李笑櫻 印 鐵 仉 磊 姜德銘 張?jiān)迄i 劉曉萌 鄒球龍 張曉琳

(中糧營養(yǎng)健康研究院；營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；老年?duì)I養(yǎng)食品研究北京市工程實(shí)驗(yàn)室，北京 102209)

1 概述

真菌毒素是真菌在適宜溫濕度條件下產(chǎn)生的具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物，在糧食及飼料衛(wèi)生學(xué)領(lǐng)域又稱為霉菌毒素[1]。目前已知的真菌毒素有300多種，其中污染范圍較廣的主要有黃曲霉毒素(AF)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、伏馬毒素(FB)等。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織 (FAO)估算，全世界每年約有25%的谷物受真菌毒素污染，約2%的農(nóng)產(chǎn)品因霉變而失去營養(yǎng)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，給農(nóng)業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

水稻、小麥、玉米、大豆是我國主要的糧油原料，通過對原料進(jìn)行深加工和精加工，從而提升糧油附加值。糧油原料在加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，主要有玉米加工副產(chǎn)物[玉米酒精糟(DDG)、干酒糟及其可溶物(DDGS)、噴漿玉米皮]、麩皮、胚芽、麩質(zhì)、豆渣等，其中飼料是這些糧油副產(chǎn)物的主要利用途徑。但糧油原料若污染真菌毒素不僅難以在工業(yè)生產(chǎn)中被破壞分解，濃縮干燥深加工和精加工過程還會將真菌毒素隨清液或濕糟富集在副產(chǎn)物中[3]。

黃俊恒等[4]2018年從19個(gè)省市收集442份飼料及飼料原料，檢測了其中的黃曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素 3 種真菌毒素含量。結(jié)果顯示，餅粕類樣品受黃曲霉毒素B1污染嚴(yán)重，其次為 DDGS(谷物干酒精槽)，各類樣品受玉米赤霉烯酮污染程度較輕，小麥、麩皮、DDGS受嘔吐毒素污染較為嚴(yán)重。2019年1月—6月，王國強(qiáng)等[5]對來自不同省份的321份飼料及飼料原料樣品進(jìn)行了 AFB1、ZEN、DON、FB和 T-2 毒素的檢測。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高達(dá)91.36%的飼料及原料受到 2 種及以上真菌毒素污染。麩皮、飼料樣品真菌毒素污染嚴(yán)重，尤以 DON 污染最嚴(yán)重。

被真菌毒素污染的飼料適口性變差，造成動物采食量的下降，嚴(yán)重影響生長性能；真菌毒素還會引起動物繁殖功能紊亂，造成繁殖性能降低；降低機(jī)體免疫細(xì)胞活性，導(dǎo)致免疫抑制；還可抑制蛋白質(zhì)和酶的合成，破壞組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)，損害動物的肝腎、腸道、神經(jīng)等器官和組織[6-8]。飼料中的真菌毒素還會通過食物鏈殘留在動物產(chǎn)品(如肉蛋奶)中，長期食用危害人體健康[9]。

2 限量標(biāo)準(zhǔn)

我國《食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB 2761—2017)》對玉米、小麥、稻谷、大豆、花生及其加工制品中主要真菌毒素的限量有一定的控制標(biāo)準(zhǔn)[10]。我國《飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》(GB 13078—2017)[11]對飼料及原料各真菌毒素的最大允許量都制定了嚴(yán)格的限制標(biāo)準(zhǔn)。新標(biāo)準(zhǔn)細(xì)化了不同飼料原料及產(chǎn)品中的毒素限量，不僅針對使用環(huán)節(jié)，更為原料管控提供法律依據(jù)。如對于玉米深加工副產(chǎn)物相關(guān)產(chǎn)品，標(biāo)準(zhǔn)考慮實(shí)際加工過程中的濃縮效應(yīng)，將玉米皮、噴漿玉米皮、玉米漿干粉、玉米酒糟類產(chǎn)品項(xiàng)中ZEN限量擴(kuò)大至玉米原料的3倍(≤1.5 mg/kg)。 增加植物性飼料原料DON限量標(biāo)準(zhǔn)，提高了標(biāo)準(zhǔn)的可行性[3]。

3 脫毒方法

實(shí)際生產(chǎn)中，糧油加工副產(chǎn)物中真菌毒素的含量常高于國家限量標(biāo)準(zhǔn)，因此長期以來開展了許多針對糧油副產(chǎn)物脫霉技術(shù)的研究，目前常用的脫毒方法有物理脫毒法、化學(xué)脫毒法、脫霉劑脫毒法。

物理脫毒方法主要包括篩分法、熱處理、輻照法和提取法等。如物理篩分法作為對原料的第一道把關(guān)，處理方法簡單、成本低、效果明顯。因此，多應(yīng)用于收糧環(huán)節(jié)。化學(xué)法去除毒素的原理是利用化學(xué)試劑與毒素分子在特定條件下發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，通過去除毒素分子上的某個(gè)官能團(tuán)或者化學(xué)鍵，或在毒素分子上增加某個(gè)官能團(tuán)，來去除或者降低毒素分子的生物毒性。研究較多的化學(xué)試劑包括臭氧、氨、亞硫酸以及雙氧水等。

但在實(shí)際生產(chǎn)中，物理法和化學(xué)法的脫毒能力都存在一定的不足，不僅成本高、能耗高、對物料的性質(zhì)(如水分、狀態(tài)、組成成分)要求高，而且很難實(shí)現(xiàn)同時(shí)去除多種毒素。如物理篩分法，篩分后的霉變籽粒需進(jìn)行二次處理，并且現(xiàn)有很多設(shè)備無法篩分出許多表面正常但已被真菌毒素污染的籽粒；輻照法的降解產(chǎn)物復(fù)雜、且設(shè)備安全性存在爭議；氨化法只能去除黃曲霉毒素等[12]。

相比前兩種方法，脫霉劑脫毒法只需通過飼料中脫霉劑的添加，就可實(shí)現(xiàn)同時(shí)降解多種毒素，不僅處理?xiàng)l件溫和，而且更安全有效，因此是最有可能在畜禽飼料中實(shí)現(xiàn)真菌毒素脫除的方法。目前，畜禽飼料使用最多的脫霉劑脫毒法是在飼料中添加真菌毒素脫霉劑。飼料中脫霉劑的種類包括吸附劑和降解菌/酶[13]。

3.1 吸附劑脫毒

目前用于真菌毒素吸附的物質(zhì)主要有硅鋁酸鹽類、活性炭和有機(jī)物類。硅鋁酸鹽類吸附劑含有Al2O3和SiO2，包括蒙脫土、膨潤土、高嶺土、斑脫土、沸石、海泡石、硅藻土、三硅酸鎂等。市面上較多使用水合鋁硅酸鈉鈣(HSCAS)，這種吸附劑可大量吸附AFB1，其結(jié)合機(jī)制為HSCAS具有非常大的比表面積，且層間存在永久性負(fù)電荷，AFB1中的β-羰基與HSCAS中的Al3+形成穩(wěn)定的金屬螯合物?；钚蕴渴怯赡拘?、蔗渣、谷殼、硬果殼等碳化后再經(jīng)過化學(xué)或物理活化處理而成的一類吸附劑。其特點(diǎn)包括具有多孔結(jié)構(gòu)，比表面積大，吸附容量大；性能穩(wěn)定，適合不同溫度和酸堿條件；吸附速度快，價(jià)格相對低廉等優(yōu)點(diǎn)，但這種吸附屬于非特異性吸附，吸附力不具備針對性，易造成營養(yǎng)物質(zhì)的流失。有機(jī)物類吸附劑包括酵母細(xì)胞壁、甘露聚糖、殼聚糖、果膠、消膽胺、聚乙烯吡咯烷酮、交聯(lián)聚維酮等。其中酵母細(xì)胞壁使用較為廣泛，這種吸附劑的作用原理為細(xì)胞壁上含有很多多糖吸附中心，利用氫鍵、離子鍵、疏水作用進(jìn)行非特異性吸附，另外飼料中添加酵母細(xì)胞壁也有一定活化和增強(qiáng)畜禽免疫系統(tǒng)的作用[13-15]。

3.2 改性吸附劑脫毒

實(shí)驗(yàn)研究和實(shí)際應(yīng)用中改性吸附材料以改性硅鋁酸鹽類吸附劑、改性甘露聚糖和改性果膠等為主。

有研究表明，鈣基膨潤土能夠降低天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶，從而降低AFB1對動物生長的影響。表面活性劑能夠改變沸石表面的疏水性，增強(qiáng)沸石對AFB1、ZEN、OTA的吸附能力。天然沸石改性可用十八烷基二甲基芐基氯化銨、雙十八烷基二甲基氯化銨、表面活性劑氯化十六烷吡啶和苯扎氯銨。蒙脫土改性可用苯扎氯銨、十六烷基三甲基溴化銨、十八烷基三甲基氯化銨、季銨鹽及金屬離子和非離子表面活性劑辛基酚聚氧乙烯醚等。

甘露聚糖可用乙酸酐和酯化進(jìn)行改性。對甘露聚糖進(jìn)行酯化后，能夠增強(qiáng)其對真菌毒素的吸附效果。將甘露聚糖負(fù)載在膨潤土上，制備新的脫毒劑，能夠有效提高甘露聚糖對真菌毒素的吸附效果和穩(wěn)定性。果膠經(jīng)低甲基酰胺化改性后，使其具有更高的凝膠強(qiáng)度，能夠有效捕獲DON[16-18]。

3.3 降解菌/酶脫毒

真菌毒素降解菌/酶具有特異性(專一性)、不可逆性、降解產(chǎn)物毒性較低等特點(diǎn)，其對真菌毒素降解機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)。DON的化學(xué)結(jié)構(gòu)為12，13-環(huán)氧-3α，7 α，15-三羥基單端孢霉-9-烯-8-酮，其生物降解菌/酶的脫毒位點(diǎn)位于C12，C13環(huán)氧基團(tuán)、C3位羥基和C16。ZEN的化學(xué)結(jié)構(gòu)為酚的二羥基苯酸內(nèi)酯，其生物降解菌/酶脫毒機(jī)制為水解內(nèi)酯環(huán)和氧化作用。FB化學(xué)結(jié)構(gòu)為多氫醇和兩個(gè)丙三羧酸組成的雙酯化合物，其生物降解菌/酶脫毒機(jī)制為脫羧、脫氨和脫酯作用[19-22]。

降解菌法一種途徑為通過篩選出可以代謝真菌毒素的微生物，將其加入到飼料中，動物在采食后，在動物腸道活化，對特定真菌毒素進(jìn)行代謝降解，以產(chǎn)生無毒的代謝物排出體外。另一種途徑為微生物發(fā)酵飼料，主要是在霉變飼料中接種一定量的微生物使其在適宜的條件下發(fā)酵，真菌毒素在發(fā)酵過程中被代謝分解為無毒的產(chǎn)物。Binder等[23]從牛瘤胃的富集培養(yǎng)物中分離到一株可轉(zhuǎn)化DON和其他單端孢霉烯族毒素的厭氧優(yōu)桿菌屬細(xì)菌(Eubacterium BBSH797)，并確定其降解DON 的代謝產(chǎn)物為DOM-1，經(jīng)過動物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該BBSH797能夠在家禽的消化道內(nèi)把單端孢霉烯族類的真菌毒素生物轉(zhuǎn)化為無毒的代謝產(chǎn)物。Lei 等[20]從72個(gè)自然界樣品及1 088株實(shí)驗(yàn)室保藏菌株中，篩選出1株能夠高效降解ZEN的枯草芽孢桿菌ANSB01G，其在液體培養(yǎng)基中對ZEN的降解率為88.65%, 并且該菌能夠降解自然霉變玉米、DDGS和豬全價(jià)配合飼料中84.58%、66.34%以及83.04%的ZEN。利用該菌株發(fā)酵生產(chǎn)的真菌毒素生物降解劑對青年母豬玉米赤霉烯酮中毒癥有較好的緩解作用。

酶降解法主要是用特定真菌毒素的降解酶來降解飼料中的真菌毒素。但由于酶對溫度比較敏感，在飼料高溫制粒的過程中容易失活，同時(shí)真菌毒素種類多，所需降解酶系復(fù)雜，對酶生產(chǎn)技術(shù)要求高，目前酶降解法應(yīng)用較少。Takahashi-Ando等[24]研究了粉紅粘帚菌Gliocladium roseum IFO7063降解ZEN的機(jī)制及產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，確定了關(guān)鍵作用酶為內(nèi)酯水解酶(ZHD101)，并將ZHD101編碼基因在分裂酵母、大腸桿菌和釀酒酵母中實(shí)現(xiàn)了活性表達(dá)。Heinl等[25]在細(xì)菌 Sphingopyxis sp.MTA144中找到了兩個(gè)水解FB1的關(guān)鍵基因，一個(gè)基因編碼脫羧酶，另一個(gè)編碼轉(zhuǎn)氨酶。

3.4 復(fù)合型脫毒劑脫毒

由于單一脫毒法只能對某些特定的真菌毒素進(jìn)行脫毒，且存在脫毒效率低等問題，人們嘗試將多種脫毒方法與脫毒劑進(jìn)行配合使用的復(fù)合脫毒法。比如在飼料中添加防霉劑(丙酸鈣)、鋁硅酸鹽(蒙脫土)、真菌毒素降解酶、降解菌、免疫增強(qiáng)劑(酵母細(xì)胞壁)等，通過將這些原料進(jìn)行合理的復(fù)配及工藝處理，可以達(dá)到高效、廣譜、穩(wěn)定的脫毒效果。因此，目前市場上及實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用比較多的脫毒劑為復(fù)合型脫毒劑。

4 真菌毒素吸附劑、降解菌/酶評估方法(體外和體內(nèi)評估)

農(nóng)業(yè)部目錄中沒有“真菌毒素吸附劑”這個(gè)條款，官方也沒有此類原料標(biāo)準(zhǔn)和評估方法。對真菌毒素吸附劑和生物降解劑的評估方法，企業(yè)普遍采用標(biāo)準(zhǔn)品直接加入法，該法優(yōu)點(diǎn)在于易于操作，但往往脫離實(shí)際情況，吸附效果被放大，數(shù)據(jù)不可靠；且未明確說明毒素是如何轉(zhuǎn)移，并不能反應(yīng)實(shí)際應(yīng)用中的效果。另一種方法為仿生吸附分離評估法，其優(yōu)點(diǎn)在于接近真實(shí)環(huán)境，明確了真菌毒素轉(zhuǎn)移的過程。但這種方法適用于礦物質(zhì)做載體的產(chǎn)品，分離出的吸附劑與真菌毒素形成的物質(zhì)，按常規(guī)提取方法檢測不到毒素，必須經(jīng)過處理才能進(jìn)行檢測，分離方法困難，回收率較低。

吸附劑的體內(nèi)評估結(jié)果表明，當(dāng)畜禽采食到黃曲霉毒素污染的飼料時(shí)，飼料中添加蒙脫土、活性炭、葡聚糖、膨潤土、沸石對黃曲霉毒素有較好的吸附效果，可緩解毒素對畜禽的負(fù)面影響；當(dāng)畜禽采食到玉米赤霉烯酮污染的飼料時(shí)，飼料中添加活性炭、膨潤土、沸石對玉米赤霉烯酮有較好的吸附效果，可緩解毒素對畜禽的負(fù)面影響；另外，消膽胺對伏馬毒素有較好的吸附效果；葡聚糖對鐮刀菌毒素有較好的吸附效果；葡聚糖、膨潤土在黃曲霉毒素與鐮刀菌毒素共存時(shí)有較好的吸附效果[26，27]。降解菌的體內(nèi)評估結(jié)果表明，BBSH797能夠在家禽的消化道內(nèi)把單端孢霉烯族類的真菌毒素通過生物轉(zhuǎn)化方式降解為無毒的代謝產(chǎn)物?？莶菅挎邨U菌ANSB01G發(fā)酵生產(chǎn)的真菌毒素生物降解劑對青年母豬玉米赤霉烯酮中毒癥狀有較好的緩解作用。

5 總結(jié)與展望

通過對國內(nèi)外21家知名脫霉菌/酶公司產(chǎn)品進(jìn)行的調(diào)研，發(fā)現(xiàn)實(shí)際生產(chǎn)中多為主要針對黃曲霉毒素的硅鋁酸鹽類吸附劑，這類吸附劑以蒙脫土為主，對糧油副產(chǎn)物中黃曲霉毒素吸附效果較好且很少吸附其他營養(yǎng)成分，解吸附性弱。針對嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮這兩種污染較嚴(yán)重的真菌毒素，市面上現(xiàn)有吸附劑對其吸附效果較差?，F(xiàn)有的脫毒菌/酶制劑主要成分多以嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮降解菌為主，菌株的生物安全性需評估，同時(shí)脫霉菌劑的實(shí)際應(yīng)用效果也往往受到飼料、動物消化系統(tǒng)等環(huán)境的影響。所以糧油副產(chǎn)物用作飼料后，對其中如嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮等污染較嚴(yán)重的真菌毒素的生物降解菌/酶和新型吸附劑(如納米級材料、石墨烯、改性材料)脫除技術(shù)的開發(fā)將是未來發(fā)展的方向，這將有助于糧油副產(chǎn)物的充分利用，節(jié)約我國糧油資源，同時(shí)減少其因堆積而造成的環(huán)境污染等一系列問題[28-30]。