楊昆鵬 王立平 黃菊 陳冬雪 趙鵑

心力衰竭(心衰)是大多數(shù)心血管疾病的終末階段，嚴(yán)重威脅人類健康[1]。心衰的主要病理生理學(xué)機(jī)制較為復(fù)雜，包括心室重構(gòu)、炎性反應(yīng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)激活、氧化應(yīng)激等，其中，炎性反應(yīng)在心衰的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[2]。細(xì)胞焦亡是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型促炎性程序性死亡，與多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)；消化道皮膚素D(GSDMD)是細(xì)胞焦亡的中樞效應(yīng)蛋白，可能參與上皮細(xì)胞的發(fā)育、凋亡、炎性反應(yīng)、癌變及免疫系統(tǒng)疾病等多個病理生理過程[3]。

1 GSDMD蛋白

1.1 GSDMD蛋白的結(jié)構(gòu)

Gasdermins(GSDMs)家族是近年發(fā)現(xiàn)的蛋白家族，包括GSDMA、GSDMB、GSDMC、GSDMD、GSDME和Pejvakin(PJVK，又稱DFNB59)等6種蛋白，GSDMD是目前研究最多的蛋白，并在細(xì)胞焦亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用。2015年，Shi等[4]利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)，分別對小鼠巨噬細(xì)胞中胱天蛋白酶(caspase)-1和caspase-11介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡途徑進(jìn)行全基因組范圍的遺傳篩選，證實(shí)了GSDMD的存在。

GSDMD由3部分組成：(1)含242個氨基酸的N末端結(jié)構(gòu)域(GSDMD-NT)；(2)含43個氨基酸的結(jié)構(gòu)域連接物；(3)含199個氨基酸的C末端結(jié)構(gòu)域(GSDMD-CT)[5]。GSDMD特殊的雙結(jié)構(gòu)域可起到自抑制作用，即GSDMD-CT與GSDMD-NT結(jié)合可以相互抑制[6]。GSDMD經(jīng)caspase-1/4/5/11裂解后，去除了GSDMD-CT及其自抑制作用，釋放出具有成孔活性的GSDMD-NT。Kayagaki等[7]研究發(fā)現(xiàn)，GSDMD-NT過表達(dá)可以加速細(xì)胞焦亡過程，而完整的GSDMD或切割后形成的GSDMD-CT不具有細(xì)胞毒性，且胞質(zhì)中GSDMD-CT的表達(dá)水平顯著高于GSDMD-NT[8]。Aglietti等[9]研究發(fā)現(xiàn)，GSDMD活化后，GSDMD-CT溶解在胞質(zhì)中，而GSDMD-NT則結(jié)合在脂質(zhì)體上。Ding等[10]研究發(fā)現(xiàn)，GSDMD-NT可以特異地結(jié)合在以磷脂酰肌醇或心磷脂為主要成分的質(zhì)膜的脂質(zhì)體上。這些研究提示GSDMD-NT能夠與生物膜結(jié)合。

1.2 GSDMD的成孔作用

在Caspase介導(dǎo)的炎性反應(yīng)中，GSDMD裂解可去除無活性的GSDMD-CT，釋放出有活性的GSDMD-NT。Liu等[11]觀察到GSDMD-NT是高分子量低聚物，可以在非還原性或天然聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行遷移，表明GSDMD-NT的齊聚性質(zhì)。經(jīng)過差速離心，高分子量GSDMD-NT低聚物僅存在于細(xì)胞膜組分中，而完整的GSDMD存在于胞漿中，免疫熒光共聚焦顯微鏡下可見GSDMD-NT能從細(xì)胞漿向細(xì)胞膜遷移。

蛋白質(zhì)脂質(zhì)結(jié)合分析結(jié)果顯示，GSDMD-NT可以與細(xì)胞膜的成分磷脂酰肌醇磷酸酯、磷脂酰肌醇、磷脂酸以及磷脂酰絲氨酸等結(jié)合。Ding等[10]在脂質(zhì)體滲漏試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，GSDMD-NT能夠分解含有磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇單磷酸、磷脂酰肌醇二磷酸或心磷脂的脂質(zhì)體膜，表明GSDMD-NT可在脂質(zhì)雙層上打孔，從而破壞細(xì)胞。采用負(fù)染色電子顯微鏡觀察GSDMD-NT對脂質(zhì)體的作用時，可觀察到GSDMD-NT在脂質(zhì)體的胞膜上形成內(nèi)徑15 nm、外徑32 nm的環(huán)狀孔洞，證實(shí)GSDMD-NT在質(zhì)膜上可以形成足夠大的孔洞，有利于直徑≤10 nm的小分子自由通過。

2 細(xì)胞焦亡

細(xì)胞焦亡是伴隨炎性反應(yīng)的細(xì)胞程序性死亡方式[12]，需要依賴caspase-1/4/5/11的活性，這是與細(xì)胞凋亡的區(qū)別所在。細(xì)胞焦亡的特征包括GSDMs家族介導(dǎo)的質(zhì)膜孔洞形成，細(xì)胞腫脹，質(zhì)膜破裂，細(xì)胞內(nèi)促炎性細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-18、高遷移率族蛋白B1(HMGB1)的釋放等[13]。GSDMD作為細(xì)胞焦亡的直接和最終執(zhí)行者，在被caspase-1/4/5/11激活后，裂解形成GSDMD-NT，通過在細(xì)胞膜上形成孔洞觸發(fā)細(xì)胞焦亡的發(fā)生。

炎性小體是免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在多種免疫細(xì)胞中表達(dá)并可被多種因子激活，引發(fā)細(xì)胞焦亡。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3(NLRP3)是研究較為廣泛的炎性小體，可以識別細(xì)菌等病原體相關(guān)分子模式(PAMP)，也可以識別膽固醇等危險相關(guān)分子模式(DAMP)。在經(jīng)典的細(xì)胞焦亡途徑中，NLRP3可被PAMP和DAMP激活，繼而與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)結(jié)合并招募caspase-1前體組成NLRP3炎性體，活化caspase-1?；罨蟮腸aspase-1一方面可切割I(lǐng)L-18前體(pro-IL-18)和IL-1β前體(pro-IL-1β)，使其成為有活性的IL-18和IL-1β，另一方面也可以切割GSDMD形成GSDMD-NT和GSDMD-CT，GSDMD-NT與細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合形成孔洞，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，IL-18和IL-1β等細(xì)胞因子釋放，引起細(xì)胞焦亡(見圖1A)[11]。在非經(jīng)典的細(xì)胞焦亡途徑中，人的caspase-4/5和小鼠的caspase-11在識別并結(jié)合脂多糖后被激活，活化的caspase-4/5/11既能通過裂解GSDMD誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡，又能通過GSDMD-NT激活caspase-1，從而介導(dǎo)經(jīng)典途徑細(xì)胞焦亡的發(fā)生，這間接表明經(jīng)典與非經(jīng)典途徑細(xì)胞焦亡相互聯(lián)系并可相互轉(zhuǎn)化(見圖1B)[14]。

注：A為經(jīng)典途徑；B為非經(jīng)典途徑；PAMP為病原體相關(guān)分子模式；DAMP為危險相關(guān)分子模式；LPS為脂多糖；GSDMD為消化道皮膚素D；IL-18為白細(xì)胞介素-18；IL-1β為白細(xì)胞介素-1β；NLRP3為核苷酸寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3；caspase為胱天蛋白酶；ASC為凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白

3 GSDMD介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在心衰形成中的作用

GSDMD作為細(xì)胞焦亡經(jīng)典與非經(jīng)典途徑中的共同底物和執(zhí)行者，介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡往往伴隨著大量細(xì)胞因子的產(chǎn)生，這些細(xì)胞因子可以通過各種方式使心肌細(xì)胞受損、心肌功能紊亂、心室重構(gòu)，最終導(dǎo)致心衰。Murphy等[15]研究發(fā)現(xiàn)，抑制炎性反應(yīng)可以減少細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而減少心肌細(xì)胞死亡數(shù)量，改善心衰患者的心功能。

3.1 NLRP3與心衰

NLRP3炎性小體是大分子多蛋白復(fù)合體，在細(xì)胞焦亡途徑中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)心肌細(xì)胞壓力超負(fù)荷時，在鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(Ca+/CaMKⅡ)信號通路的介導(dǎo)下，NLRP3炎性小體等炎性因子激活，并參與心室重構(gòu)的病理過程[16]。Bai等[17]發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性小體等的激活可以加速氧化應(yīng)激及心血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，導(dǎo)致組織水腫、血栓形成及慢性炎性反應(yīng)，加速心衰等心血管事件的發(fā)生。Li等[18]在小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，抑制NLRP3炎性小體可以減輕心臟炎性反應(yīng)及纖維化，改善心臟的收縮與舒張功能，從而改善心室重構(gòu)。NLRP3炎性小體可促發(fā)下游IL-18及IL-1β等的成熟與釋放，該反應(yīng)可被腫瘤壞死因子(TNF)-α及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)放大，引起炎性級聯(lián)瀑布反應(yīng)；NLRP3還可導(dǎo)致促纖維化基因的表達(dá)，使心臟功能受損，NLRP3炎性小體在心衰發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[19]。

3.2 IL-18與心衰

IL-18是廣泛存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞上的具有多種生物學(xué)特性的炎性細(xì)胞因子，在基礎(chǔ)狀態(tài)下以前體的形式存在于細(xì)胞中，在組織損傷等應(yīng)激反應(yīng)時可以迅速釋放入血。O′Brien等[20]研究發(fā)現(xiàn)，IL-18在心衰中發(fā)揮重要作用，可作為心衰的治療靶點(diǎn)，使用IL-18抑制劑可減緩心衰的進(jìn)展。Segiet等[21]的研究闡明IL-18等相關(guān)細(xì)胞因子在心肌損傷到心衰轉(zhuǎn)變過程中的重要性，IL-18可作為心衰標(biāo)志物及死亡率的預(yù)測指標(biāo)。IL-18致心衰的機(jī)制尚不完全清楚，推測其可能與下列因素有關(guān)：IL-18可以通過誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β及IL-6等促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大、心腔擴(kuò)張及心肌細(xì)胞凋亡；IL-18可與相關(guān)受體結(jié)合，促使心肌肥厚，影響心臟收縮力；IL-18可直接激活細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，使心臟射血分?jǐn)?shù)下降，進(jìn)一步導(dǎo)致心功能不全。

3.3 IL-1β與心衰

IL-1β又稱淋巴細(xì)胞活化因子，是較強(qiáng)的促炎性細(xì)胞因子，主要由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，活化后可通過多種途徑參與心衰的發(fā)生發(fā)展。Harouki等[22]利用大鼠構(gòu)建心衰模型發(fā)現(xiàn)，IL-1β可使心肌膠原蛋白累積，心肌活性氧水平增加，從而加速心衰進(jìn)程。給予大鼠皮下注射IL-1β拮抗劑，可有效減輕氧化應(yīng)激及炎性反應(yīng)，延緩心室重構(gòu)，提高射血分?jǐn)?shù)，這與Shang等[23]的報道相吻合。有報道稱在小鼠心室肌細(xì)胞中，IL-1β可降低L型鈣通道的密度，影響鈣離子內(nèi)流，從而影響心肌收縮力，誘發(fā)心律失常與心衰[24]。IL-1β在心衰患者的疾病進(jìn)展及預(yù)后評估中發(fā)揮重要作用，但是IL-1β在心衰病理生理中的具體機(jī)制尚未完全證實(shí)。

3.4 HMGB1與心衰

HMGB1是GSDMD參與介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡途徑中的重要炎性細(xì)胞因子，廣泛分布于心、肝、肺等多種臟器及組織中，可作為反映心衰患者心肌細(xì)胞炎性反應(yīng)活動度的指標(biāo)。有研究報道，慢性心衰患者血清HMGB1水平顯著升高，且HMGB1水平與N末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)呈正相關(guān)，與射血分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)，并且認(rèn)為HMGB1水平可以作為慢性心衰患者危險分層的新型指標(biāo)[25]，這與Marsh等[26]的研究結(jié)果有相似之處。Lin等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷小鼠模型中，HMGB1水平顯著升高，并且伴隨IL-1、IL-6、TNF-α等炎性細(xì)胞因子的升高，HMGB1抑制劑丙酮酸乙酯可以有效降低HMGB1水平，減輕炎性反應(yīng)程度，改善心功能。

4 GSDMD的靶向治療策略

由于GSDMD誘導(dǎo)的孔洞形成可能是許多疾病發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，確定靶向GSDMD的藥物具有重大意義。研究發(fā)現(xiàn)，GSDMD抑制劑壞死磺酰胺(NSA)可與C191氨基酸結(jié)合，抑制GSDMD-NT結(jié)構(gòu)域的低聚化[28]。Rashidi等[29]測試NSA對尿酸晶體的反應(yīng)時，發(fā)現(xiàn)NSA具有調(diào)控GSDMD上游因子ASC聚集的作用，可阻止外源性脂多糖的刺激，降低IL-1β前體(pro-IL-1β)的表達(dá)。Hu等[30]研究發(fā)現(xiàn)，治療酒精成癮的藥物雙硫侖也是脂質(zhì)體中GSDMD孔洞形成的抑制劑。雙硫侖雖然不影響IL-1β和GSDMD的活化，但可作用于C191/192的殘基，阻斷孔洞的形成，從而阻止IL-1β釋放和細(xì)胞焦亡的發(fā)生。

Do Carmo等[31]發(fā)現(xiàn)VX-765是一種高度選擇性caspase-1抑制劑，可以減少缺血再灌注損傷模型中梗死心肌細(xì)胞數(shù)量。此外，VX-765提供的保護(hù)作用超過了單純使用血小板抑制劑的作用[32]。Audia等[33]研究發(fā)現(xiàn)，VX-765與P2Y12受體拮抗劑聯(lián)合使用，可縮小心肌梗死范圍并保護(hù)左室功能。

5 小結(jié)

GSDMD作為細(xì)胞焦亡過程中的關(guān)鍵蛋白，通過經(jīng)典及非經(jīng)典的細(xì)胞焦亡途徑，加速細(xì)胞的損傷和炎性介質(zhì)的釋放，參與心衰的形成與進(jìn)展。GSDMD是炎性反應(yīng)的潛在驅(qū)動因素，以GSDMD為靶點(diǎn)的治療策略將為心衰的防治提供新希望。