李 陽(yáng)，蘇艷瑜，李國(guó)豪，李 琪，王宇翔，丁玉松

（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院，新疆 石河子 832000）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是由胰島素分泌缺陷和胰島素作用障礙引起的一類慢性疾病[1-3]。在我國(guó)，DM患病人數(shù)持續(xù)增加[4-6]。有研究顯示，2019年全球DM患者已達(dá)到1.16億，預(yù)測(cè)2030年會(huì)增加到1.40億，未來(lái)將會(huì)對(duì)社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)壓力和負(fù)擔(dān)[7-8]。

已有大量研究表明，氧化損傷在DM中起到重要作用，氧化應(yīng)激除直接對(duì)胰島細(xì)胞造成損傷外，還影響胰島素分泌[9-11]。因此，抗氧化治療可能是防治DM的重要途經(jīng)。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）作為目前發(fā)現(xiàn)的重要抗氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子，在應(yīng)激狀態(tài)下啟動(dòng)下游抗氧化酶體系，在DM發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[12]。伏旭等[13]研究顯示，通過(guò)過(guò)表達(dá)Nrf2，誘導(dǎo)其下游抗氧化酶的表達(dá)，能夠減輕大鼠胰腺氧化損傷，從而對(duì)胰腺產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。槲皮素是一種天然的黃酮類化合物，不僅可通過(guò)清除自由基表現(xiàn)出直接的抗氧化作用[14]，還可以激活肝臟中的Nrf2信號(hào)通路表現(xiàn)出間接的抗氧化作用[15]。目前，槲皮素是否能通過(guò)激活胰腺組織中Nrf2通路以拮抗DM大鼠胰腺氧化損傷尚未明確。

本研究旨在探討槲皮素拮抗DM大鼠胰腺氧化損傷的作用機(jī)制，通過(guò)建立2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）大鼠模型，檢測(cè)由DM引起的胰腺氧化損傷，以及槲皮素干預(yù)后Nrf2信號(hào)通路及其下游關(guān)鍵抗氧化酶蛋白和mRNA的表達(dá)，以期為DM對(duì)胰腺組織的氧化損傷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并為槲皮素拮抗DM所致胰腺組織氧化損傷提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)SD大鼠（動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（新）2018-005；生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（新）2018-005），體質(zhì)量（210±10）g，由新疆醫(yī)科大學(xué)提供。

槲皮素上?；瘜W(xué)試劑有限公司；鏈脲佐菌素美國(guó)Sigma公司；A006-2谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測(cè)試劑盒、A001-3超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測(cè)試劑盒、A045-3蛋白標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定試劑盒、A015總抗氧化能力（total antioxidative capability，T-AOC）檢測(cè)試劑盒和A003-1丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒南京建成生物科技有限公司；NADP(H):醌氧化還原酶1（NADP(H):quinone oxido-reductase-1，NQO1）小鼠單克隆抗體（A180）、血紅素氧合酶1（heme oxygenase 1，HO-1）小鼠單克隆抗體、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）pi山羊多克隆抗體、兔多克隆抗體（ab137550）艾博抗（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Accu-Check血糖檢測(cè)儀羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；電子天平德國(guó)賽多利斯儀器有限公司；FA2004B電子精密天平上海精密科學(xué)儀器有限公司；SHA-B恒溫水浴箱上海躍進(jìn)醫(yī)療儀器有限公司；TGL-16G-A高速冷凍離心機(jī)上海安亭化學(xué)儀器有限公司；Mu1iskan MK3酶標(biāo)儀美國(guó)Bio-Rad公司；漩渦振蕩儀上海亞榮分析儀器有限公司；手動(dòng)玻璃勻漿器生工生物工程（上海）股份有限公司；EDC-810實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國(guó)ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 灌胃溶液的配制

低劑量槲皮素混懸液：參考楊冉等[16]的方法，稱取1 g槲皮素溶于50 mL去離子水中，配制質(zhì)量濃度20 mg/mL的槲皮素混懸液；高劑量槲皮素混懸液：稱取1 g槲皮素并溶于25 mL去離子水中，配制質(zhì)量濃度為40 mg/mL的槲皮素混懸液。

1.3.2 動(dòng)物模型的建立

48 只SD大鼠，體質(zhì)量（210±10）g，隨機(jī)選取10 只大鼠作為空白對(duì)照組，將剩余38 只大鼠進(jìn)行T2DM造模。造模具體方法為每天飼喂高脂高糖飼料，飼喂2 周后腹腔注射鏈脲佐菌素30 mg/kgmb，每周1 次，共2 次。以大鼠隨機(jī)血糖濃度不低于16.7 mmol/L作為造模成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)。剔除造模失敗的8 只大鼠，將血糖水平達(dá)標(biāo)的30 只大鼠按血糖濃度分層隨機(jī)分為T2DM模型組、低劑量槲皮素（L-QU）干預(yù)組、高劑量槲皮素（H-QU）干預(yù)組，每組10 只。正常對(duì)照組、T2DM模型組大鼠均灌胃去離子水，L-QU、H-QU干預(yù)組大鼠分別以100、200 mg/kgmb的劑量灌胃相應(yīng)槲皮素混懸液，每天1 次，干預(yù)12 周。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由飲水、攝食，每周定期測(cè)定大鼠體質(zhì)量、血糖水平，觀察并記錄大鼠活動(dòng)情況、飲水量、攝食量、尿液量。

1.3.3 血液標(biāo)本采集和胰腺組織提取

大鼠麻醉后眼球取血，立即離心（3 600 r/min、10 min），收集血清。頸椎脫臼處死大鼠，即刻取出胰腺組織，用預(yù)冷生理鹽水沖洗血漬，待濾紙吸干后，用精準(zhǔn)電子天平稱質(zhì)量。眼科剪分取0.4 g胰腺組織，置于玻璃勻漿管口剪碎，加入9 g/100 mL生理鹽水，充分研磨至無(wú)纖維狀物質(zhì)，制成10 g/100 mL的胰腺組織勻漿，4 ℃、3 600 r/min離心10 min，取上清液，于-20 ℃保存，使用前室溫下解凍。

1.3.4 血清胰島素水平測(cè)定

采用放射免疫法[17]檢測(cè)大鼠血清胰島素水平。胰島素抵抗（homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR）指數(shù)按下式計(jì)算。

1.3.5 胰腺組織氧化和抗氧化指標(biāo)測(cè)定

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，分別采用硫代巴比妥酸法測(cè)定大鼠胰腺組織MDA含量，微量酶標(biāo)法測(cè)定GSH濃度和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力，WST-1法測(cè)定SOD活力，比色法測(cè)定T-AOC，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量。

1.3.6 免疫印跡檢測(cè)胰腺抗氧化酶表達(dá)量

在RIPA裂解液中加入蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置于冰上。蛋白定量后加入上樣緩沖液并煮沸，通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離樣品并轉(zhuǎn)膜。用TBST洗滌3 次后，用牛血清白蛋白封閉2 h，再用TBST洗滌3 次，加入二抗在室溫下孵育，用TBST洗滌3 次，用ECL試劑顯影，以GAPDH為內(nèi)參，通過(guò)光密度法測(cè)定Nrf2、HO-1、GST、NQO1蛋白的相對(duì)表達(dá)量[18]。

1.3.7 實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定Nrf2信號(hào)通路抗氧化酶mRNA表達(dá)量

檢測(cè)Nrf2、GST、HO-1、NQO1mRNA表達(dá)量。TRIzol法提取胰腺組織中總RNA，將符合條件的RNA反轉(zhuǎn)錄成cRNA，反應(yīng)條件：25 ℃、5 min，50 ℃、15 min，85 ℃、5 min，4 ℃、10 min。cDNA進(jìn)行6 倍稀釋，反應(yīng)體系：4 μL 6×cDNA、0.4 μL 10 μmol/L正向引物、0.4 μL 10 μmol/L反向引物、10 μL SYBR Green Master Mix、0.4 μL 50×ROX Reference Dye 2、4.8 μL超純水。反應(yīng)條件：50 ℃、2 min，95 ℃、10 min；95 ℃、30 s，60 ℃、30 s，40 個(gè)循環(huán)。根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，以GAPDH為內(nèi)參，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，以2-ΔΔCt進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。引物序列如表1所示。

表 1 PCR擴(kuò)增基因引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR amplification of genes

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用Graphpad Prism軟件繪圖。數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，結(jié)果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni法。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)期間大鼠一般情況

正常對(duì)照組大鼠一般狀況良好，毛發(fā)光澤、活動(dòng)迅速，攝食量、飲水量、尿液量均正常；T2DM模型組大鼠情況一般較差，精神萎靡、毛發(fā)無(wú)光澤、弓背蜷體、反應(yīng)遲鈍，攝食量、飲水量、尿液量均增加。與T2DM模型組相比，L-QU、H-QU干預(yù)組大鼠的上述癥狀有所改善。

2.2 槲皮素干預(yù)后大鼠體質(zhì)量和血糖的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)

圖 1 槲皮素干預(yù)后T2DM大鼠體質(zhì)量的變化趨勢(shì)Fig. 1 Variation trend of body mass in T2DM rats with quercetin intervention

表 2 槲皮素干預(yù)對(duì)T2DM大鼠體質(zhì)量和血糖濃度的影響Table 2 Effect of quercetin on body mass and blood glucose levels in T2DM rats

由表2可知，各組大鼠初始體質(zhì)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），經(jīng)槲皮素干預(yù)12 周后，與正常對(duì)照組相比，T2DM組大鼠體質(zhì)量顯著下降（P＜0.05）。結(jié)合實(shí)驗(yàn)期間大鼠體質(zhì)量的變化趨勢(shì)（圖1）分析，正常對(duì)照組大鼠體質(zhì)量始終呈上升趨勢(shì)，T2DM組大鼠體質(zhì)量下降幅度最大，L-QU、H-QU干預(yù)組大鼠體質(zhì)量下降幅度較T2DM組小。

由表2可知，造模結(jié)束后與正常對(duì)照組相比，T2DM模型組大鼠血糖濃度顯著升高（P＜0.05）；L-QU、H-QU干預(yù)組大鼠血糖濃度與T2DM組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；槲皮素干預(yù)12 周后，與T2DM模型組相比，L-QU、H-QU干預(yù)組大鼠血糖濃度均顯著降低（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，槲皮素可以降低T2DM大鼠血糖濃度。

2.3 槲皮素干預(yù)后大鼠血清胰島素水平的變化

表 3 槲皮素干預(yù)對(duì)T2DM大鼠血清胰島素含量和HOMA-IR指數(shù)的影響Table 3 Effect of quercetin on serum insulin levels and HOMA-IR index in T2DM rats

由表3可知，槲皮素干預(yù)12 周后，與正常對(duì)照組相比，T2DM模型組大鼠的血清胰島素含量顯著降低（P＜0.05），HOMA-IR指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；與T2DM模型組相比，L-QU、H-QU干預(yù)組大鼠HOMA-IR指數(shù)顯著下降（P＜0.05），表明槲皮素干預(yù)可以減輕T2DM大鼠的胰島素抵抗。

2.4 槲皮素干預(yù)后大鼠胰腺的氧化損傷變化

表 4 槲皮素干預(yù)對(duì)T2DM大鼠胰腺氧化損傷的影響Table 4 Effect of quercetin on oxidative pancreatic damage in T2DM rats

由表4可知，槲皮素干預(yù)12 周后，與T2DM模型組相比，L-QU、H-QU干預(yù)組大鼠胰腺M(fèi)DA含量均顯著降低（P＜0.05），SOD活力、T-AOC水平、GSH-Px活力和GSH濃度均顯著上升（P＜0.05）。結(jié)果表明，低、高劑量的槲皮素干預(yù)可以減輕T2DM大鼠胰腺組織氧化損傷，可能與SOD、T-AOC、GSH-Px以及GSH水平的提高有關(guān)，機(jī)體抗氧化能力的提高使T2DM大鼠的血糖水平有所改善，并減輕胰島素抵抗。

2.5 槲皮素干預(yù)后大鼠胰腺中Nrf2、HO-1、GST、NQO1蛋白表達(dá)的變化

由圖2可知，槲皮素干預(yù)12 周后，與T2DM模型組相比，L-QU、H-QU干預(yù)組大鼠胰腺Nrf2、HO-1、GST、NQO1蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著上升（P＜0.05），表明槲皮素干預(yù)可以提升T2DM大鼠胰腺Nrf2蛋白的表達(dá)，從而激活下游抗氧化酶，使HO-1、GST、NQO1蛋白的表達(dá)上調(diào)，從而使T2DM大鼠胰腺內(nèi)MDA含量顯著降低（P＜0.05），改善胰腺氧化損傷，降低血糖水平，并減輕胰島素抵抗。

圖 2 槲皮素干預(yù)對(duì)T2DM大鼠胰腺Nrf2、NQO1、HO-1、GST蛋白表達(dá)的影響Fig. 2 Effect of quercetin on Nrf2, NQO1, HO-1 and GST protein expression in T2DM rats

2.6 槲皮素干預(yù)后大鼠胰腺中Nrf2、NQO1、GST、HO-1 mRNA表達(dá)的變化

圖 3 槲皮素干預(yù)對(duì)T2DM大鼠胰腺Nrf2、NQO1、GST、HO-1 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響Fig. 3 Effect of quercetin on mRNA expression levels of Nrf2, NQO1,GST and HO-1 in T2DM rats

由圖3可知，槲皮素干預(yù)12 周后，與T2DM模型組相比，L-QU、H-QU干預(yù)組大鼠胰腺Nrf2、HO-1、NQO1的mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05），L-QU干預(yù)組大鼠胰腺GSTmRNA相對(duì)表達(dá)量與T2DM模型組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），僅H-QU干預(yù)組大鼠的胰腺GSTmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05）。表明槲皮素干預(yù)可能通過(guò)激活Nrf2通路，上調(diào)Nrf2mRNA表達(dá)水平，進(jìn)而上調(diào)下游相關(guān)抗氧化酶表達(dá)，使T2DM大鼠胰腺內(nèi)MDA含量顯著下降，減輕胰腺氧化損傷。

3 討 論

DM已經(jīng)成為危害我國(guó)城鄉(xiāng)居民健康的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題，DM及其并發(fā)癥的防治主要是通過(guò)降糖藥物和胰島素控制血糖，但血糖控制效果況并不理想[19-21]。長(zhǎng)期使用降糖藥物會(huì)有明顯的副作用，植物化學(xué)物具有獲取方便、廉價(jià)、副作用小等特點(diǎn)，受到研究者的青睞[22]。

多項(xiàng)研究表明槲皮素對(duì)DM患者具有一定的保護(hù)作用[23-25]。本研究結(jié)果表明，槲皮素干預(yù)12 周后，與T2DM模型組相比，L-QU、H-QU干預(yù)組大鼠的血糖濃度、HOMA-IR指數(shù)顯著降低（P＜0.05），這一結(jié)果與Wang Zhenzhi等[26]的研究結(jié)果一致。這說(shuō)明槲皮素具有降血糖作用，可以減輕T2DM大鼠的胰島素抵抗。

氧化應(yīng)激在DM發(fā)病過(guò)程中具有非常關(guān)鍵的作用。隨著人們對(duì)氧化應(yīng)激認(rèn)識(shí)的不斷深入，通過(guò)抗氧化途徑尋找預(yù)防和治療DM及其并發(fā)癥的方法，使抗氧化治療有望成為一種新的DM及其并發(fā)癥的防治手段[27]。研究表明，氧化應(yīng)激參與DM發(fā)生、發(fā)展的整個(gè)過(guò)程，減輕氧化損傷可能會(huì)阻止或延緩DM發(fā)展及其并發(fā)癥的發(fā)生。DM患者由于胰島β細(xì)胞受損，其體內(nèi)抗氧化酶含量及活性相對(duì)降低，高糖聚集形成的活性氧簇也會(huì)直接損傷胰島β細(xì)胞[28]。王建禮等[29]研究發(fā)現(xiàn)，與T2DM模型大鼠相比，槲皮素干預(yù)使T2DM大鼠血清MDA濃度降低，SOD活力明顯上升，減輕了氧化損傷，從而發(fā)揮對(duì)胰腺的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與T2DM模型組相比，L-QU、H-QU干預(yù)組大鼠胰腺的MDA含量顯著降低，SOD活力、T-AOC水平、GSH濃度、GSH-Px活力均顯著上升，說(shuō)明槲皮素干預(yù)可以減輕T2DM大鼠胰腺氧化損傷并能提高胰腺抗氧化能力。

有研究表明，Nrf2與抗氧化反應(yīng)元件（anti-oxidative response element，ARE）結(jié)合，啟動(dòng)下游II相解毒酶、抗氧化蛋白、蛋白酶體/分子伴侶等基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)以抵抗氧化應(yīng)激[30]。Nrf2/ARE信號(hào)通路是機(jī)體抵抗外界氧化的防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，能夠提高機(jī)體的抗氧化能力[31]。Nrf2通路作為重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，與DM及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展之間有著密切聯(lián)系，并有望成為極具前景的DM干預(yù)新靶標(biāo)[32]。

江穎娟等[14]研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素可通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路上調(diào)HO-1、GST、NQO1蛋白及其mRNA表達(dá)水平，進(jìn)而對(duì)肝臟氧化損傷產(chǎn)生一定的保護(hù)作用。Wu Yuanseng等[33]研究結(jié)果顯示，Nrf2信號(hào)通路被激活后，可拮抗高糖所致氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞損傷。伏旭等[13]研究發(fā)現(xiàn)，蛙皮素聯(lián)合脂多糖能夠誘導(dǎo)急性胰腺炎大鼠通過(guò)Nrf2蛋白的過(guò)表達(dá)，顯著上調(diào)胰腺中HO-1、NQO1蛋白及其mRNA表達(dá)水平，從而拮抗胰腺氧化損傷。本研究結(jié)果顯示，與T2DM模型組大鼠相比，L-QU、H-QU干預(yù)組大鼠胰腺Nrf2蛋白及其mRNA表達(dá)水平均顯著上升，下游抗氧化酶HO-1、NQO1的蛋白及其mRNA表達(dá)量均顯著上升，表明槲皮素可通過(guò)激活Nrf2通路，上調(diào)下游相關(guān)抗氧化酶表達(dá)，拮抗DM所致胰腺氧化損傷。

槲皮素作為防治DM的天然植物化學(xué)物質(zhì)一直備受關(guān)注。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，槲皮素具有調(diào)節(jié)血糖的作用[23-24]，但機(jī)制尚不明確。本研究結(jié)果表明，槲皮素可能是通過(guò)激活胰腺組織Nrf2信號(hào)通路，調(diào)節(jié)下游抗氧化酶表達(dá)，進(jìn)而減輕胰腺氧化損傷，改善胰島素抵抗，調(diào)節(jié)血糖水平，從而發(fā)揮防治DM的作用。