張徐暢，陳 超，劉 秋

(大連民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116605)

石油是地質(zhì)勘探的主要對象之一，是人類主要的能源之一，有“工業(yè)血液”之稱。隨著石油工業(yè)的迅速發(fā)展，在石油的勘探、開發(fā)、運輸及提取過程中，石油對環(huán)境造成了很大污染，直接影響了人類的生產(chǎn)及生活，威脅著人類的生存與健康。全世界從20世紀(jì)初就已經(jīng)開始大規(guī)模的開采石油，到2000年已經(jīng)消費了約60萬噸，現(xiàn)在每年世界石油的總產(chǎn)量近30多億噸[1]。地球70%上的面積被海洋覆蓋，在石油開采和運輸過程中，嚴(yán)重污染了人類賴以生存的海洋環(huán)境。海洋石油泄漏事故發(fā)生后，進(jìn)入海洋里的石油會對近海和海濱生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生各種急性或慢性的巨大危害[2-3]。

解決海洋石油的油污染問題，對于保護(hù)海洋環(huán)境，保護(hù)海洋資源具有重要意義，是國家環(huán)保迫切要求解決的問題。一般來說，海洋石油污染治理有物理機(jī)械法、化學(xué)處理法和生物降解法[4]。物理方法使用圍油欄，吸油材料等，是相對簡單、安全、有效的溢油治理方法，適用于突發(fā)溢油的回收并控制溢油的擴(kuò)散；化學(xué)方法使用消油劑、凝油劑、化學(xué)燃燒等方法快速除油。物理方法主要適用于溢油初期大量油污染的治理，但對于港口相對較低濃度的油污染，則處理效果不大；化學(xué)方法容易引起二次污染，尤其是某些消油劑的化學(xué)毒性比油的毒性還大，故此這兩種方法不適用于石油污染的長期處理。生物降解法是將能降解石油的微生物投放到受污染海域，對其進(jìn)行降解的污染治理方法[5]。該方法可以對大面積的污染環(huán)境進(jìn)行治理，具有高效、經(jīng)濟(jì)、安全、無二次污染等優(yōu)點，已逐步被應(yīng)用到石油污染的治理工作中[6-8]。

本研究以大連新港石油污染海域海底沉積物為研究對象，以石油為唯一碳源富集樣品，分離、篩選出能夠降解石油的微生物類群，對分離獲得的微生物進(jìn)行鑒定，分析其降解特性，為今后深入研究其降解機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)，同時為今后海洋石油污染治理提供優(yōu)良的菌株。

1 實 驗

1.1 材 料

1.1.1 菌種來源

本實驗室前期采集大連新港石油污染海域海底沉積物樣品并進(jìn)行菌株分離工作，獲得了大量微生物菌種資源并建立了菌種資源庫。本研究選用的5株菌株選自該菌種資源庫，編號分別為P14、P22、P23、P35、P37，保藏于大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院海洋微生物研究所。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)LB培養(yǎng)基。酵母浸粉5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，瓊脂18 g，去離子水1 L，pH=7.0。

(2)人工海水培養(yǎng)基(ASM培養(yǎng)基)。NaCl 30 g，MgSO40.35 g，NH4NO31.41 g，Na2HPO44.79 g，KH2PO40.2245 g，大豆粉 1.76 g，pH調(diào)到7.2后加入100 μL微量溶液：CaCl22 mg·L-1，F(xiàn)eCl36H2O 50 mg·L-1，CuSO40.5 mg·L-1，MnCl2·4H2O 0.5 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 10 mg·L-1，分裝至150 mL錐形瓶中，高壓蒸汽滅菌(121°C，20 min)。

(3)主要溶液的配制。a) 50×TAE電泳緩沖液：于少量超純水中加入121 g Tris和18.6 g Na2EDTA·2H2O，攪拌均勻，再加入28 mL冰醋酸，混勻后定容至50 mL。注：根據(jù)使用緩沖液濃度，適當(dāng)稀釋即可。b) TE緩沖溶液：吸取1 mol·L-1Tris-HCl緩沖液2.0 mL和0.5 mol/L EDTA緩沖液0.4 mL，調(diào)pH至8.0，超純水定容至200 mL，121°C滅菌30 min。

1.1.3 儀 器

超凈工作臺(ZHZH-C1112C)，高壓滅菌器(HVE-50)，電熱恒溫培養(yǎng)箱(HPX-9052MBE)，搖床(ZWYR-D2403)，紫外可見分光光度計(UV-1600)，冷凍離心機(jī)(H2050R)，電子分析天平(FA2004)，基因擴(kuò)增儀(TP350)，潛水電泳系統(tǒng)(AD-160)，制冰機(jī)(SIM-F140)，凝膠成像系統(tǒng)(GelDoc-It310)

1.1.4 試 劑

酵母浸粉(奧博星)，胰蛋白胨(奧博星)，NaCl(科密歐)，MgSO4(科密歐)，NH4NO3(科密歐)，Na2HPO4(科密歐)，KH2PO4(科密歐)，CaCl2(科密歐)，F(xiàn)eCl3·6H2O(科密歐)，CuSO4(科密歐)，MnCl2·4H2O(科密歐)，ZnSO4·7H2O(科密歐)，石油醚(科密歐)，二氯甲烷(科密歐)，瓊脂(賽國)，石油(中石油)，十二烷(阿拉丁)，十六烷(阿拉丁)，蒽(阿拉丁)，菲(阿拉丁)，芘(阿拉丁)，萘(科密歐)，rTaq DNA Polymerase(TaKaRa)，dNTP Mixture(TaKaRa)，10×buffer(TaKaRa)，6×DNA loadingbuffer(TaKaRa)，SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒(生工)，瓊脂糖(生工)，Na2EDTA·3H2O(源葉)，Tris(賽國)，HCl(科密歐)。

1.2 實驗過程

1.2.1 菌株活化

將菌種在LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，并純化。

1.2.2 DNA提取

(1)取適量菌體加入480 μL的TE，20 μL的溶菌酶(10 mg/ml)，37 ℃溫浴2 h；

(2)加入50 μL的20 %SDS和5 μL的蛋白酶K(20 μg/ml),55 ℃溫浴1 h；

(3)加入550 μL的酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1的混合液，震蕩10-20 min，12 000 r·min-1離心10 min，吸取上清。

(4)重復(fù)步驟3，直至無沉淀；

(5)加入兩倍體積的無水乙醇于零下20 ℃放置30 min以上，12 000 r·min-1，離心5-10 min，去除上清；

(6)加入200 μL的70 %乙醇清洗DNA，12 000 r·min-1離心5 min；

(7)重復(fù)步驟6；

(8)乙醇揮發(fā)干燥后，將DNA溶解于50 μL TE緩沖液中，于零下20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 16S rDNA的PCR擴(kuò)增

(1)本研究使用基因引物如下(5’-3’)：16S rDNA-FR：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；16S rDNA-RV：TACCTTGTTACGACTT。

(2)PCR體系(50 μL)：10×buffer 5 μL、dNTP 8 μL、Taq酶 0.5 μL、RP 1 μL、FP 1 μL、ddH2O 33.5 μL，DNA 1μL。

(3)PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min, 94 ℃變性40 s, 50 ℃退火l min, 72 ℃延伸1.5 min，72 ℃保持10 min，共循環(huán)30次。

(4)凝膠電泳驗證：1)按體積稱取 1 %(w/v)的瓊脂糖(即1g瓊脂糖加入100 mL1×TAE)，加 1×TAE 緩沖液，加熱至瓊脂糖完全溶解；2)冷卻至 60 ℃左右，加入4S RED溶液，使其終濃度為 0.1 μL·mL-1；3)將溶液倒入制膠模板中，插入合適大小的梳子，靜置冷卻； 4)待凝膠完全凝固后，小心將梳子拔出，將凝膠放入電泳槽中； 5)取 4 μL提取的DNA與 2 μL 上樣緩沖液(6×Loading Buffer)充分混合后加入樣品孔中，以 TaKaRa 公司的DNA Marker DL2000作為分子量標(biāo)準(zhǔn)；6)100V 電泳 30 min ；7)凝膠成像儀觀察并拍照；8)將16S rDNA PCR產(chǎn)物回收測序。

(5)釆用MEGA 7.0.14軟件包構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對菌株的同源性及系統(tǒng)發(fā)育地位進(jìn)行分析。

1.2.4 石油降解率的測定

將培養(yǎng)在LB平板上的p14、p22、p23、p35、p37五株菌株用竹簽刮取到無菌液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后，使菌株生長到對數(shù)生長期，配制成分布均勻的菌懸液，使其OD值在0.45～0.55，然后對菌液離心后用生理鹽水將LB培養(yǎng)基洗凈, 用移液槍吸取2%的接種量接入0.2%石油馴化的人工海水培養(yǎng)基(30 mL含0.06 mL石油的馴化的人工海水培養(yǎng)基接入0.6 mL菌懸液)，28℃/180 r·min-1培養(yǎng)，設(shè)置3組平行，以不加菌的含石油培養(yǎng)基為空白對照(空白對照設(shè)置三組)，在搖床內(nèi)培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)束后，每瓶培養(yǎng)體系中加入20 mL石油醚進(jìn)行第一次提取，留上層溶液，下層溶液進(jìn)行第二次提取。第二次萃取加入15 mL石油醚，第三次加入10 mL石油醚；共提取三次。每次提取需充分混勻，提取時間為20 min。將三次萃取溶液離心(10 000 r·min-1)，定容至50 mL容量瓶中。取100 μL萃取液溶于4.9 mL的石油醚中，波長225 nm下紫外檢測吸光度值。

1.2.5 菌懸液OD值的測定方法

LB液體培養(yǎng)基為對照調(diào)零，將調(diào)配好的菌懸液置于石英比色皿內(nèi)，設(shè)置λ=600，測定菌懸液的吸光度。

1.2.6 石油殘留量的測定

培養(yǎng)結(jié)束后，每瓶培養(yǎng)體系中加入20 mL石油醚進(jìn)行第一次提取，留上層溶液，下層溶液進(jìn)行第二次提取。第二次萃取加入15 mL石油醚，第三次加入10 mL石油醚，共提取三次。每次提取需充分混勻，提取時間為20 min。將三次萃取溶液離心(10 000 r·min-1)，定容至50 mL容量瓶中。取100 μL萃取液溶于4 900 μL的石油醚中，波長225 nm下紫外檢測吸光度值。

1.2.7 石油降解率的計算方法

以比色法測定各種樣品的石油降解情況。

紫外比色法：225 nm條件下，測定吸光度值，根據(jù)公式(1)進(jìn)行降解率的計算。

(1)

式中：Mc為對照組吸光值；M0為待測菌株處理組吸光值。

1.2.8 制定石油標(biāo)準(zhǔn)曲線

以沸程60～90 °C的石油醚為溶劑，配置成一系列的石油標(biāo)準(zhǔn)溶液，在紫外分光光度計225 nm處測定吸光度值，以光密度為縱坐標(biāo)，油濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.9 降解菌對不同烴類的利用

將培養(yǎng)在LB平板上的p14、p22、p23、p35、p37五株菌株用竹簽刮取到無菌液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24 h后，使菌株生長到對數(shù)生長期，配制成分布均勻的菌懸液，使其OD值在0.45～0.55，然后對菌液離心后用生理鹽水將LB培養(yǎng)基洗凈，將萘、菲用二氯甲烷溶解，配成0.5 g·mL-1母液，芘用二氯甲烷配成0.25 g·mL-1母液，按0.25%(V/V)分別加入到人工海水培養(yǎng)基內(nèi)，將蒽以0.005 g·mL-1加入到人工海水培養(yǎng)基內(nèi)，十二烷、十六烷分別按0.5 %(V/V)接入到人工海水培養(yǎng)基內(nèi)，以2%接種量用移液槍吸取菌懸液接種至含蒽、萘、菲、芘及十二烷、十六烷的人工海水培養(yǎng)基中，28 ℃/180 r·min-1培養(yǎng)，設(shè)置3組平行，以不加菌的含蒽、萘、菲、芘及十二烷、十六烷培養(yǎng)基為空白對照(空白對照設(shè)置三組)，在搖床內(nèi)培養(yǎng)3 d?？瞻捉M為對照調(diào)零，在波長600 nm下檢測吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定

菌株p14、p22、p23、p35、p37的16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分別如圖1-圖5。

圖1 菌株p14 16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖2 菌株p22 16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 菌株p23 16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 菌株p35 16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 菌株p37 的系統(tǒng)發(fā)育樹

以p14、p22、p23、p35、p37菌株的基因組DNA為模板，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均得到長度約為l.5kb的產(chǎn)物，測序后比對分析發(fā)現(xiàn)：p14與HalomonastitanicaeBH1T相似度為100%；p22與Halomonasalkaliphila18bAGT相似度為99.70%；p23與HalomonasvenustaDSM 4743T相似度為99.92%；p35與HalomonasalkaliantarcticaCRSST相似度分別為100%；p37與HalomonaspacificaDSM 4742T相似度為99.48%。

2.2 菌株降解特性分析

本研究以石油、菲、萘、蒽、芘、正十二烷、正十六烷為唯一碳源，分別分析了5株鹽單胞菌株的烴類物質(zhì)降解能力，具體結(jié)果如圖6和圖7。

圖6 各個菌株降解率比較

從圖2.6中可以看出，菌株p22降解石油能力最好，降解率達(dá)到47.8%，菌株p37次之，降解率達(dá)到40.2%，菌株p14降解率為31.0%，菌株p23降解率為18.6%，菌株p35降解率最差，僅為3.8%。該研究結(jié)果表明，同一個屬的不同菌株之間，石油降解性能差異較大。

圖7 菌株p14、p22、p23、p35、p37對不同烷烴及芳烴的降解性能

由圖7可以看出菌株p14、p22、p23、p35、p37對不同烷烴及芳烴的降解性能，菌株p14在十二烷的人工海水培養(yǎng)基內(nèi)生長最好，對十二烷的降解能力最好；在蒽的人工海水培養(yǎng)基內(nèi)生長最差，對蒽的降解能力最差；菌株p22在十六烷及菲的人工海水培養(yǎng)基內(nèi)生長最好，對十六烷及菲的降解能力最好；在蒽的人工海水培養(yǎng)基內(nèi)生長最差，對蒽的降解能力最差；菌株p23在十六烷的人工海水培養(yǎng)基內(nèi)生長最好，對十六烷的降解能力最好；在萘的人工海水培養(yǎng)基內(nèi)生長最差，對萘的降解能力最差；菌株p35在十六烷的人工海水培養(yǎng)基內(nèi)生長最好，對十六烷的降解能力最好；在萘的人工海水培養(yǎng)基內(nèi)生長最差，對萘的降解能力最差；同樣的，菌株p37在十六烷的人工海水培養(yǎng)基內(nèi)生長最好，對十六烷的降解能力最好；在萘的人工海水培養(yǎng)基內(nèi)生長最差，對萘的降解能力最差。

3 討 論

通過對石油降解細(xì)菌p14、p22、p23、p35、p37對石油降解率的測定，及其對芳烴蒽、萘、菲、芘和烷烴十二烷、十六烷降解性能的探究，發(fā)現(xiàn)5株菌株均具有石油降解能力，4株菌株的降解率在10%以上，2株菌株的降解率在40%以上，菌株p22降解石油能力最好，菌株p35降解率最差。石油降解細(xì)菌p14、p22、p23、p35、p37對芳烴及烷烴均有降解能力，p22、p23對芳烴降解性能更好，p14對芳烴的降解能力最差。菌株p14對烷烴降解能力較強(qiáng)，菌株p35、p37對烷烴降解能力較差。因此，對于Halomonas屬的菌株，同一屬的不同菌株對石油的降解性能差異較大，對不同碳源的降解偏好性也各不相同。該結(jié)果將為今后烴類物質(zhì)的污染環(huán)境的微生物修復(fù)技術(shù)的開發(fā)提供性能優(yōu)良的實驗菌株，并為今后環(huán)境污染微生物修復(fù)治理研究提供理論基礎(chǔ)。