王立君 韓俊先 華永芬 王晨晨 李星輝 謝萍

大氣顆粒污染物與心血管系統(tǒng)疾病的相關(guān)性近年來受到關(guān)注。PM2.5是粒徑≤2.5 μm的顆粒和液滴，是常見的大氣污染物。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5水平與心血管疾病死亡有一定聯(lián)系[1]。PM2.5會(huì)引起炎性反應(yīng)并加速動(dòng)脈粥樣硬化，影響血管功能，引發(fā)心血管疾病。基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)為含鋅內(nèi)肽酶家族，可以調(diào)節(jié)血管細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解，參與動(dòng)脈硬化斑塊產(chǎn)生和破裂[2-3]。MMP-2和MMP-9為降解彈性膠原的主要成分，與平滑肌細(xì)胞遷移和增殖密切相關(guān)，可促進(jìn)動(dòng)脈硬化發(fā)生發(fā)展[4]?；|(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)是體內(nèi)MMP的天然特異性抑制劑，它可通過共價(jià)鍵與MMP結(jié)合，并與MMP共同維持ECM的動(dòng)態(tài)平衡。ECM動(dòng)態(tài)平衡的破壞可促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和破裂[5-7]。本研究旨在建立沙塵暴PM2.5暴露模型，探討PM2.5對(duì)MMP-2、MMP-9及TIMP表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 PM2.5收集及PM2.5溶液的配制

2018年4月沙塵暴頻發(fā)，在河西走廊非工業(yè)區(qū)使用EOM1405D雙通道顆粒物監(jiān)測(cè)儀采集沙塵顆粒，PM2.5來自系統(tǒng)可更換的TEOM濾膜。將濾膜裁剪成1 cm×3 cm小片，放入超純水中，超聲下震蕩處理0.5 h，共3次。震蕩液經(jīng)紗布過濾，所得濾液在冷凍后進(jìn)行真空干燥處理，獲得PM2.5粉末，置入-20 ℃冰箱保存。使用無菌生理鹽水配制PM2.5溶液，配制時(shí)精確稱量PM2.5粉末量，超聲處理15 min進(jìn)行混勻。

1.2 沙塵暴PM2.5 暴露模型的建立

將36只雄性6周齡ApoE基因敲除小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、PM2.5低劑量暴露組、PM2.5中劑量暴露組、PM2.5高劑量暴露組，測(cè)量小鼠心率、體質(zhì)量、體溫等指標(biāo)。10%水合氯醛麻醉小鼠，仰臥位固定，消毒處理后在頸前正中切口，切口長度約1 cm，組織分離后暴露氣管，刺入針頭后滴入PM2.5溶液，PM2.5低、中、高劑量暴露組的PM2.5溶液濃度分別為1.6、8.0、40.0 mg/L，滴入量為0.15 mL/100 g，對(duì)照組注入生理鹽水，注入量為0.15 mL/100 g，每日滴注1次。飼養(yǎng)20周后脫頸椎處死小鼠，獲取心臟組織，-80 ℃低溫保存。

1.3 Westernblot檢測(cè)MMP-2、MMP-9和TIMP的蛋白表達(dá)水平

RIPA緩沖液裂解蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度。蛋白經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，5%脫脂乳室溫封閉2 h，MMP-2、MMP-9、TIMP一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，ECL染色后，于凝膠成像儀中成像。通過ImageJ軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)MMP-2、MMP-9和TIMP的mRNA表達(dá)水平

Trizol法提取RNA，紫外分析儀檢測(cè)RNA濃度。將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進(jìn)行SYBR Green熒光定量RT-PCR。MMP-2引物序列：上游5′-CAACGGTCGGGAATACAGCA-3′，下游5′-TGGTAAACAAGGCTTCATGGG-3′。MMP-9引物序列：上游5′-TGGTCTTGGAACAGGAGCAAA-3′，下游5′-ACATTCAGTGGTCTCAGCCTTT-3′。TIMP引物序列：上游5′-CTGGCATCTGGCATCCTCTT-3′，下游5′-GGGAACCCATGAATTTAGCCC-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃初始變性5 min，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠心肌細(xì)胞MMP-2的表達(dá)水平比較

4組MMP-2的mRNA及蛋白表達(dá)水平均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)。兩組間比較，PM2.5低劑量暴露組MMP-2的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，PM2.5中劑量暴露組MMP-2的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于PM2.5低劑量暴露組，PM2.5高劑量暴露組MMP-2的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于PM2.5中劑量暴露組(P均<0.05)，見表1。

表1 各組小鼠心肌細(xì)胞MMP-2的表達(dá)水平比較

2.2 各組小鼠心肌細(xì)胞MMP-9的表達(dá)水平比較

4組MMP-9的mRNA及蛋白表達(dá)水平均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)。兩組間比較，PM2.5低劑量暴露組MMP-9的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，PM2.5中劑量暴露組MMP-9的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于PM2.5低劑量暴露組，PM2.5高劑量暴露組MMP-9的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯高于PM2.5中劑量暴露組(P均<0.05)，見表2。

表2 各組小鼠心肌細(xì)胞MMP-9的表達(dá)水平比較

2.3 各組小鼠心肌細(xì)胞TIMP的表達(dá)水平比較

4組TIMP的mRNA及蛋白表達(dá)水平均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均<0.05)。兩組間比較，PM2.5低劑量暴露組TIMP的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯低于PM2.5對(duì)照組，PM2.5中劑量暴露組TIMP的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯低于PM2.5低劑量暴露組，PM2.5高劑量暴露組TIMP的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯低于PM2.5中劑量暴露組(P均<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠心肌細(xì)胞TIMP的表達(dá)水平比較

3 討論

近年來，大氣顆粒物污染有所加重，威脅人類健康。統(tǒng)計(jì)研究發(fā)現(xiàn)，在沙塵暴高發(fā)時(shí)期，受沙塵暴影響區(qū)域醫(yī)院心血管疾病就診人數(shù)大幅度增加，死亡率也明顯升高[8]。大氣顆粒物污染的相關(guān)研究主要針對(duì)呼吸系統(tǒng)毒性方面，較少針對(duì)心血管系統(tǒng)。

長期高濃度PM2.5暴露易引發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[9]，而內(nèi)皮細(xì)胞損傷與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)。血管內(nèi)皮屏障相關(guān)的功能物質(zhì)為ECM，ECM代謝平衡的打破會(huì)導(dǎo)致血管重構(gòu)，顯著增加動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)。MMP可通過特殊類型的連接蛋白結(jié)合ECM，進(jìn)而降解ECM，在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[10]。TIMP屬于MMP的特異性抑制劑，可通過氨基端功能區(qū)的半胱氨酸殘基結(jié)合活化的MMP，形成MMP-TIMP復(fù)合體，從而阻斷MMP與底物的結(jié)合[11]。MMP與內(nèi)源性抑制劑相互協(xié)同，調(diào)節(jié)細(xì)胞活化、增殖、遷移、凋亡、血管生成以及心肌ECM的動(dòng)態(tài)平衡[12-13]。研究表明，小鼠血管內(nèi)膜損傷時(shí)，MMP-2和MMP-9表達(dá)水平升高[14-15]，提示MMP可促進(jìn)內(nèi)膜增厚并加速血管平滑肌細(xì)胞遷移。在MMP-9缺失時(shí)，小鼠內(nèi)膜細(xì)胞的生成也會(huì)出現(xiàn)異?；蜓舆t。

MMP及其抑制劑TIMP是反映動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程的重要標(biāo)志物，本研究主要分析暴露于不同濃度PM2.5時(shí)，MMP及TIMP表達(dá)的變化情況，以闡述ECM失衡對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化疾病發(fā)生發(fā)展的影響及機(jī)制。結(jié)果顯示，暴露于PM2.5的小鼠心肌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平高于正常小鼠，TIMP的表達(dá)水平低于正常小鼠，且MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平隨小鼠PM2.5暴露濃度的增高呈上升趨勢(shì)，TIMP的表達(dá)水平隨小鼠PM2.5暴露濃度的增高呈下降趨勢(shì)。研究結(jié)果提示暴露于PM2.5可以促進(jìn)小鼠心肌細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的表達(dá)，沙塵顆粒物濃度越高，小鼠動(dòng)脈粥樣硬化程度可能越重。

動(dòng)脈粥樣硬化是長期復(fù)雜的病變過程，影響因素較多。在甘肅河西走廊等沙塵暴高發(fā)地區(qū)進(jìn)行冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)防治時(shí)，可以在減少大氣顆粒物控制環(huán)境污染的同時(shí)，分析患者的MMP-2、MMP-9及TIMP表達(dá)水平，以深入探討與ECM動(dòng)態(tài)平衡破壞相關(guān)的冠心病的發(fā)病機(jī)制。