǎng)細胞)中均有表達?，F(xiàn)已證實，促炎癥信號可誘導PD-L1的表達。PD-L2的表達相對局限，主要表達于樹突狀細胞、巨噬細胞和B細胞。在正常狀態(tài)下，PD-L2的表達相對較低，但與PD-L1相似，亦可由炎癥刺激誘導。PD-1的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域含有2個酪氨酸基序。當PD-1與其配體結(jié)合后，PD-1的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，并與蛋白酪氨酸磷酸酶(如SHP2)結(jié)合。蛋白酪氨酸磷酸酶可引起激酶去磷酸化并拮抗T細胞受體(T cell receptor， TCR)和CD28信號，影響下游信號通路，如PI3K-AKT、RAS、ERK、PLCγ等，繼而抑制T 細胞活化、增殖、存活、細胞因子產(chǎn)生，并影響代謝[8]。此外，PD-L1和PD-L2亦可表達于腫瘤細胞。

據(jù)文獻報道，在多種腫瘤中PD-L1高表達常與預后不良有關(guān)。腫瘤浸潤性淋巴細胞PD-1表達也常與預后不良有關(guān)[9]。經(jīng)PD-1/PD-L1信號途徑，腫瘤細胞通過向表達PD-1的T細胞傳遞抑制信號，減弱免疫反應。抗PD-1和PD-L1抗體可阻斷該通路，增強抗腫瘤免疫反應，抑制腫瘤生長[10]。劉維輝等[11]報道PD-L1在UBC中表達上調(diào)，且與UBC臨床分期、組織學分級、非肌層浸潤型UBC危險度分級以及腫瘤復發(fā)密切相關(guān)。本組結(jié)果顯示：腫瘤細胞及TIIC的PD-L1表達與UBC患者性別、年齡、腫瘤直徑、數(shù)目、N分期以及M分期均無關(guān)(P均>0.05)。

近期研究發(fā)現(xiàn)，阻斷PD-L2可能對恢復免疫細胞的功能和減少腫瘤細胞的免疫逃逸也至關(guān)重要。有研究報道在肺鱗狀細胞癌中PD-L1和PD-L2的表達，與CD8陽性腫瘤浸潤性淋巴細胞數(shù)目增加以及MET表達增加有關(guān)[12]。在食管癌中PD-L2陽性患者比PD-L2陰性患者的OS短[5]。耿衛(wèi)樸等[13]報道正常人乳腺腺上皮細胞中PD-L1和PD-L2均陰性；乳腺導管內(nèi)癌中PD-L1和PD-L2均弱陽性；在乳腺浸潤性導管癌中D-L1和PD-L2均強陽性；PD-L1和PD-L2的表達與ER、PR相關(guān)，但與乳腺癌其它臨床病理特征無相關(guān)性。Yang等[3]研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌中PD-L2高表達患者OS和無瘤生存期短。本組結(jié)果發(fā)現(xiàn)：腫瘤細胞PD-L2表達與UBC組織學分級以及pT分期等臨床病理特征均無關(guān)(P均>0.05)。TIIC PD-L2表達與患者性別、年齡、腫瘤直徑、數(shù)目、N分期以及M分期均無關(guān)(P均>0.05)。腫瘤細胞及TIIC的PD-L2表達狀態(tài)與患者OS無相關(guān)性(P均>0.05)。本組結(jié)果未顯示PD-L2陽性組與陰性組OS的差異，可能與樣本量較小有關(guān)，在后續(xù)的研究中可擴大樣本量進一步明確兩者之間是否有關(guān)。

目前，PD-L1、PD-L2在UBC中的最佳cut-off值尚無統(tǒng)一定論，參考Davick等[14]的報道，本實驗選取多個cut-off值分析PD-L1、PD-L2在UBC中的表達及臨床病理意義。結(jié)果顯示：cut-off值1%、10%、50%時，腫瘤細胞PD-L1在高級別UBC、pT2-pT4 UBC中的表達高于低級別UBC、pTa-pT1 UBC中的表達(P均<0.05)。在cut-off值為5%時，TIIC PD-L1在高級別UBC、pT2-pT4 UBC中的表達高于低級別UBC以及pTa-pT1 UBC(P均<0.05)；在cut-off值為10%時，TIIC PD-L1在pT2-pT4 UBC中的表達高于pTa-pT1 UBC(P=0.014)，但在高級別UBC以及低級別UBC中的表達差異無統(tǒng)計學意義(P=0.052)；而在cut-off值為50%時，TIIC PD-L1表達與組織學分級及pT分期均無相關(guān)性(P均>0.05)。與PD-L1不同，腫瘤細胞PD-L2表達與UBC組織學分級以及pT分期等均無關(guān)(P均>0.05)。僅在cut-off值為50%時，TIIC PD-L2在pT2-pT4 UBC中的表達高于pTa-pT1 UBC(P=0.044)。

綜上所述，UBC的腫瘤細胞、TIIC均可表達PD-L1、PD-L2，評估兩者的表達狀態(tài)，可為后續(xù)臨床開展免疫治療提供參考。