韓雪琴，沈文娟，張振海，田 雷，羅成科，楊淑琴，李培富，張銀霞

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,銀川 750021，2.寧夏回族自治區(qū)原種場(chǎng)，銀川 750200,3.寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)作物研究所，銀川 750105)

0 引 言

【研究意義】水稻(oryzasativa)是全世界第二大糧食作物[1]。病害是影響水稻生產(chǎn)最重要的限制因素，其中稻瘟病作為水稻的三大病害之一，影響著水稻的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)。稻瘟病是由真菌(magnaportheoryzae)引起的一種極具破壞力的真菌性病害，多樣化程度高，具有流行性、突發(fā)性、毀滅性的特點(diǎn)。在適宜溫度和高濕條件下，水稻產(chǎn)區(qū)造成的產(chǎn)量損失在30%～50%[2]，在發(fā)病嚴(yán)重的時(shí)候，造成水稻顆粒無(wú)收。常規(guī)育種只是通過(guò)植株的表型和調(diào)查植株的抗性鑒定相結(jié)合的方法選育抗病品種，這樣的選育不能使多基因聚合，并且選育的品種不具有廣譜和持久的抗性，不能有效控制病害的發(fā)生。采用化學(xué)防治方法來(lái)控制稻瘟病，雖然可以發(fā)揮一定的作用，但對(duì)環(huán)境的污染逐漸加重，并且嚴(yán)重影響著水稻的優(yōu)質(zhì)特性，不能從根本上控制病害的發(fā)生。生產(chǎn)中采用種植含有廣譜持久主要抗病基因的抗病品種是控制病害的發(fā)生最為經(jīng)濟(jì)有效且環(huán)保的方法，而廣譜持久抗性基因的挖掘和鑒定是前提條件。研究水稻稻瘟病抗性的研究進(jìn)展，對(duì)水稻抗性育種有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】已有大約100個(gè)抗性基因被鑒定出和500個(gè)抗病基因相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)[3]，在水稻基因組中被鑒定和定位的基因中，已有37個(gè)基因被成功克隆[4]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】研究以水稻稻瘟病抗性的機(jī)理，抗性基因的定位、克隆，以及抗性基因在抗性育種中的應(yīng)用研究近況進(jìn)行綜述?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】匯總和對(duì)比分析國(guó)內(nèi)外的相關(guān)文獻(xiàn)，分析不同抗性基因在水稻抗稻瘟病中的應(yīng)用研究進(jìn)展，綜述水稻抗稻瘟病基因的研究現(xiàn)狀及前人利用抗稻瘟病基因進(jìn)行抗性育種的最新研究結(jié)果，分析已克隆抗稻瘟病基因在水稻抗性育種應(yīng)用中存在的問(wèn)題及前景，為現(xiàn)階段的抗稻瘟病育種研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

查閱國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)以及國(guó)家水稻數(shù)據(jù)中心，收集與水稻稻瘟病抗性基因有關(guān)的研究報(bào)道。

1.2 方 法

整理匯總，從水稻稻瘟病抗性的機(jī)理，抗性基因的定位、克隆，以及抗性基因在抗性育種中的應(yīng)用的研究近況進(jìn)行綜述。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻稻瘟病抗性機(jī)理的研究與應(yīng)用

2.1.1 基因?qū)蚣僬f(shuō)

基因?qū)蚣僬f(shuō)(gene for gene hypothesis)最早是由Flor在研究亞麻與銹病之間的互作時(shí)提出的假說(shuō)[5]。后來(lái)Jia等[6]在水稻抗病基因與稻瘟病菌無(wú)毒基因互作中也發(fā)現(xiàn)了該假說(shuō)，揭示了水稻和稻瘟病菌之間特性識(shí)別和互作關(guān)系。該假說(shuō)認(rèn)為，寄主本身具有抗病基因(R)和感病基因(S)，病原菌本身具有無(wú)毒基因(AVR)和有毒基因(VIR)。當(dāng)攜帶有毒基因的病原菌侵入含有感病基因或不含有抗病基因的寄主時(shí)，寄主會(huì)感病，這種感病反應(yīng)稱(chēng)為親和反應(yīng)。相反，當(dāng)攜帶無(wú)毒基因的病原菌侵入含有抗病基因的寄主時(shí)，寄主會(huì)抗病，這種抗病反應(yīng)稱(chēng)為不親和反應(yīng)。這種親和和不親和性主要取決于寄主與病原菌之間有無(wú)親和互作關(guān)系。例如，Pi-ta與AVR-Pita互作是第一對(duì)被鑒定的水稻R蛋白與稻瘟病菌無(wú)毒蛋白AVR間的互作對(duì)，Pi-ta編碼產(chǎn)物的蛋白類(lèi)型為NBS-LRR,其LRR結(jié)構(gòu)域能與無(wú)毒蛋白AVR-Pita在酵母細(xì)胞中直接互作[7]。

2.1.2 防衛(wèi)假說(shuō)

防衛(wèi)假說(shuō)是由Vander和Jones對(duì)基因和基因假說(shuō)的繼承和發(fā)展[8]。在基因和基因假說(shuō)中認(rèn)為，R基因編碼的R蛋白和病原菌無(wú)毒基因編碼的Avr蛋白之間發(fā)生相互作用。但在該假說(shuō)中認(rèn)為，寄主體內(nèi)存在一個(gè)可以讓病原菌和寄主互相識(shí)別的蛋白，這種蛋白會(huì)先與病原菌的毒性Avr蛋白結(jié)合，然后吸引寄主內(nèi)相對(duì)應(yīng)的R蛋白，R蛋白與Avr蛋白相互識(shí)別并形成一種能識(shí)別信號(hào)的特殊結(jié)構(gòu)，最后誘導(dǎo)防衛(wèi)基因的表達(dá)。在擬南芥的RIN4蛋白參與的丁香假單胞菌抗性反應(yīng)中就對(duì)這種假說(shuō)有直接的證據(jù)，RIN4蛋白會(huì)分別與NBS-LRR抗性蛋白R(shí)PM1和RPS2形成獨(dú)特的復(fù)合體，啟動(dòng)一系列信號(hào)的反應(yīng)，參與其免疫反應(yīng)[9]。在正常情況下，1對(duì)Pik-h抗病蛋白是處在非激活狀態(tài)下的，但當(dāng)病原菌侵入后，寄主植物的防御系統(tǒng)就會(huì)被打破，這時(shí)的識(shí)別效應(yīng)子Avr-Pik-h的抗性蛋白Pikh-1就會(huì)通過(guò)改變構(gòu)象激活抗病蛋白Pikh-2，由Pikh-2傳遞相關(guān)的信號(hào)來(lái)激發(fā)防御反應(yīng)[10]。

2.1.3 水稻稻瘟病抗性基因

水稻的抗性基因有2類(lèi)，分別為主效抗性基因和微效抗性基因[11]?？沟疚敛』虻目剐苑譃?種，1種是垂直抗性和水平抗性[12]，垂直抗性也叫完全抗性，一般由1～2個(gè)主效抗性基因控制，但少數(shù)的主效基因是由隱性基因或不完全顯性基因控制，屬于質(zhì)量性狀；帶有這類(lèi)抗性基因的水稻和病原菌之間有不親和的互作方式，菌株的專(zhuān)化性強(qiáng)，寄主會(huì)隨著菌株的變異而喪失抗性。例如，地谷的主效抗稻瘟病基因Pid3對(duì)我國(guó)稻瘟病生理小種Zhong-10-8-14表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性[13]。另一種是水平抗性也叫部分抗性，一般由多個(gè)微效抗病基因共同控制水稻對(duì)稻瘟病的抗病性，屬于數(shù)量性狀；帶有這類(lèi)抗性基因的水稻和病原菌之間有親和的互作方式，對(duì)不同的稻瘟病生理小種都表現(xiàn)出抗性，使菌株的專(zhuān)化性變?nèi)?，使水稻具有持久的抗性。例如，Pb1是在秈稻品種mudan中克隆得到，但該基因只在水稻成熟階段表現(xiàn)出較有效的抗性，尤其是對(duì)水稻的穗頸瘟[14]。

2.2 水稻稻瘟病抗性基因的定位

Sasaki通過(guò)人工接種的方法，確定了日本水稻品種中有1個(gè)顯性抗病基因[15]。1965年，Goto Yamasaki對(duì)稻瘟病進(jìn)行了系統(tǒng)性的分類(lèi)研究。1966年，Kiyosawa等定位到了第一個(gè)抗性基因pia[16]；到1981年，他再次定位到了8個(gè)位點(diǎn)上的14個(gè)稻瘟病主效顯性基因，分別為pik位點(diǎn)上的pikh、pikm、pikp、piks；pita位點(diǎn)上的pita、pita2；pikz位點(diǎn)上的pikz、pizt以及pia、pish、pib等[17]。1991年，Yu等在12號(hào)染色體上定位到了pi-6(t) 基因，還有pi-1(t)、pi-2(t)、pi-4(t) 等基因[18]。1994年，Mew等在Yu的基礎(chǔ)上對(duì)這3個(gè)基因進(jìn)行了更加精密的定位[19]。同年，Wang等[20]定位到了2個(gè)抗性基因，分別為pi-5(t)和pi-7(t) 。而中國(guó)對(duì)稻瘟病抗性的研究較晚，在1976～1979年才完成了全國(guó)稻瘟病生理小種的鑒定，為稻瘟病的研究奠定了基礎(chǔ)[21]。1994年，朱立煌等[22]在8號(hào)染色體上定位到了pi-zh，這也是第1次在8號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)抗病基因。之后又在8號(hào)染色體上定位到了pi33、pi-11、pi-GD-1基因，在11號(hào)、6號(hào)、12號(hào)染色體上定位到了pi-1、pi-2、pi-4等基因，其中pi-1是第一個(gè)定位在11號(hào)染色體上的基因。2001年，朱獻(xiàn)豐等[23]在12號(hào)染色體上定位到了pi6基因。2002年，吳金紅等[24]在Mew的基礎(chǔ)上對(duì)pi-z(t) 進(jìn)行了精確定位。2003年，Berryer等定位到了位于8號(hào)染色體上的pi-33(t) 基因[25]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，已有大約100個(gè)抗性基因被鑒定出和500個(gè)抗病基因相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)[3]。表1(http://archive.gramene.org)

表1 已鑒定的稻瘟病抗性基因Table 1 Rice blast resistance genes identified

2.3 水稻稻瘟病抗性基因的克隆

通過(guò)使用圖位克隆法，在水稻基因組中被鑒定和定位的基因中，已有37個(gè)基因被成功克隆[4]。其中Pita和pib是最早被克隆出來(lái)的基因[26,27]，而pib是第一個(gè)克隆出來(lái)的主效抗瘟基因，它位于2號(hào)染色體上[27]。Pi9是第一個(gè)廣譜抗瘟基因被克隆出來(lái)[28]。Pi21是第一個(gè)被克隆出來(lái)的部分抗性基因[29]。Bsr-d1是近期克隆的部分抗性基因，是從廣譜持久抗病的材料地谷中發(fā)現(xiàn)的[30]。Zhao等[31]鑒定出了一個(gè)結(jié)構(gòu)新穎的廣譜抗病基因ptr，ptr的廣譜抗性不依賴(lài)pi-ta，但pi-ta的廣譜抗性依賴(lài)ptr。這些基因不均勻的分布在各條染色體上，其中11號(hào)和6號(hào)占多數(shù)，分別占35.13%和24.32%。而5號(hào)、7號(hào)、10號(hào)染色體上暫時(shí)沒(méi)有克隆出有關(guān)基因。已克隆的稻瘟病抗性基因中有33個(gè)屬于NBS-LRR蛋白類(lèi)型，其中，pi-b屬于典型的NBS-LRR類(lèi)抗性基因，編碼產(chǎn)物為細(xì)胞質(zhì)蛋白；Bsrd-1基因編碼的蛋白類(lèi)型為MYB轉(zhuǎn)錄因子；Pi-21基因編碼的蛋白類(lèi)型為富含脯氨酸蛋白；Pid-2基因編碼的蛋白類(lèi)型為類(lèi)受體激酶蛋白；ptr基因編碼的蛋白類(lèi)型為膜蛋白。其中19個(gè)基因具有葉瘟抗性，pi-25基因?qū)θ~瘟和穗頸瘟都具有抗性；pi-63和pid-3對(duì)整個(gè)時(shí)期的稻瘟病都具有抗性，占已克隆的稻瘟病抗性基因的5.4%；pb1在水稻成熟階段具有較有效的抗性，對(duì)穗頸瘟具有很好的抗性。表2

表2 已克隆的稻瘟病抗性基因Table 2 Cloned blast resistance genes in rice

2.4 水稻稻瘟病抗性基因在育種中的應(yīng)用

2.4.1 常規(guī)育種

常規(guī)育種的方法是通過(guò)有性雜交，利用田間農(nóng)藝性狀選擇和抗性鑒定相結(jié)合，將抗病基因?qū)肽繕?biāo)株系育成抗病品種。常規(guī)育種從選擇親本開(kāi)始，利用單交、復(fù)交、回交的手段，將抗稻瘟病基因重組到一個(gè)新的品種中去。例如，可以選用品質(zhì)優(yōu)、產(chǎn)量高但不抗病的品種和抗病但不具有此優(yōu)點(diǎn)的品種作為親本，來(lái)選育新的抗病優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)品種。在抗病育種中，導(dǎo)入的抗病基因的遺傳傳遞能力要強(qiáng)、抗譜性要廣，導(dǎo)入的抗源材料親和力要強(qiáng)，這樣才能容易有效的把抗病基因?qū)胄碌钠贩N中。目前，常規(guī)育種仍然是水稻抗稻瘟病育種中比較有效的方法。但此方法是通過(guò)田間抗性鑒定為依據(jù)，田間不同的抗性基因會(huì)出現(xiàn)交叉相掩蓋現(xiàn)象，只能選擇1個(gè)或2個(gè)抗性基因，不利于多基因聚合的選擇，很難實(shí)現(xiàn)選育的新品種具有廣譜抗性和持久抗性。

2.4.2 分子標(biāo)記輔助選擇育種

分子標(biāo)記輔助選擇(molecular marker-assisted selection, MAS)是將分子標(biāo)記應(yīng)用于作物育種中的一種選擇輔助手段。該方法是利用與目的基因緊密連鎖或基因本身的分子標(biāo)記來(lái)選擇基因型，在分子水平上確定材料的基因型，同時(shí)還可以對(duì)全基因組進(jìn)行篩選，來(lái)減少連鎖累贅。此方法不受環(huán)境和稻瘟病病菌生理小種的影響，可以有效的提高育種的效率和準(zhǔn)確性，還可以在短時(shí)間內(nèi)選育出具有持久抗性的水稻品種。近年來(lái)，研究者利用此方法開(kāi)展了稻瘟病抗性育種，并且取得了實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展。

分子標(biāo)記輔助育種的前提是利用分子標(biāo)記對(duì)稻瘟病基因型進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)品種的抗性進(jìn)行針對(duì)性的改良。最初是通過(guò)回交的方法，將供體中的目的基因滲入到受體中，但隨著目的基因的滲入，與目的基因連鎖的其它基因也會(huì)滲入到受體中，形成“連鎖累贅”。分子標(biāo)記輔助選擇必須應(yīng)用與抗稻瘟病基因緊密連鎖的標(biāo)記，可以在目的基因附近發(fā)生重組個(gè)體，比較理想的是標(biāo)記離目的基因5cM，這樣選擇到的目的基因植株的正確率在99.75%以上[60]。李仕貴等[61]應(yīng)用與稻瘟病抗性基因pi-d(t) 緊密連鎖的微衛(wèi)星標(biāo)記RM262對(duì)含有該抗病基因的品種地谷與感病品種江南香糯8987的F2群體進(jìn)行MAS選擇，結(jié)果表明，應(yīng)用該標(biāo)記的抗性重合和雜合帶型選擇抗性植株的準(zhǔn)確率在98%以上。文紹山等[62]利用與抗稻瘟病基因pi-9(t) 緊密連鎖的分子標(biāo)記pB8對(duì)育種后代進(jìn)行檢測(cè)，篩選到攜帶有pi-9(t) 基因的恢復(fù)系新株系。

分子標(biāo)記輔助選擇在基因聚合育種方面也有著廣泛的應(yīng)用，在基因聚合育種中，應(yīng)用目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，即將多個(gè)不同抗性基因聚合到1個(gè)新的品種中，這樣可以打破回交育種中只能改良個(gè)別性狀的局限性，可以使品種的多個(gè)性狀得到改良，提高育種的效率，縮短育種周期，得到更有價(jià)值的育種材料，并且可以有效的克服病原菌的變異。Hittalmani等利用MAS選擇將分別含有抗稻瘟病基因pi-l、pi-5、pi-ta聚合到同一品系BL24中，得到改良單株，其抗性比含有單個(gè)抗病基因的單株要強(qiáng)[63]。董巍等[64]通過(guò)MAS選擇的方法將稻瘟病抗病基因pi-1、pi-2回交聚合到培矮64S中，篩選到10株對(duì)稻瘟病抗病明顯增強(qiáng)的改良株系。

2.4.3 基因工程育種

基因工程育種是水稻稻瘟病抗性育種中最直接的方法之一，它是以抗性基因克隆為基礎(chǔ)，將克隆后的抗性基因經(jīng)過(guò)剪切和拼接加工后，借助載體導(dǎo)入受體細(xì)胞中，使抗性基因融合與受體細(xì)胞中，受體細(xì)胞表達(dá)抗性，受體材料就會(huì)對(duì)稻瘟病具有抗性[65]。基因工程育種也可以將水稻基因庫(kù)中不具有的各種抗性相關(guān)基因轉(zhuǎn)入水稻中，拓寬抗病基因的來(lái)源，培育出新的抗病材料，為抗病育種提供新途徑[66]。潘素君等[67]通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將廣譜抗稻瘟病基因Pi-9轉(zhuǎn)入5個(gè)秈稻品種，接種鑒定表明，轉(zhuǎn)基因植株具有很強(qiáng)的稻瘟病抗性。以抗稻瘟病的粳稻中花9號(hào)轉(zhuǎn)溶菌酶基因材料 D2-1-2 與秈型雜交稻兩優(yōu)培9的恢復(fù)系 9311 及不育系培矮64S、汕優(yōu) 63 的恢復(fù)系明恢 63 分別雜交和多代回交，進(jìn)行外源溶菌酶基因的轉(zhuǎn)育。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)育后代抗性與輪回親本相比、測(cè)交組合抗性與對(duì)應(yīng)雜交稻組合相比都有了較大提高。隨著轉(zhuǎn)育回交世代的增加，抗性增強(qiáng)得越明顯[68]。但此方法對(duì)實(shí)驗(yàn)室的要求和對(duì)操作者的技術(shù)要求比較高，成本也較高，在實(shí)際生產(chǎn)中較難普及。

3 討 論

3.1 目前水稻稻瘟病抗性育種的研究大多數(shù)還停留在傳統(tǒng)的育種研究。這種育種方法不僅耗時(shí)長(zhǎng)還費(fèi)人費(fèi)力。傳統(tǒng)育種出的新品種存在單一性，但病原菌變化多樣，環(huán)境條件變化多端，新品種不能有長(zhǎng)期的抗性效果，要不斷的培育新的抗病新品種；在常規(guī)雜交育種中，對(duì)于多個(gè)抗性基因聚合時(shí)，由于不同的抗性基因間存在抗譜的交叉重疊，在后代中出現(xiàn)大量的假陽(yáng)性現(xiàn)象，降低了選擇的目標(biāo)性和準(zhǔn)確性。分子標(biāo)記輔助選擇育種、基因工程育種可以有效的提高抗性基因的準(zhǔn)確性，但這些方法成本高、不利于規(guī)?；瘷z測(cè)，應(yīng)該加強(qiáng)與抗性基因緊密連鎖或分離的操作簡(jiǎn)便、成本低、方便規(guī)?；瘷z測(cè)的分子標(biāo)記。

3.2 有些抗病品種在當(dāng)?shù)乇憩F(xiàn)為抗病，但在其它地方抗病性卻表現(xiàn)較差，這是由于可能某些抗病基因受到環(huán)境條件和病原菌變化的影響，導(dǎo)致其抗病性不能順利表達(dá)有關(guān)。這就需要育種工作者對(duì)稻瘟病病原菌與水稻寄主之間的相互關(guān)系進(jìn)行深入的研究，以便解決水稻的廣譜持久抗性問(wèn)題。

3.3 在水稻抗稻瘟病育種中，一般攜帶抗病基因的品種，其農(nóng)藝性狀表現(xiàn)較差，會(huì)出現(xiàn)分蘗少、產(chǎn)量低、晚熟等癥狀，這是由于受基因連鎖等因素的影響，所以打破這種不良連鎖將推動(dòng)水稻抗病害育種產(chǎn)生質(zhì)的突破。

3.4 雖然已經(jīng)有很多抗稻瘟病基因被定位、克隆，并且在育種中表現(xiàn)出來(lái)了一定的抗性，但對(duì)大多數(shù)基因的抗性、廣譜性和持久性以及生態(tài)適應(yīng)區(qū)還不清楚，有些抗病基因還未標(biāo)記到。因此，還需要對(duì)抗性資源進(jìn)行系統(tǒng)的研究，繼而通過(guò)分子標(biāo)記遺傳改良水稻的稻瘟病抗性，加速水稻抗病分子育種進(jìn)程。

抗稻瘟病基因在水稻育種應(yīng)用上，抗性基因可操作性強(qiáng)、效果明顯，但這些基因在生產(chǎn)中的分布及利用情況尚不清楚。比如，Piz和Pik是水稻中目前報(bào)道含有廣譜高抗稻瘟病最多的2個(gè)位點(diǎn)，它們分別包含pi2、pi9、pizt和pi1、pikh、pikm等復(fù)位基因[69-71]。另外，pita和pib對(duì)我國(guó)很多稻區(qū)也表現(xiàn)出很高水平的抗性[72-73]。但這些位點(diǎn)或基因的分布及利用上還缺乏完善的研究，限制了它們?cè)谟N中的應(yīng)用。

4 結(jié) 論

已有大約100個(gè)抗性基因被鑒定出和500個(gè)抗病基因相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)；在水稻基因組中被鑒定和定位的基因中，已有37個(gè)基因被成功克??；在不同的育種方法中，基因工程育種是水稻稻瘟病抗性育種中最直接的方法。水稻稻瘟病抗性基因的鑒定是抗性育種的基礎(chǔ)，抗性基因的充分利用有利于快速有效的選育出新的具有廣譜和持久抗性的抗病品種。