羅美玲，譚波濤，潘璐，伍亞民，劉媛，虞樂華

1成都市第三人民醫(yī)院康復醫(yī)學科，成都 610031；2重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院康復醫(yī)學科，重慶 400010；3陸軍軍醫(yī)大學附屬大坪醫(yī)院特殊環(huán)境戰(zhàn)傷防治研究室/創(chuàng)傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室，重慶 400042

髓鞘(myelin)包裹在軸突外，對維持軸突的正常功能具有重要作用[1]。研究發(fā)現(xiàn)，脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)后軸突脫髓鞘現(xiàn)象持續(xù)存在，這可能是導致患者功能恢復困難的重要原因之一[2]。在嚙齒類動物的SCI研究中，雖然觀察到一定程度的自發(fā)性髓鞘再生，但不足以誘導機體功能恢復[3-4]，采用一定策略促進髓鞘再生是SCI治療的潛在靶點[5]。越來越多的證據(jù)表明，神經(jīng)元電活動調(diào)控著髓鞘的發(fā)育過程[6-9]。2017年，Li等[10]在大鼠輕度脊髓挫裂傷后，通過置入電極持續(xù)誘導其大腦初級運動皮質(zhì)(M1)神經(jīng)元放電，發(fā)現(xiàn)大鼠病灶處髓鞘再生活動增強。但置入電極創(chuàng)傷較大，且影響的范圍不確定，亟需新技術來解決這些問題。特定藥物激活特定受體(designer receptor exclusively activated by designer drugs，DREADDs)技術是一種被廣泛使用的化學遺傳學方法，其將載有特異性受體的病毒注射到機體內(nèi)感染靶細胞，當受體與特定的化學藥物相結合時，便可實現(xiàn)對細胞信號、電活動等生理行為的調(diào)控。由于該技術創(chuàng)傷小，控制范圍相對精準，近年來逐漸被廣泛應用于神經(jīng)科學領 域[11-14]。2018年，Mitew等[15]使用DREADDs技術增強小鼠大腦感覺神經(jīng)元的電活動，結果檢測到胼胝體受刺激處的軸突髓鞘化程度提高。本研究旨在探討增強神經(jīng)元電活動對脊髓損傷小鼠軸突髓鞘再生及運動功能恢復的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物與試劑 6～8周齡成年雄性C57/BL小鼠，體重25～30 g，由陸軍特色醫(yī)學中心實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(渝)2012-0005。腺相關病毒pA AV-hSy n-HA-hM3D(Gq)-IRESmCitrine(上海gene-chem)；N-氧化氯氮平(CNO，英國Bristol公司，Tocris Bioscience)。一抗：雞單克隆抗GFP抗體(1:2000；英國Abcam公司)；兔單克隆抗NeuN抗體(1:400；美國Millipore公司)；小鼠單克隆抗cFos 抗體(1:200；美國santa crutz公司)；大鼠單克隆抗MBP抗體(1:200；美國Millipore公司)；小鼠單克隆抗Neurofilament抗體(SMI312)(1:200；美國Biolegend公司)；小鼠單克隆抗Neurofilament 200抗體(NF200)(1:200；美國Sigma公司)。DAPI(0.5 μg/ml； 美國sigma公司)。驢血清以及Alex Fluor-488、Alex Fluor-594 和Alex Fluor-647標記的二抗均來自美國Jackson laborator y。激光共聚焦顯微鏡(Nikon A1+R，日本尼康公司)。熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。透射電鏡(Hitachi-7500，日本Hitachi公司)。實驗過程符合國家及單位有關實驗動物的管理和使用規(guī)定。

1.2方法

1.2.1腺相關病毒的立體定位注射 所有小鼠均進行腺相關病毒pAAV-hSyn-HA-hM3D(Gq)-IRESmCitrine的立體定位注射。立體定位注射方法：以小鼠大腦Bregma為原點，在距離中線0.8 mm及1.2 mm的右側大腦皮質(zhì)，AP方向坐標(單位mm)分別為-0.5/+0.8、-1/+0.8、-0.5/+1.2、-1/+1.2，共4個位點，使用微量注射器向各個位點注射0.6 μl腺相關病毒，注射深度0.7 mm。

1.2.2動物模型的制備及分組 33只雄性C57/BL小鼠隨機分為假手術組、SCI組與激活組(n=11)。所有實驗動物于病毒注射后2周用1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔麻醉，置于俯臥位，以胸椎彎曲最大處為中心，用小鼠剃毛器去除該區(qū)毛發(fā)。常規(guī)消毒，剪開皮膚，顯露頸后脂肪墊，于后緣逐層切開，分離肌肉，暴露棘突。根據(jù)T9棘突斜向尾側、T11斜向頭側、T10中立稍斜向后的特點，確定T10、T11的位置。咬去T10、T11棘突及相應椎板，充分暴露脊髓背面及兩側。除假手術組小鼠不接受脊髓損傷外，剩余實驗小鼠均采用Impactor Model-2改良Allen's打擊設備造成輕度脊髓挫裂損傷，致傷力度為2.5 mm×5 g。打擊完畢后，無菌縫合傷口，待其蘇醒后觀察記錄有無異?；顒樱蠓呕鼗\中飼養(yǎng)。術后給予青霉素肌內(nèi)注射預防感染，20 000 U/次，共3 d。術后常規(guī)人工排尿(2次/d或3次/d)，直至恢復自主膀胱。將SCI后1 d時后肢運動功能(basso mouse scale，BMS)評分高于3分(提示脊髓損傷過輕)，傷后1周BMS評分低于3分(提示脊髓損傷過重)的小鼠剔除，并及時補充相同數(shù)量的實驗小鼠建模。

1.2.3腹腔藥物注射 將CNO溶于二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)，制作儲存液(10 mg CNO/2 ml DMSO)，分裝后儲存于-20 ℃冰箱，使用時用生理鹽水稀釋。SCI 2周后，實驗動物接受腹腔注射。激活組小鼠接受CNO的工作濃度為1 mg/(kg·d)，SCI組與假手術組注射等量生理鹽水，1次/d，持續(xù)4周。

1.2.4組織取材及冷凍切片 腹腔注射4周后，各組隨機抽取8只小鼠進行灌注取材。用1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后，先用0.01 mmol/L PBS經(jīng)心灌注，然后經(jīng)4%多聚甲醛(PFA)灌注后取出小鼠T10的脊髓組織。在4%PFA中固定24 h，并經(jīng)18%、24%、30%的蔗糖溶液梯度脫水，將組織通過OCT進行包埋。腦組織及脊髓組織均行冠狀面冷凍切片，厚度為20 μm，于低溫冰箱凍存，備用。

1.2.5免疫組織化學染色 小鼠組織切片經(jīng)0.3% Triton X-100通透30 min，10%驢血清封閉30 min，一抗4 ℃孵育過夜后，Jackson二抗室溫孵育1 h，F(xiàn)luore G Mounting封片。使用激光共聚焦顯微鏡采集免疫組化圖像，通過ImageJ軟件分析熒光強度。

1.2.6透射電子顯微鏡觀察 各組剩余3只小鼠用0.01 mmol/L PBS經(jīng)心灌注后再行2.5%戊二醛溶液經(jīng)心灌注。取出小鼠T10脊髓組織后，固定于4%戊二醛溶液中，用冰盒運送到重慶醫(yī)科大學生命科學院，由技術人員進行脫水、包埋、固定和超薄切片。切片為損傷中心的背側皮質(zhì)脊髓束，厚度為100 nm。圖像的放大倍數(shù)為12 000倍。髓鞘厚度及G-ratio值(軸突直徑占整個神經(jīng)纖維直徑的比值)通過ImageJ軟件計算。

1.2.7小鼠曠場試驗BMS評分 手術前1 d將正常小鼠置于曠場內(nèi)熟悉環(huán)境，術后第1天開始進行BMS評分，觀察時間為4min，攝像機錄下視頻后用電腦進行分析。評估時間點為腹腔注射1、2、4周。

1.2.8不規(guī)則水平樓梯試驗 水平橫梯跑道(長×寬：80 cm×50 cm)由兩塊有機玻璃組成，橫梯間隔為1.3 cm。動物飼養(yǎng)籠放置于跑道末端誘導動物通過橫梯跑道回籠，通過攝像機記錄小鼠跑過31個橫梯的情況。每次實驗前隨機抽掉5根橫梯制成無規(guī)律間隔跑道(最大間隔為兩個橫梯)。實驗結束后，志愿者逐幀分析左后肢踩空和滑落橫梯的情況，計算錯誤步數(shù)占總步數(shù)的比率，評價小鼠左后肢在水平樓梯上的抓握控制能力。檢測時間點為腹腔注射1、2、4周。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS 23.0、GraphPad Prism 6 以及Image J-win64軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料若滿足正態(tài)分布，則采用±s表示。兩組比較，若符合正態(tài)分布和方差齊性，則采用t檢驗；若不滿足正態(tài)分布或方差齊性，則采用秩和檢驗。三組及以上且存在多個時間點的數(shù)據(jù)采用雙因素方差分析(Two-way ANOVA)并行Tukey事后多重比較。 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1DRE ADDs技術對神經(jīng)元電活動的影響 小鼠初級運動皮質(zhì)(M1)大量神經(jīng)元表達腺相關病毒的標簽蛋白mCitrine(GFP熒光染色)，通過與神經(jīng)元特異性標記物NeuN雙染，證實病毒成功感染皮質(zhì)神經(jīng)元(圖1)。免疫熒光染色結果可見，三組GFP標記的腺相關病毒感染神經(jīng)元細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；假手術組與SCI組皮質(zhì)神經(jīng)元細胞的cFos表達均較少，而在激活組中，cFos蛋白的表達量明顯增加，其熒光強度[(4.230±0.633)×104AU]明顯高于假手術組及SCI組[分別為(2.125±0.405)×104AU和(2.770±0.395)×104AU]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001，圖2)。

2.2增強神經(jīng)元電活動對軸突髓鞘再生的促進作用 髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein，MBP)及軸突(axon，通過SMI312/NF200標記)免疫熒光共染結果顯示，激活組熒光強度高于S CI 組[(1.952±0.240)×107AU vs. (0.191±0.124)×107AU]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001，圖3)。

透射電鏡結果可見，腹腔注射4周后，與SCI組比較，激活組左側背側皮質(zhì)脊髓束髓鞘較厚，其G-ratio值(0.787±0.111)與SCI組(0.871±0.080)及假手術組(0.584±0.101)比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001，P<0.05，圖4)。

圖1 小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元腺相關病毒感染情況Fig.1 Adeno-associated virus infection of cortical neuron in rats

圖2 小鼠GFP及cFos免疫熒光染色結果 (×200)Fig.2 GFP and cFos immunofluorescence staining (×200)

2.3增強神經(jīng)元電活動對小鼠運動功能恢復的促進作用 腹腔注射1、2、4周，三組BMS評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。不規(guī)則水平樓梯試驗結果顯示，腹腔注射1周，激活組及SCI組的錯誤率均高于假手術組(P=0.001)；腹腔注射2周，激活組與SCI組的錯誤率降低，且激活組的錯誤率明顯低于SCI組(P<0.001)，但高于假手術組(P<0.001)；腹腔注射4周，激活組與SCI組的錯誤率仍高于假手術組(P<0.001)，但激活組與SCI組的錯誤率持續(xù)降低，且激活組的錯誤率明顯低于SCI組(P<0.001，表1)。

圖3 MBP與SMI312/NF200免疫雙標情況Fig.3 MBP and SMI312/NF200 immunofluorescence costaining

3 討 論

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如多發(fā)性硬化和脊髓損傷中，病理性脫髓鞘現(xiàn)象廣泛存在。軸突髓鞘化是一個復雜的過程，不僅受到各種轉錄因子(如Olig2等)的調(diào)控，還受細胞外環(huán)境(損傷微環(huán)境、軸突本身)的影響[15]。研究顯示，上調(diào)轉錄因子Olig2或其他分子可以促進少突膠質(zhì)細胞前體細胞(oligodendrocyte precursor cells，OPCs)的增殖和軸突髓鞘化[4,16]，但這些研究采用的干預措施多為脊髓局部病毒注射，臨床轉化時相對困難。由于脊髓損傷后的局部微環(huán)境非常復雜，通過改善微環(huán)境促進再生軸突髓鞘化修復仍充滿不確定性[17]。因此，從軸突電活動的調(diào)節(jié)入手，促進髓鞘再生修復成為重要的備選措施之一，也是本研究的出發(fā)點。為了最大限度保留軸突，本研究采用小鼠輕度脊髓挫裂損傷模型，以造成軸突的脫髓鞘改變，方便后續(xù)觀察，與Li等[9]的研究方法一致。

圖4 背側皮質(zhì)脊髓束透射電鏡觀察結果Fig.4 TEM of dorsal corticospinal tract

表1 小鼠行為學試驗結果(±s, n=11)Tab.1 Behavioral test results of mice (±s, n=11)

表1 小鼠行為學試驗結果(±s, n=11)Tab.1 Behavioral test results of mice (±s, n=11)

SCI. 脊髓損傷；與假手術組比較，(1)P<0.001；與SCI組比較，(2)P<0.001。

有研究發(fā)現(xiàn)，切斷8 d齡(P8)大鼠的一側視神經(jīng)，可在短期內(nèi)(4 d)引起該側增殖OPCs數(shù)量下降90%[18]。體外實驗發(fā)現(xiàn)，背根神經(jīng)節(jié)細胞的動作電位樣放電會影響共培養(yǎng)體系中OPCs的分化及髓鞘發(fā)育[19]。另有研究發(fā)現(xiàn)，使用光/化學遺傳學技術調(diào)控皮質(zhì)神經(jīng)元電活動后，可觀察到實驗動物腦白質(zhì)OPCs的增殖反應及軸突髓鞘化增強[14,20]。本研究采用了新興的化學遺傳學技術DREADDs來提高小鼠大腦M1神經(jīng)元電活動，結果顯示，皮質(zhì)神經(jīng)元電活動的提高可以誘導MPB的表達增加，且透射電鏡觀察到激活組的G-ratio值明顯小于SCI組，說明軸突髓鞘得到了更好的修復，該結果與前期報道一致。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，通過單獨飼養(yǎng)以對動物進行人為隔離，結果會損害其額葉皮質(zhì)的髓鞘化進 程[21]，從反面說明了神經(jīng)元電活動依賴的髓鞘修復在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患中的重要意義。

電活動誘導髓鞘修復的機制目前尚不清楚。電鏡下觀察到的非突觸“軸突-膠質(zhì)”鏈接被認為可能是電活動調(diào)控髓鞘形成的結構基礎[22]。軸突通過囊泡釋放或非囊泡釋放的方式將神經(jīng)遞質(zhì)(如谷氨酸)釋放至胞外。少突膠質(zhì)細胞膜受體(如AMPAR)與谷氨酸結合并激活髓鞘相關蛋白的表達[2,23]，從而使得髓鞘更傾向于在電活動水平較高的軸突上延伸[24]。近來研究發(fā)現(xiàn)，腦干OPCs細胞膜上的鈉通道(Nav1.2)也參與了軸突-膠質(zhì)信號的轉導過程；當谷氨酸受體激活后，Ca2+、Na+內(nèi)流可刺激OPCs出現(xiàn)動作電位樣放電，并誘導髓鞘發(fā)育[25]?？傮w來講，既往研究多集中在“軸突-膠質(zhì)”的細胞間信號傳遞層面，對電活動調(diào)控髓鞘形成的下游機制缺乏深入探索，這也是下一步研究需要關注的方向。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，三組小鼠的BMS評分未出現(xiàn)明顯差異，主要原因可能是本實驗對小鼠造成的損傷較輕，軸突以脫髓鞘改變?yōu)橹?，而小鼠BMS量表主要反映小鼠四肢的粗大運動。另外，通過不規(guī)則水平樓梯試驗進一步評測小鼠左后肢技巧性運動功能，發(fā)現(xiàn)在腹腔注射2周后，激活組錯誤率明顯低于SCI組(P<0.001)，且在腹腔注射4周后，激活組和SCI組的錯誤率持續(xù)下降，但激活組的錯誤率明顯低于SCI組(P<0.001)，提示增強神經(jīng)元電活動能有效促進小鼠SCI后技巧性運動功能的恢復。

綜上所述，本研究利用DREADDs技術提高了大腦皮質(zhì)神經(jīng)元電活動，發(fā)現(xiàn)其能有效促進脊髓輕度挫裂傷后的髓鞘再生修復及運動功能恢復，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾患的治療提供了新的思路。