張姍 鄧銳 李業(yè)成 鄧艷 賴思含 何光翠 易海 劉芳 蘇毅

(西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院血液科，四川 成都 610000)

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤是一種非霍奇金淋巴瘤，占非霍奇金淋巴瘤的25%～35%，占B細(xì)胞腫瘤的37%[1]。彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤是淋巴系統(tǒng)的高度侵襲性彌漫性惡性增生性疾病，目前使用利妥昔單抗、環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿和潑尼松龍等進(jìn)行臨床治療，但治療方案對約40%的患者無效[2]。彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤5年復(fù)發(fā)患病率高達(dá)40%[3]，同時治療期間的耐藥性也極大地困擾著臨床醫(yī)師和患者，約30%的彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者死于復(fù)發(fā)或耐藥[4]。因此，迫切需要了解彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)病機(jī)制，為彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤尋找新的治療方案。近年來，已經(jīng)初步發(fā)現(xiàn)了彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的一些分子發(fā)病機(jī)制。除了編碼基因，一些非編碼基因，特別是微小RNA(microRNA，miRs)，被認(rèn)為是調(diào)節(jié)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)育的最重要靶標(biāo)之一[5]。miR-224在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤中低表達(dá)，且 miR-224的表達(dá)與彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，是與彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者預(yù)后相關(guān)的獨立因素[6]。但miR-224-5p對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖和凋亡的作用及機(jī)制尚不清楚。本文主要探討miR-224-5p對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞增殖和凋亡的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基(上海慧穎生物科技有限公司，貨號：C22400500BT)，胎牛血清、青霉素和鏈霉素雙抗溶液(上海素爾生物科技有限公司，貨號：16000-044、15140122)，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(上海恪敏生物科技有限公司，貨號：11668-027)，miR-NC、miR-224-5p mimic、miR-224-5p inhibitor、pc-SMAD5質(zhì)粒及各種引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計并合成，SYBR-Green PCR試劑盒(賽默飛世爾科技公司，貨號：4309155)，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司，貨號：GK8030-20)，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(北京原平皓生物技術(shù)有限公司，貨號：GN201-01)，MTT試劑盒(上海信裕生物工程有限公司，貨號：111105-500)，BCA試劑盒(上海易色醫(yī)療科技有限公司，貨號：BC201)，cleaved caspase-3抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體、GAPDH抗體(購自碧云天生物科技有限公司，貨號：AC030-1、AB026、AB112、AF0003)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗、SMAD5抗體(上海艾博抗生物科技有限公司，貨號： ab6728，ab32529)。

1.1.2 儀器 流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，MuLTI-SKAN GO 型全自動酶標(biāo)儀購自美國Thermo 公司，F(xiàn)luorChem HD2凝膠成像系統(tǒng)購自美國Proteinsimple公司， Seahorse XFp 細(xì)胞代謝分析儀購自上海諾能生物科技有限公司。

1.1.3 組織樣品 我院收集了腫瘤組織和與腫瘤相鄰的正常組織。該研究得到我院研究倫理委員會的批準(zhǔn)，并根據(jù)《赫爾辛基宣言》的道德準(zhǔn)則進(jìn)行。所有志愿者及監(jiān)護(hù)人均簽署了有關(guān)臨床數(shù)據(jù)的書面知情同意書。

1.1.4 細(xì)胞及培養(yǎng) 人正常B細(xì)胞永生化細(xì)胞系(HMy2.CIR) 和彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系(OCI-LY19、 SU-DHL-4、OCI-LY10、 U2932)購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。細(xì)胞于含體積分?jǐn)?shù)為10% 胎牛血清、100 U· mL-1的青霉素和100 μg·mL-1的鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 取對數(shù)期細(xì)胞，接種于6孔板(1×106·孔-1)。當(dāng)達(dá)到80% 融合，根據(jù)Lipofectamine 2000說明書將100 nmoL· L-1的miR-NC、miR-224-5p mimic、miR-224-5p inhibitor、pc- SMAD5質(zhì)粒分別或聯(lián)合轉(zhuǎn)染進(jìn)入U2932細(xì)胞分別記為miR-NC組、miR-224-5p mimic組、miR-224-5p inhibitor組。未轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的U2932細(xì)胞作為Control組。

1.2.2 RT-qPCR檢測miR-224-5p與SMAD5 mRNA表達(dá)水平 將所有組織樣品剪碎并研磨，采用QIAzol裂解試劑提取總RNA，采用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。將各細(xì)胞分別接種在6孔板中，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到近90% 融合時，采用QIAzol裂解試劑提取總RNA，采用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。RT-qPCR采用SYBR-Green PCR試劑盒說明書操作進(jìn)行。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min、95 ℃ 10 min 、95 ℃ 15 s和60 ℃ 1 min的40個循環(huán)，用U6標(biāo)準(zhǔn)化。miR-224-5p的上游引物序列：5′-GTCGTACCAGTGCAGGGTCCGA-3′，miR-224-5p的下游引物序列：5′-CGCAAGTCCTAGTGGTTCCG-3′；SMAD5 的上游引物序列：5′-CTTGGATGGACGTCTGCAAG-3′；SMAD5 的下游引物序列：5′-CATGGTGAAAGTTGCAGTTC-3′；U6的上游引物序列：5′-GTGGTCCGCGTAGCGAGT-3′，U6的下游引物序列：5′-CGCTTCGGCAGCACAT-3′。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞生長 將用轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在96孔板中孵育，分別在24、48、72、96 h時用10 μL MTT染料處理細(xì)胞，然后與100 μL二甲基亞砜孵育15 min。 用酶免疫分析儀在490 nm處測量吸光值。

1.2.4 克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖 將細(xì)胞接種于6孔板(1×106·孔-1)，直到生長至可見菌落。用甲醇固定菌落，0.25% 結(jié)晶紫染色30 min，計數(shù)菌落數(shù)量。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 培養(yǎng)48 h后，胰酶消化轉(zhuǎn)染U2932細(xì)胞，離心， 按1×106個細(xì)胞·mL-1的濃度重懸。細(xì)胞懸液中加入5 μL Annexin-V- FITC和5 μL PI，在黑暗的房間里孵化15 min，然后用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞凋亡率(%)=早期細(xì)胞凋亡率(%)+晚期細(xì)胞凋亡率(%)。

1.2.6 蛋白印跡法檢測cleavedcaspase-3、Bax、Bcl-2、SMAD5蛋白相對表達(dá)水平 收集各組U2932細(xì)胞，用RIPA裂解液提取總蛋白，并用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，然后經(jīng) SDS-PAGE分離蛋白后，用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至PVDF膜，并用脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，再加入兔來源的單克隆一抗(cleaved caspase-3 1∶1000、Bax 1∶500、Bcl-2 1∶1000、SMAD5 1∶1000)在4 ℃ 封閉過夜，接著加入對應(yīng)山羊抗兔二抗(1:2000)室溫封閉1 h，最后滴ECL曝光，以GAPDH為內(nèi)參，使用Quantity One軟件進(jìn)行分析目標(biāo)蛋白質(zhì)的相對表達(dá)水平。

1.2.7 雙熒光素酶報告檢測靶向關(guān)系 收集生長至對數(shù)期的U2932細(xì)胞接種在12孔板中，并孵育24 h。將1 μg螢火蟲熒光素酶報告基因構(gòu)建體PGL3-SMAD5-WT(SMAD5野生型)或PGL3-SMAD5-MUT(SMAD5突變型)以及miR-224-5p mimic或miR-NC和PRL-CMV海藻熒光素酶報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后，細(xì)胞裂解15 min，雙熒光素酶檢測系統(tǒng)測量熒光素酶的相對活性，用螢火蟲熒光素酶活性和腎熒光素酶活性比值表示熒光素酶的相對活性。

2 結(jié)果

2.1 miR-224-5p在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中低表達(dá) 與鄰近的正常組織相比，miR-224-5p在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤組織中明顯下調(diào)(P<0.01)，見圖1A；與人正常B細(xì)胞永生化細(xì)胞系HMy2.CIR相比，彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系OCI-LY19、 SU-DHL-4、OCI-LY10、 U2932中miR-224-5p表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)，見圖1B。提示可選擇U2932細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實驗。與Control組相比，miR-NC組miR-224-5p表達(dá)并無變化，miR-224-5p mimic組miR-224-5p表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)，miR-224-5p inhibitor組miR-224表達(dá)明顯下調(diào)(P< 0.01)，見圖1C。表明轉(zhuǎn)染成功，可進(jìn)行后續(xù)試驗。

圖1 RT-qPCR檢測miR-224-5p的表達(dá)水平

2.2 miR-224-5p過表達(dá)抑制彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤U2932細(xì)胞增殖 隨著時間的增加，各組細(xì)胞吸光值逐漸出現(xiàn)差異：在96 h時，與Control組相比，miR-NC組U2932細(xì)胞吸光值無明顯變化，miR-224-5p mimic組U2932細(xì)胞吸光值明顯減少(P<0.01)，miR-224-5p inhibitor組U2932細(xì)胞吸光值明顯增加(P<0.01)，見圖2A。與Control組相比，miR-NC組U2932細(xì)胞克隆細(xì)胞數(shù)目無明顯變化，miR-224-5p mimic組U2932細(xì)胞克隆細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P<0.01)，miR-224-5p inhibitor組U2932細(xì)胞克隆細(xì)胞數(shù)目明顯增加(P<0.01)，見圖2B、C。

2.3 miR-224-5p過表達(dá)誘導(dǎo)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤U2932細(xì)胞凋亡 與Control組相比，miR-NC組彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤U2932細(xì)胞凋亡率及cleaved Caspase-3、Bax、Bcl-2水平無明顯變化，miR-224-5p mimic組彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤U2932細(xì)胞凋亡率及cleaved Caspase-3、Bax水平明顯升高、Bcl-2水平明顯降低(P<0.01)，miR-224-5p inhibitor組彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤U2932細(xì)胞凋亡率及cleaved Caspase-3、Bax水平明顯降低、Bcl-2表水平達(dá)升高(P<0.01)，見圖3。

圖2 miR-224-5p過表達(dá)對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤U2932細(xì)胞增殖的影響

圖3 miR-224-5p 過表達(dá)對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤U2932凋亡的影響

2.4 miR-224-5p靶向下調(diào)SMAD5 通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測，miR-224-5p與SMAD5 3′UTR區(qū)存在結(jié)合位點，見圖4A。通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C靶向關(guān)系，miR-224-5p高表達(dá)明顯抑制了含有野生型SMAD5質(zhì)粒的熒光素酶活性(P<0.01)，但對突變型SMAD5質(zhì)粒的熒光素酶活性無影響，見圖4B。與鄰近的正常組織相比，miR-224-5p在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤組織中SMAD5明顯上調(diào)(P<0.01)；在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤組織中miR-224-5p與SMAD5表達(dá)負(fù)相關(guān)，見圖4C、D。與Control組相比，miR-NC組彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤U2932細(xì)胞SMAD5水平無明顯變化，miR-224-5p mimic組彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤U2932細(xì)胞SMAD5水平明顯降低(P<0.01)，miR-224-5p inhibitor組彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤U2932細(xì)胞SMAD5水平升高(P<0.05)，見圖4E。

圖4 miR-224-5p 靶向下調(diào)SMAD5

2.5 miR-224-5p過表達(dá)靶向SMAD5抑制彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤U2932細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡 與Control組相比，miR-224-5p mimic 組彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤U2932細(xì)胞中SMAD5蛋白水平明顯下調(diào)(P<0.01)，pc-SMAD5組彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤U2932細(xì)胞中SMAD5蛋白水平明顯上調(diào)(P<0.01)；與miR-224-5p mimic 組相比，miR-224-5p+pc-SMAD5組彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤U2932細(xì)胞中SMAD5蛋白水平明顯上調(diào)(P<0.01)，見圖5A。與Control組相比，miR-224-5p mimic 組彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤U2932克隆細(xì)胞數(shù)目明顯減少、細(xì)胞凋亡率明顯增加、cleaved Caspase-3和Bax水平明顯升高、Bcl-2水平明顯降低(P<0.01)，pc-SMAD5組彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤U2932克隆細(xì)胞數(shù)目明顯增加、細(xì)胞凋亡率明顯減少、cleaved Caspase-3和Bax水平明顯降低、Bcl-2水平明顯增加(P<0.01)；與miR-224-5p mimic 組相比，miR-224-5p+pc-SMAD5組彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤U2932克隆細(xì)胞數(shù)目明顯增加、細(xì)胞凋亡率明顯減少、cleaved Caspase-3和Bax水平明顯降低、Bcl-2水平明顯增加(P<0.01)，見圖5B～E。

3 討論

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤高發(fā)的可能因素包括病毒感染、基因組易位或遺傳改變、環(huán)境因素、化學(xué)因素和免疫系統(tǒng)疾病等等，其病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不清楚[7]。盡管大多數(shù)情況可通過基于蒽環(huán)類藥物的聯(lián)合化療和單克隆抗體利妥昔單抗治愈，但許多患者仍存在對化療不敏感或治療后復(fù)發(fā)問題[8]。因此，急需深入了解彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤發(fā)病機(jī)理及尋找淋巴瘤發(fā)病和發(fā)展的重要分子生物學(xué)標(biāo)志。miRNA是一類廣泛存在于真核細(xì)胞中19～22個核苷酸構(gòu)成內(nèi)源性小非編碼RNA調(diào)節(jié)因子，可通過負(fù)調(diào)控其靶mRNA的穩(wěn)定性或翻譯效率來轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)[9]。miRNA在多種生物學(xué)過程中起著重要作用，包括發(fā)育，細(xì)胞增殖，分化和凋亡[10]。miRNA表達(dá)表現(xiàn)出組織特異性和時間差異。研究11]表明miR-224-5p在子宮頸癌、結(jié)腸癌、非小細(xì)胞肺癌癌等腫瘤中上調(diào)，影響腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，侵襲和凋亡。但miR-224-5p在卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌等腫瘤中低水平表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[12-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤組織和細(xì)胞系OCI-LY19、 SU-DHL-4、OCI-LY10、 U2932中miR-224-5p表達(dá)下調(diào)。同時，miR-224-5p過表達(dá)明顯抑制彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤U2932細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤U2932細(xì)胞凋亡，miR-224-5p低表達(dá)明顯誘導(dǎo)彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤U2932細(xì)胞增殖，并抑制彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤U2932細(xì)胞凋亡。

圖5 miR-224-5p過表達(dá)靶向SMAD5對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤U2932細(xì)胞增殖和凋亡的影響

為了更好地了解miR-224-5p對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤U2932細(xì)胞增殖和凋亡的作用機(jī)制，我們使用TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-224-5p的靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-224-5p與SMAD5 3’UTR區(qū)存在結(jié)合位點，并通過雙熒光素酶報告實驗驗證該靶向關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-224-5p高表達(dá)明顯抑制了含有野生型SMAD5質(zhì)粒的熒光素酶活性，但對突變型SMAD5質(zhì)粒的熒光素酶活性無影響，說明miR-224-5p與SMAD5直接靶向結(jié)合。SMAD5定位于髓系腫瘤常被刪除的5q31區(qū)域，提示可能是抑癌基因，但在分析大量不同的人類原發(fā)腫瘤和癌細(xì)胞系時，SMAD5基因未發(fā)現(xiàn)下調(diào)[15]。此外，SMAD5在結(jié)直腸癌中的表達(dá)增加，預(yù)示SMAD5可能為致癌基因[16]。本文研究發(fā)現(xiàn)SMAD5在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤組織中高表達(dá)，且miR-224-5p靶向下調(diào)SMAD5的表達(dá)，同前人發(fā)現(xiàn)SMAD5在彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤中高表達(dá)相一致[17]。SMAD5表達(dá)水平和細(xì)胞的增殖凋亡密切相關(guān)，如miR-23a和miR-27a通過靶向SMAD5促進(jìn)人顆粒細(xì)胞凋亡[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，共轉(zhuǎn)染pc-SMAD5逆轉(zhuǎn)了miR-224-5p對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤U2932細(xì)胞增殖和凋亡的作用，說明miR-224-5p過表達(dá)靶向SMAD5抑制彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤U2932細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡。但本實驗僅為體外細(xì)胞實驗，動物體內(nèi)實驗及更為詳細(xì)的分子通路機(jī)制還有待進(jìn)一步去研究探討。

4 結(jié)論

miR-224-5p過表達(dá)靶向SMAD5抑制彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤U2932細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，因此miR-224-5p 和SMAD5有望成為彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤的治療靶點。