李 寧，王 娟，王柏柯，戴 麒，黃少勇，帕提古麗，高 杰，余慶輝

(1.新疆農業(yè)科學院園藝作物研究所，烏魯木齊 830091；2.新疆農業(yè)大學林學與園藝學院，烏魯木齊 830042)

0 引 言

【研究意義】植物在生長發(fā)育和逆境響應過程中，伴隨著基因表達在轉錄水平、轉錄后水平和翻譯后水平通過不同的機制進行調節(jié)。近年來，在轉錄水平上的基因調控得到了很好的研究，植物microRNAs引起廣泛關注[1]。番茄miRNAs在生長發(fā)育及響應逆境的研究，有助于進一步解析番茄在不同逆境脅迫下基因表達的調控機制，為番茄育種提供新的基因資源，奠定更為完善的理論基礎。為尋求番茄品質和產量之間最佳平衡，將來研究應重點圍繞miRNAs及其靶基因對番茄的調控機制，盡早明確調控抗逆和發(fā)育的相關靶基因，并進行克隆功能驗證，定向改變番茄果實品質及生長周期，為番茄耐逆高產新品種的分子育種和品種改良提供新方案?！厩叭搜芯窟M展】miRNAs(microRNAs)是一類在植物和動物基因組中自然發(fā)生、高度保守且短小的非編碼RNA分子。植物miRNAs是一類長度為20～24 nt的內源性非編碼小RNA[2]，通過對靶基因(mRNA)的降解或抑制其翻譯，在轉錄后水平介導基因的表達，參與包括生長發(fā)育、轉座子沉默、信號轉導、對脅迫應激反應等生物學過程的調控[3]。番茄(Solanumlycopersicum)不僅是研究肉質果實成熟的模式植物，又是我國重要的出口優(yōu)勢農產品之一[4]，位居蔬菜單項產品出口第2位，僅番茄醬年均出口量約占世界貿易量的1/3[5]。研究影響番茄在生長發(fā)育過程中不同的逆境脅迫，對提升番茄風味和品質有重要意義?！颈狙芯壳腥朦c】當前，隨著研究的不斷深入，檢索總結國內外相關miRNAs起源、作用機制，調控番茄生長發(fā)育及響應生物脅迫和非生物脅迫的研究進展[6]。【擬解決的關鍵問題】采集相關文獻、官網等資料，包括miRNAs的合成、作用機制及相關網站，分析番茄miRNAs在生長發(fā)育及響應脅迫過程中的功能，對加快番茄品種的分子育種和改良奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

收集查閱國內外文獻資料、相關網站和番茄轉錄組的前沿研究進展。

1.2 方 法

整理匯總并對比分析番茄miRNAs研究數據。

2 結果與分析

2.1 miRNA的合成及作用機制

2.1.1 植物miRNA的合成

miRNA通常位于基因區(qū)間，但也會位于基因內含子的正義或反義鏈上。在細胞核中由RNA聚合酶II(Pol-II)轉錄，初級轉錄為具有“7-甲基鳥嘌呤核苷酸”帽子(m7GpppN)和多聚腺苷酸尾巴的pri-miRNA[7-8]。隨后Dicer同源物DCL1(DICER-LIKE酶)對其實施2次切割，先后生成具有莖環(huán)結構的pre-miRNA以及miRNA/雙體結構，隨后miRNA/miRNA*(miRNA*為miRNA的互補序列)的3’末端會被甲基轉移酶HEN1(HUAenhancer1)進行甲基化[9-10]。Pre-miRNA在HASTY(Exportin 5在植物中的同源蛋白)的協助下從核內轉運到細胞質中[11]。

在細胞質中，雙鏈復合物中miRNA與AGO(Argonaute)蛋白質結合成RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，進而指導AGO對互補靶基因的mRNA進行切割，從而抑制靶基因的表達[12-13]。RISC加載后，miRNA/miRNA*雙螺旋主要由AGO蛋白解旋[14]。雙鏈中miRNA*直接脫離被迅速降解，另一條成熟的單鏈miRNA保留在這一復合體中，并結合到與其互補的mRNA的位點通過堿基配對調控基因表達[15]。

2.1.2 植物miRNA的作用機制

miRNA對基因的調控是通過構成RISC來進行的，RISC是其調控的物質基礎，AGO蛋白是RISC復合體中的核心蛋白。miRNA-RISC識別mRNA，通過靶標切割或翻譯抑制，負調控靶基因的表達，miRNA-RISC對靶基因mRNA的作用主要取決于它與靶基因轉錄體序列互補的程度[15]。在植物中最為常見的方式是假設miRNA與靶基因mRNA的結合位點完全互補，將會引起目的基因mRNA在互補區(qū)的特異性斷裂，最終導致基因沉默[16]。其作用方式是通過miRNAs的5’端殘基識別并和靶基因mRNA的開放讀碼框(open reading frame，ORF)互補配對切割，主要在mRNA的第10/11個堿基間進行切割，通過細胞質降解因子(XRN4)催化降解，最終使靶向mRNA無法翻譯[17]。

第2種是抑制靶基因翻譯，當成熟miRNA與靶基因mRNA的3’端非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)不完全互補配對，進而mRNA的翻譯受到抑制，但不影響mRNA的穩(wěn)定性和轉錄，miRNA將通過翻譯抑制的方式來調控靶基因；并且對靶基因翻譯的抑制可能需要多種miRNA分子的協同作用，miRNAs與靶基因存在著反饋抑制調節(jié)途徑[18-19]。

2.1.3 miRNAs數據庫

目前miRNAs的數據庫日漸豐富，高通量測序的出現有助于植物miRNAs的數量呈指數增長，不僅可以識別大量miRNAs，而且通過生物信息學和試驗結果相結合為預測鑒定植物miRNAs功能注釋提供大量可靠數據[16，20]。PMTED是1個植物特異性miRNA數據庫，通過在大量現有微陣列數據中推斷miRNAs的靶基因表達譜，從而研究miRNAs功能。PMRD數據庫包含了來自120種模式植物以及主要農作物的8 400多個miRNAs條目，包括擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、小麥(Triticumaestivum)、大豆(Glycienemax)和玉米(Zeamays)等幾百種植物的miRNA，參與調控植物生長發(fā)育和脅迫響應等生物學過程[21]。表1

表1 部分植物相關miRNAs計算工具和數據庫Table 1 Computational tools and databases of some plant-related microRNAs

2.2 miRNAs在番茄生長發(fā)育的作用

miRNA在番茄生長發(fā)育中起到重要作用，當番茄過表達miR171時，通過抑制靶基因GRAS基因家族(SLGRAS24)，導致番茄植株變大。缺氧處理后，野生番茄的形態(tài)學發(fā)生改變推測是生長素穩(wěn)態(tài)相關的miR159、miR171和miR396表達差異所導致[22]。番茄miR167在調節(jié)生長素信號傳導中的具有進化保守作用，其上調表達導致靶基因生長素響應因子(auxin response factor，ARF6/8)的表達下降，從而影響生長素信號通路[23]。番茄通過SlARF10調節(jié)氣孔孔徑來減少水分損失，維持葉片水分平衡，Sl-miR160通過對SlARF10的轉錄后調控，增加了脫落酸(abscisic acid，ABA)合成信號響應，從而保證植物正常發(fā)育和環(huán)境適應[24]。

番茄花梗脫落過程中，乙烯能夠影響miRNA的表達和調控，最終促進花梗脫落。在脫落過程中，乙烯可以介導miR160和miR167的表達，二者是生長素信號的重要介質。進一步研究發(fā)現，miR172在花梗脫落過程中表達顯著升高，靶基因APETALA2乙烯響應轉錄因子(AP2c)上調，而乙烯負調控miR172的表達[25]。番茄7B-1是一種光周期敏感的雄性不育突變體，赤霉素信號轉導途徑MYB轉錄因子(gibberellin- and abscisic acid-regulated MYB，GAMYB1)的表達與7B-1花藥發(fā)育和莖中的miR159水平呈負相關，miR396在7B-1花藥和莖中促進胱抑素(cystatin)的分裂，miR159-GAMYB1和miR396-cystatin級聯反應與7B-1的小孢子和花藥發(fā)育調控密切相關[26]。miRNA159/GAMYB1/2對番茄胚珠發(fā)育和果實發(fā)育至關重要。過表達SlmiR159的番茄，其植株表現果實早熟與單性結實，但果實形狀未發(fā)生改變。此外，在轉基因株系中SlGAMYB1/2能夠導致與胚珠、雌配子體發(fā)育和生長素信號傳導相關通路的錯誤調節(jié)[27]。

在番茄gib-3突變體中，miRNA160、miRNA167及其靶點可能參與頂端分生組織的細胞分裂，miRNA調控的SlARF6、SlARF8、SlARF10和SlARF16的表達與果皮細胞層發(fā)育呈負相關，由此推論ARFs表達水平的升高可能是生殖細胞分裂終止的主要因素[28]。在番茄生長過程中，過表達miR164能夠影響番茄植株形態(tài)及果實單個發(fā)育階段的必需時間。將來miR164可用于改善重要品種的農藝性狀[29]。番茄Sly-miR1917通過調節(jié)特異性轉運蛋白(SlCTR4)剪接變異體SlCTR4sv(乙烯信號的負調節(jié)器)的表達參與植物乙烯反應，過表達Sly-miR1917增強了乙烯生物合成和信號轉導相關基因的上調，并加快花梗脫落和果實成熟[30]，與miR172促進花梗脫落功能相似。乙烯參與了番茄果實發(fā)育和成熟過程中miRNA積累調控。Sly-miR157在正常番茄果實和果實無色不成熟突變體(Colourless non-ripening，Cnr)中調節(jié)關鍵成熟基因SQUAMOSA啟動子結合蛋白(SQUAMOSA promoter-bindinglike，SPL)LeSPL-CNR的表達。LeSPL-CNR可能影響LeMADS-RIN、LeHB1、SlAP2a和SlTAGL1的表達，在番茄果實成熟過程中，Sly-miR156不影響果實成熟，SlymiR157和SlymiR156形成一種附加關鍵調控層，影響紅熟期果實的軟化[31]。RIN通過結合其啟動子區(qū)域直接抑制miR172a轉錄，并影響miR172的積累[32]。

2.3 miRNAs對逆境脅迫的響應

2.3.1 miRNAs與干旱脅迫

干旱是制約全球農業(yè)生產的主要因素，據估計每年全球一半農作物受干旱脅迫，超過其他逆境脅迫造成損失的總和[33]。眾所周知對植物耐旱性的基礎研究已經確定了許多干旱脅迫相關的抗性基因，過表達這些脅迫響應基因能夠提高植物的應激耐受性。然而除了蛋白質編碼基因外，植物中的miRNAs在應激條件下的表達也發(fā)生了變化，研究表明miRNAs介導的植物脅迫響應是通過調控靶基因來實現的，值得注意的是，越來越多的研究表明，miRNAs在植物耐旱性和抗旱性方面發(fā)揮著關鍵作用。然而，關于干旱脅迫下番茄中miRNAs及其靶點的信息仍然非常有限[34]。

Liu等發(fā)現野生番茄潘那利漸滲系IL9-1在干旱脅迫下，sly-miR6024、sly-miR1009和其對應靶基因(solyc06g72130、solyc12g099800)顯著上調，一些保守的miRNAs在番茄中也首次被鑒定為對干旱有反應，如sly-miR1919、sly-miR5300和sly-miR9477。[35]。此外，miR156、miR169、miR172和miR319在擬南芥、水稻和小麥中受到干旱脅迫的誘導，表達水平發(fā)生了顯著變化，而且這些miRNAs在番茄中同樣受干旱脅迫誘導表達[36]。野生番茄潘那利漸滲系IL2-5在干旱處理后，sly-miR166c-5p和sly-miR-429表達明顯下調，相應的靶基因solyc03g02340和solyc01g08980在應激后表達顯著升高。番茄漸滲系IL2-5干旱脅迫后，Sly-miR716下調表達，其靶基為膜聯蛋白(Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，Annexin V)，該蛋白在植物抗逆境和發(fā)育中起著重要作用[37]。

miR165、miR166、miR398、miR9472、miR9476和miR9552都是參與番茄響應干旱脅迫的關鍵性miRNA。其中miR9552表現出對干旱、組織和基因型特異性，sly-miR9552a-3p僅在敏感基因型番茄根部表達。miR9552的靶基因是UDP葡萄糖基轉移酶(UGT)，抑制其表達將會增加根中UGT水平，從而降低敏感基因型的抗旱性[38]。

過表達miR1916的轉基因番茄植株對干旱響應敏感，是通過降低滲透調節(jié)和活性氧清除的途徑進行調控。miR1916的潛在靶基因是編碼富含羥脯氨酸糖蛋白家族蛋白的SGN-U376418 mRNAs。與野生型相比，葉綠素含量的增加有助于增強miR1916轉基因植物的耐旱性。miR1916在不同干旱脅迫時期的表達水平可能不同，是番茄抗旱性的負調節(jié)因子，對茄科植物的非生物脅迫反應具有潛在的影響[39]。

2.3.2 miRNAs與鹽脅迫

土壤鹽堿是限制作物生產的主要環(huán)境因素之一。目前轉基因耐鹽植物表現不理想，主要是復雜的遺傳機制導致[34]。目前，非編碼RNA中如miRNAs正迅速成為解碼植物應激反應轉錄和轉錄后對基因調控的有效平臺。響應鹽脅迫植物miRNAs不斷地被發(fā)現，其作用于靶基因并通過調控植物的生長發(fā)育等生物功能抵御外界鹽脅迫危害[40]。

在醋栗番茄受鹽脅迫誘導后發(fā)現3種新型miRNAs(sly-miRn7c-2、sly-miRn86a-1和sly-miRn97a)，但在鹽處理的栽培番茄M82中受到抑制表達。sly-miR160a、sly-miR166b、sly-miR166c-5p、sly-miR169a和sly-miR9470-5p是野生醋栗番茄特有的耐鹽相關miRNAs，sly-miR482e-5p潛在的靶基因編碼應激相關的GRAS轉錄因子、CBF轉錄因子、F-box，推測sly-miR482e-5p在番茄耐鹽性中起關鍵作用。參與醋栗番茄耐鹽過程的sly-miRn50a，其靶基因參與角質層、亞嘌呤和蠟質層的生物合成，這種途徑可以通過減少蒸發(fā)來提高植物對鹽和干旱脅迫的適應性[41]。

2.3.3 miRNAs與溫度脅迫

隨著全球氣候變化，高溫正在成為限制番茄產量的一個日益嚴重的因素。營養(yǎng)期和生殖期受到熱脅迫的不利影響，從而導致產量和果實品質下降。與營養(yǎng)生長相比，高溫脅迫對番茄生殖生長的影響更大，番茄耐熱性基因型間存在廣泛的變異性。而低溫通過使細胞內水的結晶導致細胞和組織脫水，從而影響植物生長發(fā)育[6]。

在番茄生長發(fā)育和逆境脅迫中，成熟的miR167a與前體miR167a的表達模式呈現出相反模式[42]。在高溫條件下，番茄植株通常表現出柱頭外露的表型，嚴重阻礙番茄自花授粉和結實，miR398b-3p/SLCSD1、miR393-5p/SLTIR1、miR160a/SLRF10/16、miR156e-5p/SLSPL15和miR397-5p/LACs這些級聯反應參與響應熱激應答調控，例如雌雄蕊的代謝途徑。生長素信號介導的miR393-5p/SLTIR1和miR160a/SLARF10/16級聯反應被高溫處理后激活，調控雄蕊發(fā)育[43]。

野生番茄醋栗在低溫和中溫中均能誘導miR156和miR396的表達，并抑制miR168在番茄植株中的表達。耐熱醋栗番茄中調節(jié)碳固定的基因相關miRNA有助于維持高溫下葉片的正常生理活動，從而增強耐熱性。在高溫脅迫下，spi-miR6300_gma，其靶基因為熱激蛋白(heat-shock proteins，hsp70)，而spi-miR166c-3p和spi-miR166g-3p_osa的靶基因為hsp60-3A，這些miRNAs可以通過調節(jié)熱休克蛋白在植物對高溫反應中發(fā)揮重要作用[44]。

可變剪接和miRNA差異表達是導致野生多毛番茄和栽培番茄品種間耐寒性差異的重要原因。miR159、miR319潛在靶基因均為MYB65，miR6022靶基因是擬南芥同源盒亮氨酸拉鏈蛋白(Arabidopsis thaliana Homeobox-leucine zipper protein，ATHB13)，這3個非生物應激級聯在低溫應激反應中發(fā)揮重要作用。野生多毛番茄MiR319家族成員的表達與番茄的耐冷性呈正相關[45]。在熱應激的初始階段，miR319a、miR319b和miR319d對TCP3、TCP29和TCP2有調節(jié)作用，miR319a和miR319b啟動子區(qū)發(fā)現了參與類黃酮生物合成基因調控的MYB結合位點MBSI，這表明miR319與TCP3和TCP29參與了由活性氧(ROS)和Ca2+信號傳導和花青素合成引起的溫度應激調節(jié)反應[46]。在冷脅迫或熱脅迫下，過表達sha-miR319d野生多毛番茄植株抵抗應激能力明顯增強，并且超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的活性升高，表明sha-miR319d可能通過抑制GAMYB-like1的表達來調節(jié)番茄的耐冷性，并進一步增強抗寒、耐熱和ROS信號轉導[47]。

2.3.4 miRNAs對生物脅迫的響應

隨著番茄疫霉對番茄生產的威脅越來越大，解析番茄疫霉抗性機制日益迫切。植物具有一系列特定的抗病原體(R)基因，miR482/2118能夠調節(jié)R基因的表達，即含有富氨酸重復區(qū)和核苷酸結合位點(NBS-LRRS)。在番茄感染疫霉病初期和后期由營養(yǎng)生長向生殖生長轉變過程中，成熟Sly-miR482/2118及其靶基因的共調節(jié)作用最強并具有時間依賴性[48]。通過短串聯靶標模擬技術(STTM)沉默miR482b，隨著miR482b含量降低，植株對侵染疫霉病的抗性顯著增強，miR482b的RNAi植株中，NBS-LRR的表達增強使番茄對疫霉病的抗性增強，表明了miR482b-NBS-LRR是番茄-感染疫霉病相互作用網絡中的一個重要組成部分[49]。

過表達Sly-miR1916的番茄植株對疫霉病和灰霉病感染的敏感性顯著增強?？赡芡ㄟ^調節(jié)α-托馬汀和花青素來調節(jié)番茄植株中STR-2、UGT和MYB12的表達，從而增強對生物脅迫的敏感性[50]。miR172家族通過調節(jié)AP2/ERF轉錄因子的表達參與逆境脅迫。過表達miR172a的轉基因番茄中具有更大的抵抗感染性，miR172-AP2/ERF級聯可以調節(jié)抗氧化劑，減少ROS的積累，防止感染后細胞膜損傷[51]。過表達pi-miR1918的番茄植株在感染疫霉病后表現出更嚴重的疾病癥狀，其靶基因sly-TG2的表達與miR1918的表達呈負相關，表明可能參與了靶基因的沉默，從而增強番茄對疫霉病的易感性[52]。

番茄枯萎病(Fusariumoxysporumf.sp.lycopersici，FOL)是一種危害番茄的全球性病害。番茄根在FOL感染下，sly-miR160a和new_mir_762靶向基因分別是生長素反應因子(Auxin response factors 10B、16A、16B、17、10A)和生長素調節(jié)的IAA(Auxin-regulated IAA7)，生長素不僅是影響植物生長發(fā)育和非生物脅迫的重要植物激素，而且是一種新的降低病原菌毒力的功能分子。在植物-病原相互作用途徑中，驗證了9個抗病相關差異表達基因包括SLWRKY40/41、受體樣絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、MYB相關轉錄因子、致病相關蛋白、類鈣調素蛋白、鈣結合EF-hand家族蛋白和環(huán)核苷酸門控通道[53]。煙草花葉病毒(TMV)侵染番茄后，6個miRNA家族13個miRNA表達水平的變化。TMV感染也會導致miR166c5p和miR319c-5p的快速誘導和高水平的積累。在TMV感染的番茄葉片上觀察到的卷曲變形可能是由于miR159和miR166水平的改變。病毒侵染后，miR159和miR166在TMV侵染的番茄葉片中大量積累。miR159的靶點是在葉片發(fā)育過程中發(fā)揮了良好作用的MYB-TFs，miR166靶向同源結構域亮氨酸拉鏈轉錄因子(HD-ZIP-TF)家族，該家族對葉片發(fā)育也很重要[54]。

為進一步研究miRNA介導的植物-昆蟲相互作用機制，對敏感型栽培番茄和抗性多毛番茄在感染煙粉虱后不同階段的miRNAs進行了鑒定，共鑒定出44個已知miRNA家族，其中33個是2個物種共有，其中有13個新miRNA家族。miR168的唯一靶基因是AGO1，它是miRNA或siRNA介導的轉錄后基因沉默途徑的核心成分。病毒誘導顯著改變了AGO1(argonaute1)和miR168的表達水平，表明它們可能在應對生物脅迫中發(fā)揮作用。miR167靶向多重耐藥相關蛋白和膜聯蛋白基因。前者在植物中不僅參與植物解毒，而且還參與細胞壁通透性。膜聯蛋白在抗逆和植物發(fā)育中也發(fā)揮著重要作用。番茄miR397的靶基因是一個屬于多酚氧化酶類的lac酶，其功能主要與傷害、外界脅迫、食草動物或病原菌攻擊有關[55]。

3 討 論

miRNA是一類進化上保守的、具有調控功能的非編碼小分子RNA。miRNA以堿基互補配對的形式靶向mRNA，將其降解或抑制翻譯，進而在轉錄后水平負調控靶基因。自21世紀初首次報道植物miRNA以來，植物miRNA的相關研究有了顯著的增長，在植物中，miRNA幾乎在所有的生物學過程中都發(fā)揮重要的調控作用，特別是對一些重要的農藝性狀的精細調控使其可以作為品種選育或改良的重要對象。近年來，隨著測序技術及表型組學的發(fā)展，miRNA被證明能夠調節(jié)各種應激反應的基因、蛋白質及轉錄因子，參與在逆境條件下維持生物應激耐受過程[56]。盡管一些作物如水稻、番茄、玉米、大豆、煙草等全基因組序列已經完成，但與生物(病毒、細菌和真菌感染)和非生物(鹽度、營養(yǎng)缺乏、重金屬)相關的miRNAs并沒有完全注釋[6]。尤其是在復合脅迫條件下，植物miRNAs及其靶基因對脅迫的調控機制成為植物科學研究的重要領域。

利用高通量方法和生物信息學工具，可以識別出新的miRNAs及其靶基因，含有miRNAs或其靶基因的轉基因作物植株對非生物脅迫(干旱、鹽分、溫度等)具有一定抗性。miRNA基因調控是一種新的、可行的提高植物抗逆境能力的方法。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是植物針對病毒侵染的一個重要的應答反應。人工微RNA(artificial miRNA，amiRNA)是一種沉默基因表達的第2代RNAi技術[57]，在轉基因植物中的表達通過靶向病毒抑制轉錄物而產生病毒抗性，因此，amiRNA介導的方法可以為在經濟重要的農作物中工程化多病毒抗性提供廣泛的應用。隨著miRNAs研究的深入，有望定向改變番茄果實品質及生長周期，并為番茄逆境抵抗提供新的思路和方法。

4 結 論

miRNA是一類廣泛存在于植物體內，位于基因組非編碼區(qū)長約21～25個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA。番茄諸多生物學過程都受到miRNA的調控，包括植株形態(tài)、器官發(fā)育、生長發(fā)育以及響應干旱、鹽、溫度和生物脅迫等方面。miRNAs在番茄生長發(fā)育和脅迫應答等方面起重要作用，圍繞miRNAs及其靶基因對番茄的調控機制，定向改變番茄果實品質及生長周期。