李 玲,李 智,石 玲,李亞玲,何 歡,張亞琳,蘆玉佳,朱 璇
(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院,新疆 烏魯木齊 830052)
杏(Prunus armeniacaL.)屬薔薇科杏屬,是中國原產(chǎn)果樹之一,其風(fēng)味獨(dú)特,深受廣大消費(fèi)者的喜愛[1]。據(jù)2018年數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),新疆杏樹種植面積約為11.13萬 hm2,占全疆果樹種植面積的11.66%,杏果實(shí)產(chǎn)量為93.3萬 t,是疆內(nèi)果品總量的9%[2]。杏是典型的呼吸躍變型果實(shí),在采后貯運(yùn)過程中極易受到病原微生物侵染而腐爛變質(zhì),其中由鏈格孢菌(Alternaria alternata)引起的黑斑病是杏果實(shí)主要的采后病害,可能造成嚴(yán)重的采后損失[3]。目前,國內(nèi)外主要通過化學(xué)藥劑控制杏果實(shí)采后病害,但在實(shí)踐中化學(xué)殺菌劑往往存在過量使用的情況,導(dǎo)致藥物殘留、病原菌產(chǎn)生耐藥性和環(huán)境污染等問題[4-5]。因此,需要尋求一種安全、綠色和有效的杏果實(shí)貯藏技術(shù)。
臭氧作為一種綠色、安全的殺菌劑,2001年被美國食品藥品管理局列入可直接接觸食物的消毒劑[6-7]。有研究表明,臭氧對于真菌、酵母菌、沙門氏菌以及金黃色葡萄球菌等各種致病菌都具有極強(qiáng)的滅菌功效[8]。近年來,臭氧也被應(yīng)用于果蔬貯藏保鮮[9-10],一方面臭氧可以直接抑制病原真菌的菌絲生長與孢子萌發(fā)[11-12];另一方面臭氧作為一種強(qiáng)氧化劑,可通過氧化乙烯抑制果實(shí)的呼吸作用,延緩果蔬的衰老[13];同時(shí)臭氧作為一種誘發(fā)因子,可以誘導(dǎo)增強(qiáng)果蔬采后抗病性[14-15]。
目前,許多研究表明臭氧不僅能夠降低獼猴桃的病害發(fā)生率[16-17],提高草莓[18]和木瓜[19]的品質(zhì),還能延緩甜瓜[20]、芒果[21]的軟化和成熟,但關(guān)于臭氧通過調(diào)控苯丙烷代謝與杏果實(shí)抗病性關(guān)系的相關(guān)報(bào)道較少。因此,本實(shí)驗(yàn)以‘賽買提’杏為材料,采用不同劑量的臭氧對接種A. alternata的杏果實(shí)進(jìn)行熏蒸處理,探究杏果實(shí)抗病性與臭氧調(diào)控苯丙烷代謝的關(guān)系,為杏果實(shí)的貯藏提供理論依據(jù)。
‘賽買提’杏果實(shí),2019年6月22日采自新疆庫車縣烏恰鎮(zhèn)杏果園,選取無蟲害、無損傷、色澤和大小均勻、可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%~13%、硬度為(18.0±0.5)N的杏果實(shí)為實(shí)驗(yàn)果,當(dāng)天運(yùn)回新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)果品采后生理貯運(yùn)研究室后,預(yù)冷24 h。
菌種A. alternata由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室提供。
β-巰基乙醇、L-苯丙氨酸、幾丁質(zhì)、羥胺鹽酸、N-乙酰葡萄糖胺、脫鹽蝸牛酶、昆布多糖、肉桂酸、氧化型輔酶II、葡萄糖-6-磷酸鈉、p-香豆酸、ATP、輔酶A等均為國產(chǎn)分析純。
SKY2000系列氣體檢測報(bào)警儀深圳市元特科技有限公司;HY-004S-4A臭氧發(fā)生器廣州佳環(huán)電器科技有限公司;3H16RI智能高速冷凍離心機(jī)湖南赫西儀器有限公司;手提式壓力蒸汽滅菌鍋北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;UV-1700型紫外-可見分光光度計(jì)上海美析儀器有限公司;SW-CJ-1W潔凈工作臺上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。
1.3.1 損傷接種
參照石玲等[22]的方法并稍作修改。取在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar,PDA)培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d的A. alternata,加入20 mL含0.05%(體積分?jǐn)?shù),后同)Tween-80的無菌水,用無菌藥匙刮下PDA培養(yǎng)基上的孢子,轉(zhuǎn)移到50 mL三角瓶內(nèi),搖晃混勻后用紗布濾除大塊絮狀物,用0.05% Tween-80溶液將孢子懸浮液濃度調(diào)節(jié)至1×106個(gè)/mL。用無菌水和75%乙醇溶液先后擦拭果實(shí)表面,晾干后用滅菌鐵釘在果實(shí)赤道部位刺1 個(gè)直徑為2.5 mm、深度為4 mm的孔,向孔內(nèi)注入15 μL的孢子懸浮液,將接種的一面豎直向上放置,接種后的杏果實(shí)進(jìn)行臭氧處理。
1.3.2 原料處理與分組
臭氧處理在預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上參照劉路[23]的方法進(jìn)行。將200 mg/m3的臭氧氣體充入體積為70 L的密封箱中,下通氣口進(jìn)氣,上通氣口用臭氧濃度檢測儀檢測,充氣到達(dá)指定濃度并穩(wěn)定后,密閉熏蒸30 min,采用間歇熏蒸方法,每7 d處理一次杏果實(shí)。以密封箱不通入臭氧氣體的杏果實(shí)為對照組,密閉放置30 min,每個(gè)處理3 組平行,每組處理3 kg杏果實(shí)。熏蒸后置于冷庫(1~2 ℃、相對濕度90%~95%)中貯藏。
1.3.3 指標(biāo)測定
1.3.3.1 病斑直徑及接種發(fā)病率的測定
以單個(gè)杏果實(shí)病斑直徑達(dá)4 mm以上計(jì)為發(fā)病果實(shí),用十字交叉法測定貯藏期杏果實(shí)的病斑直徑,發(fā)病率按下式計(jì)算。
1.3.3.2 苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸-4-羥化酶、4-香豆酸輔酶A連接酶活力的測定
苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)活力的測定:參考曹建康等[24]的方法,以每克鮮果每小時(shí)在290 nm波長處吸光度變化0.01為1 個(gè)PAL活力單位(U)。
肉桂酸-4-羥化酶(cinnamic acid-4-hydroxylase,C4H)、4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumaric acid CoA ligase,4CL)活力的測定參考范存斐等[25]的方法,以每克鮮果每小時(shí)在340 nm波長處吸光度變化0.01為1 個(gè)C4H活力單位(U),以每克鮮果每小時(shí)在333 nm波長處吸光度變化0.01為1 個(gè)4CL活力單位(U)。
以上酶活力單位均為U/(h·g)。
1.3.3.3β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活力的測定
β-1,3-葡聚糖酶(β-1,3-glucanase,GLU)、幾丁質(zhì)酶(chitinase,CHT)活力測定參照曹建康等[24]的方法。以每秒鐘每克鮮果中酶分解昆布多糖產(chǎn)生1×10-4mol葡萄糖為一個(gè)β-1,3-葡聚糖酶活力單位,以每秒鐘每克鮮果中酶分解膠狀幾丁質(zhì)產(chǎn)生1×10-4molN-乙酰葡萄糖胺為一個(gè)幾丁質(zhì)酶活力單位。Glu、CHT活力單位均為10-4mol/(s·g)。
1.3.3.4 總酚和類黃酮含量的測定
總酚和類黃酮含量的測定參照曹建康等[24]的方法。以每克鮮果在波長280 nm處光密度值表示總酚含量;以每克鮮果在波長325 nm處光密度值表示類黃酮物質(zhì)含量。
利用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析,P<0.05表示差異顯著,使用Origin 8.5軟件作圖。
圖 1 臭氧處理對損傷接種A. alternata杏果實(shí)病斑直徑(A)和發(fā)病率(B)的影響Fig. 1 Effect of ozone treatment on lesion diameter (A) and the incidence of black spot disease (B) in apricot fruit inoculated with A. alternata
如圖1A所示,杏果實(shí)損傷接種A. alternata后,杏果實(shí)病斑直徑在整個(gè)貯藏期間呈現(xiàn)不斷上升的趨勢,但臭氧處理組的杏果實(shí)病斑直徑始終低于對照組,且在貯藏21 d后,兩組間杏果實(shí)的病斑直徑呈現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)。如圖1B所示,杏果實(shí)接種發(fā)病率隨著貯藏時(shí)間的延長而呈現(xiàn)逐漸上升趨勢,在貯藏第7天時(shí),臭氧處理組損傷接種的杏果實(shí)無發(fā)病現(xiàn)象,而對照組損傷接種的杏果實(shí)已經(jīng)發(fā)病。貯藏結(jié)束時(shí),臭氧處理的果實(shí)接種發(fā)病率比對照低14.07%(P<0.05)。說明臭氧處理可明顯抑制杏果實(shí)病斑直徑的擴(kuò)大和降低杏果實(shí)接種發(fā)病率。
圖 2 臭氧處理對杏果實(shí)貯藏過程中PAL活力的影響Fig. 2 Effect of ozone treatment on PAL activity in apricot fruit
PAL作為苯丙烷代謝中的關(guān)鍵酶,與植物的抗病性關(guān)系密切[26]。從圖2可知,臭氧處理組和對照組的杏果實(shí)PAL活力都是呈先上升后下降趨勢,但在整個(gè)貯藏期內(nèi),臭氧處理組的杏果實(shí)PAL活力顯著高于對照組的。在貯藏14 d時(shí),臭氧處理組和對照組的PAL活力都達(dá)到峰值,其中臭氧處理組PAL活力是對照組的1.53 倍(P<0.05)。貯藏結(jié)束時(shí),臭氧處理組PAL活力是對照組的4.94 倍(P<0.05),表明臭氧可以有效減緩杏果實(shí)的PAL活力降低,提高杏果實(shí)抗病性。
圖 3 臭氧處理對杏果實(shí)貯藏過程中C4H活力的影響Fig. 3 Effect of ozone treatment on C4H activity in apricot fruit
由圖3可發(fā)現(xiàn),在貯藏的0~28 d,臭氧處理組和對照組的杏果實(shí)C4H活力均呈上升趨勢,無明顯差異。但在貯藏28 d后,對照組的C4H活力逐漸下降,臭氧處理組的C4H活力仍繼續(xù)上升,且在貯藏42 d達(dá)到峰值,與對照組相比差異顯著。在貯藏結(jié)束時(shí),臭氧處理組C4H活力是對照組的1.16 倍(P<0.05)。
如圖4所示,在貯藏期間,對照組的杏果實(shí)4CL活力呈緩慢下降趨勢,而臭氧處理組的4CL活力總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢,臭氧處理杏果實(shí)的4CL活力始終顯著高于對照杏果實(shí)。貯藏第35天時(shí),臭氧處理組的4CL活力達(dá)到峰值,是此時(shí)對照組的1.62 倍(P<0.05)。在貯藏35 d后,臭氧處理組杏果實(shí)的4CL活力下降,但始終顯著高于對照組(P<0.05)。
圖 4 臭氧處理對杏果實(shí)貯藏過程中4CL活力的影響Fig. 4 Effect of ozone treatment on 4CL activity in apricot fruit
圖 5 臭氧處理對杏果實(shí)貯藏過程中GLU活力的影響Fig. 5 Effect of ozone treatment on GLU activity in apricot fruit
GLU是重要的病程蛋白,對病原菌有直接的殺菌作用[27]。由圖5可知,對照組和臭氧處理組的杏果實(shí)GLU活力整體上均先升高后下降,但在貯藏期間,臭氧處理組的GLU活力顯著高于對照組。在貯藏21 d時(shí),對照組的GLU活力達(dá)到峰值,而臭氧處理組在第7天就達(dá)峰值,一直維持到21 d后才開始下降,在第21天時(shí),臭氧處理組的GLU活力是對照組的1.66 倍(P<0.05)。在貯藏21 d后,對照組和臭氧處理組的杏果實(shí)GLU活力均呈下降趨勢,但臭氧處理組的GLU活力始終顯著高于對照組,說明臭氧處理可以延緩杏果實(shí)GLU活力下降,增強(qiáng)杏果實(shí)對病害的抵御能力。
圖 6 臭氧處理對杏果實(shí)貯藏過程中CHT活力的影響Fig. 6 Effect of ozone treatment on CHT activity in apricot fruit
如圖6所示,處理組和對照組的杏果實(shí)貯藏過程中CHT活力均呈先上升后下降的趨勢。在貯藏42 d時(shí),臭氧處理組和對照的貯藏過程中CHT活力均達(dá)到峰值,其中臭氧處理組的貯藏過程中CHT活力是對照組的1.58 倍(P<0.05)。在第49天時(shí),兩組貯藏過程中CHT活力都下降,其中臭氧處理組的貯藏過程中CHT活力顯著是對照組的1.73 倍(P<0.05)。
圖 7 臭氧處理對杏果實(shí)貯藏過程中總酚(A)和類黃酮(B)含量的影響Fig. 7 Effect of ozone treatment on total phenolic (A) and flavonoid (B)contents in apricot fruit
由圖7A可知,在貯藏期間,臭氧處理組和對照組的總酚含量均呈先上升后下降趨勢,臭氧處理組的杏果實(shí)總酚含量比對照組高。在貯藏35 d時(shí),對照組出現(xiàn)峰值,而臭氧處理組在貯藏42 d時(shí)出現(xiàn)峰值。貯藏結(jié)束時(shí),臭氧處理組總酚含量比對照組高8.9%(P<0.05)。
如圖7B所示,在貯藏期間,臭氧處理組的杏果實(shí)類黃酮含量呈現(xiàn)上升趨勢,對照組果實(shí)的類黃酮含量呈波動上升趨勢,但臭氧處理組的杏果實(shí)類黃酮含量整體上顯著高于對照組。在貯藏21 d時(shí),臭氧處理組的杏果實(shí)類黃酮比對照組高12.20%(P<0.05)。貯藏第49天,臭氧處理組的類黃酮含量是對照組的1.15 倍(P<0.05)。
已有的研究結(jié)果表明,適宜濃度的臭氧處理可以有效抑制果蔬采后病害的發(fā)生[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,200 mg/m3臭氧處理能有效抑制杏果實(shí)病斑直徑的擴(kuò)展,顯著降低杏果實(shí)損傷接種發(fā)病率。郭宇歡等[28]研究發(fā)現(xiàn)90 μL/L臭氧處理葡萄15 min,可明顯降低‘紅地球’葡萄灰霉病的發(fā)病率。臭氧處理能夠抑制果蔬采后病害的發(fā)病,一方面是因?yàn)槌粞跆幚砜梢灾苯右种撇≡婢木z生長和孢子萌發(fā)。Luo Anwei等[17]對獼猴桃的研究指出,適宜濃度的臭氧處理能夠有效抑制灰葡萄孢(Botrytis cinerea)和擴(kuò)展青霉(Penicillium expansum)的菌絲生長和孢子萌發(fā)。García-Martín等[29]對柑橘的研究表明,1.6 mg/kg臭氧處理可以顯著抑制指狀青霉(Penicillium digitatum)和意大利青霉(Penicillium italicum)的菌絲生長。另一方面,臭氧增強(qiáng)果蔬的抗病性可能與調(diào)控抗病相關(guān)代謝途徑有關(guān)[13,30]。苯丙烷代謝途徑是果蔬抗病反應(yīng)中的關(guān)鍵代謝途徑,PAL、C4H和4CL是催化苯丙烷代謝的關(guān)鍵酶。其中PAL作為苯丙烷代謝中的關(guān)鍵酶和限速酶,能夠促進(jìn)合成抗菌物質(zhì)如酚類、植保素等,植物的抗病性與這些物質(zhì)密切相關(guān)[26]。C4H作為繼PAL之后苯丙烷代謝的又一關(guān)鍵酶,參與生成p-香豆酸,C4H活力的增強(qiáng)可促進(jìn)酚酸類物質(zhì)的合成,抑制病原菌的生長和繁殖[31]。4CL控制苯丙烷代謝主途徑向分支途徑的轉(zhuǎn)折[32]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,200 mg/m3臭氧處理顯著提高了杏果實(shí)PAL、C4H和4CL的活力。蘇苗[33]研究表明,臭氧降低獼猴桃病害的發(fā)生與PAL活力的增加相關(guān)。水楊酸和24-表油菜素內(nèi)酯處理杏果實(shí)的研究也表明,其可以通過誘導(dǎo)杏果實(shí)PAL、C4H和4CL活力的升高,增強(qiáng)杏果實(shí)采后的抗病性[34-35]。說明臭氧處理增強(qiáng)杏果實(shí)抗病性與苯丙烷代謝的調(diào)控密切相關(guān)。
GLU和CHT是果蔬中的病程相關(guān)蛋白[36],可以使真菌細(xì)胞壁受到損壞,抑制真菌的生長繁殖和提高植物的抗病害能力[27,37]。Luo Anwei等[17]研究表明,適宜劑量的臭氧處理增強(qiáng)獼猴桃的抗病性與GLU和CHT活力的提高密切相關(guān)。郭宇歡[38]對葡萄的研究發(fā)現(xiàn),90 μL/L臭氧處理可以通過提高葡萄中GLU和CHT的活力,降低灰霉菌對葡萄的侵染。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),200 mg/m3臭氧處理顯著提高杏果實(shí)GLU和CHT的活力,增強(qiáng)杏果實(shí)的抗病性,與上述研究結(jié)果相同。
總酚和類黃酮是苯丙烷類代謝途徑的最終產(chǎn)物。酚類物質(zhì)自身具有抗病害能力,可抑制病原微生物的繁殖,同時(shí)又參與合成木質(zhì)素,類黃酮則是重要的植保素,其含量反映了植物的抗病性[39]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,200 mg/m3臭氧處理有利于類黃酮和總酚的積累。Chen Cunkun等[40]指出,適宜濃度的臭氧處理可有效促進(jìn)草莓總酚和類黃酮含量的積累,有助于提高草莓抗病性。Yeoh等[41]對鮮切木瓜的研究發(fā)現(xiàn),9.2 μL/L臭氧處理20 min,臭氧處理組總酚含量的積累與鮮切木瓜抗病性的提高相關(guān)。綜上,總酚和類黃酮含量的積累是增強(qiáng)杏果實(shí)抗病性的重要因素之一。
本實(shí)驗(yàn)表明,200 mg/m3臭氧處理能夠有效抑制病斑直徑的擴(kuò)展和顯著降低杏果實(shí)的接種發(fā)病率,提高了杏果實(shí)的PAL、C4H、4CL、GLU和CHT活力及總酚和類黃酮的含量,表明臭氧可通過調(diào)控杏果實(shí)體內(nèi)的苯丙烷代謝相關(guān)酶的活力,增強(qiáng)杏果實(shí)的抗病性。目前,臭氧作為一種低成本且綠色的采后處理,其應(yīng)用前景廣泛,關(guān)于臭氧在果蔬采后領(lǐng)域的應(yīng)用也越來越多,但臭氧的貯藏保鮮效果與貯藏的溫度、果蔬的品種、臭氧處理的劑量等多種因素有關(guān),而且在實(shí)際操作過程中需要提高處理技術(shù)的安全性,因此,臭氧在大規(guī)模引用于商業(yè)貯藏前,很多工作還需完善。