田榮，谷巍，2，韋陳彬，徐飛，邱蓉麗，張阿琴，季媛媛，李桃

(1.南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇 南京 210023;2.江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210023)

三萜類成分是以異戊二烯為結構單元組成的具有多種結構的30碳天然產物，在藥物、食品等行業(yè)被廣泛應用[1]。三萜類成分具有降糖、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、護肝、抗病毒等生物活性[2-4]，同時其在植物體中可以防御病蟲害[5]。由于三萜類成分的結構相對復雜，在植物中含量較低且常以多種結構相近的成分混合存在，難以通過提取分離或化學合成方法獲得。合成生物學的發(fā)展為獲取大量高價值三萜類成分提供新思路。

三萜類成分在植物體內主要以甲羥戊酸(Mevalonate，MVA)途徑合成，可分為三個階段：①2,3-氧化鯊烯(2,3-Oxidosqualene)的合成：乙酰輔酶CoA(Acetyl-CoA)在一系列酶催化作用下形成異戊烯焦磷酸酯(Isopentenyl pyrophosphate，IPP)，IPP與二甲基烯丙基焦磷酸酯(Dimethylallyl diphosphate，DMAPP)在法呢基焦磷酸合酶(Farnesyl pyrophosphate synthase，FPPS)的作用下縮合生成法呢基焦磷酸酯(Farnesyl pyrophosphate，FPP)，2個FPP分子在鯊烯合成酶(Squalene synthetase，SS)催化作用下轉化為角鯊烯(Squalene)，進一步在鯊烯環(huán)氧酶(Squalene epoxidase，SE)作用下轉化為2,3-氧化鯊烯[6-7]。②2,3-氧化鯊烯的環(huán)化：該物質是植物甾醇和三萜類成分生物合成的共同前體物質，其在氧鯊烯環(huán)化酶(Oxidosqualene cyclase，OSC)的作用下合成多種構象和結構各不相同的三萜碳骨架[8]，這些骨架是構成功能上不同的三萜類成分的基礎(圖1)。③環(huán)上復雜的官能化修飾：細胞色素P450單加氧酶(Cytochrome P450 monooxygenases，CYP450)參與催化三萜骨架空間立體結構發(fā)生特異性氧化，形成具有各種功能的官能團，如羥基、羰基和羧基等[9]。目前有關三萜類合成途徑第一階段關鍵酶的研究比較多，而由于OSC和CYP450的種類非常多，作用機理也比較復雜，目前對這2類酶研究較少。OSC和CYP450與三萜的多樣性密切相關，因此，OSC和CYP450的克隆和功能研究對解析三萜類成分的生物合成途徑有著重要作用。

注：AACT.乙酰輔酶A?；D移酶(Acetyl-CoA acetyltrans-ferase)；HMGS.羥甲基戊二酰CoA合酶(3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase)；HMGR.羥甲基戊二酰CoA還原酶(Hydroxymethyl-glutaryl-CoA reductase)；MK.甲羥戊酸激酶(Meval-onate kinase)；PMK.二氧磷基MVA激酶(Phosphomevalonate kinase)；MVD.甲羥戊酸-5-焦磷酸脫羧酶(Mevalonate-5-pyrophosphate decarboxylase)；IDI.異戊烯基二磷酸異構酶(Lisopentenyl diphosphate isomerase)；FPPS.法呢基焦磷酸合酶(Farnesyl pyrophosphate synthase)；SS.鯊烯合成酶(Squalene synthetase)；SE.鯊烯環(huán)氧酶(Squalene epoxidase)；OSC.氧鯊烯環(huán)化酶(Oxidosqualene cyclases)；LS.羊毛甾醇合成酶(Lanosterol synthase)；DS.達瑪烯合成酶(Dammarenediol synthase)；CS.葫蘆二烯醇合酶(Cucurbitadienol synthase)；CAS.環(huán)阿屯醇合成酶(Cycloartenol synthase)；PS.帕克醇合酶(Parkeol synthase)；OS.秈稻醇合酶(Orysatinol synthase)；β-AS.β-香樹素合成酶(β-Amyrin synthase)；LUS.羽扇醇合成酶(Lupeol synthase)；α-AS.α-香樹脂醇合成酶(α-Amyrin synthase)；FS.木栓酮合成酶(Friedelane synthase)

本文歸納總結了植物中合成各種三萜類碳骨架的OSC和對三萜不同位點修飾的CYP450的研究進展，以期為深入探索OSC和CYP450在三萜類成分生物合成中的功能研究提供基礎。

1 OSC基因家族主要成員及其研究進展

OSC屬于一個超家族，家族成員具有DCTAE和QW高度保守序列。其中，DCTAE序列與底物結合有關；4個重復的帶有負電性的芳香族氨基酸QW(QXXXXXW)序列在2,3-氧化鯊烯環(huán)化反應中起到穩(wěn)定碳正離子的作用。

在植物合成三萜類成分的過程中，2,3-氧化鯊烯在OSC作用下，發(fā)生環(huán)化反應的過程中會形成“椅-椅-椅”(C-C-C)和“椅-船-椅”(C-B-C)2種不同的空間構象，其環(huán)化主要涉及4個步驟：①結合底物并預先確定環(huán)系統(tǒng)；②通過環(huán)氧化物的質子化引發(fā)反應；③碳正離子物種的環(huán)化和重排；④通過去質子化或脫水生成最終的三萜類產物。從提出的氧化角鯊烯環(huán)化機理來看，產物的多樣性主要取決于環(huán)化反應中穩(wěn)定碳正離子的能力[10]。

迄今為止，已經從不同植物中分離得到10種OSC酶，分別為：羊毛甾醇合成酶(Lanosterol synthase，LS)、達瑪烯合成酶(Dammarenediol synthase，DS)、葫蘆二烯醇合成酶(Cucurbitadienol synthase，CS)、環(huán)阿屯醇合成酶(Cycloartenol synthase，CAS)、帕克醇合成酶(Parkeol synthase，PS)、秈稻醇合成酶(Orysatinol synthase，OS)、β-香樹素合成酶(β-Amyrin synthase，β-AS)、羽扇醇合成酶(Lupeol synthase，LUS)、α-香樹脂醇合成酶(α-Amyrin synthase，α-AS)和木栓酮合成酶(Friedelane synthase，FS)。在三萜的生物合成途徑中，代謝支路都源于2,3-氧化鯊烯這個共同前體物質。

1.1 羊毛甾醇合成酶(LS)

LS可催化2,3-氧化鯊烯環(huán)化生成甾醇和羊毛脂甾烷型三萜的前體物質羊毛甾醇(Lanosterol)[11]，該酶通過催化2,3-氧化鯊烯排列成“C-B-C”的構象，產生C-30原甾醇陽離子中間體，進一步催化形成羊毛甾醇[11]。隨后羊毛甾醇在植物體內經過一系列的反應產生具有羊毛甾醇骨架的三萜和植物甾醇，LS的含量以及其活性高低可間接地影響到三萜類成分的含量。研究人員已在擬南芥、靈芝等植物中進行LS基因克隆和表達的研究[11-12]。

Zhang等克隆了靈芝中Gl-LS基因并構建過表達的靈芝菌株，發(fā)現Gl-LS基因的過表達可促進靈芝酸Mk、靈芝酸T、靈芝酸O等多種靈芝酸的產生，含量增加2.0～6.1倍，同時也使羊毛甾醇的含量提高2.3倍，該結果表明Gl-LS基因的上調表達可有效促進羊毛甾醇含量的積累，從而促進靈芝酸類三萜成分的合成[13]。

1.2 達瑪烯二醇合成酶(DS)

DS能夠催化2,3-氧化鯊烯發(fā)生環(huán)化反應生成達瑪烯二醇Ⅱ(Dammarenediol Ⅱ)，再經過CYP450等的作用進一步反應生成達瑪烷型三萜類成分。在人參、三七、西洋參等植物中均有關于DS的相關報道[14-15]。

Lu等通過瞬時過表達實驗證實人參中PgDS基因的表達受轉錄因子PgMYB2正調控作用，同時植物激素茉莉酸甲酯(MeJA)顯著誘導PgDS基因和PgMYB2的表達水平[14]。梁會超等運用同源堿基PCR方法得到DS-Ⅱ的cDNA序列，并在酵母中進行表達，通過體外酶促實驗驗證發(fā)現有大量的達瑪烯二醇合成[15]。

1.3 葫蘆二烯醇合成酶(CS)

在葫蘆烷型化合物生物合成途徑中，CS催化底物2,3-氧化鯊烯形成葫蘆二烯醇(Cucurbitadienol)。葫蘆二烯醇是葫蘆烷型四環(huán)三萜類化合物，為羅漢果甜苷和葫蘆素等重要中藥有效成分生物合成途徑中的基本前體[16]，它的存在及其含量影響著下游產物的種類及含量。目前已經在羅漢果、西葫蘆、黃瓜、藥西瓜等植物中有CS的相關研究報道[17-18]。Jing等通過對羅漢果中CS基因進行全面的SNP分析和誘變實驗，成功地確定了決定CS活性的50和573位的2個關鍵氨基酸位點[17]。Davidovich-Rikanati等克隆得到藥西瓜中的CcCDS1和CcCDS2序列，采用酵母菌株BY4743進行功能驗證，經LC-TOF-MS檢測發(fā)現只有CcCDS2具有CS活性，其酵母表達產物中含有葫蘆二烯醇[18]。

1.4 環(huán)阿屯醇合成酶(CAS)

CAS催化2,3-氧化鯊烯發(fā)生環(huán)化反應生成環(huán)阿屯醇(Cycloartenol)，在甾醇類化合物的合成途徑中起著關鍵調控元件的作用。在目前的研究中已經從20多種植物中克隆出了其cDNA的序列。研究人員對三七、杠柳、羅漢果等植物進行了CAS的克隆、表達以及生物信息學的分析[19-20]。CAS和β-AS具有共同的前體物，兩者之間可進行競爭從而影響代謝產物。

1.5 帕克醇合成酶(PS)和秈稻醇合成酶(OS)

在水稻中發(fā)現了粳稻PS和OS，PS能夠催化2,3-氧化鯊烯形成“C-B-C”構象，生成具有四環(huán)三萜特征的帕克醇(parkeol)，OS則催化2,3-氧化鯊烯形成一種新的“椅-半椅-椅(C-sC-C)”構象，產生五環(huán)三萜秈稻醇(Orysatinol)的主產物及12種不同的三萜類成分[21]。目前，PS和OS僅在水稻中有報道，漆小泉團隊發(fā)現絕大部分秈稻和野生稻具有OS的催化功能，而PS是粳稻馴化過程中由其近緣野生稻新產生的單功能三萜環(huán)化酶。利用分子進化分析、蛋白結構模擬、定點突變和催化功能分析，發(fā)現124、365、732這3個關鍵位點的氨基酸殘基能夠影響第4個氨基酸殘基(Tyr257)的空間方向，從而決定了產物是四環(huán)三萜帕克醇還是五環(huán)三萜秈稻醇，為揭示形成船式和椅式三萜骨架的催化機制提供基礎[21]。

1.6 β-香樹素合成酶(β-AS)

β-AS是目前為止發(fā)現的唯一的一種催化齊墩果烷型三萜生物合成的關鍵酶，其催化2,3-氧化鯊烯發(fā)生環(huán)化反應生成β-香樹脂烷(β-Amyrin)，在此催化過程中2,3-氧化鯊烯以“C-C-C”的構象形成達瑪脂陽離子，再通過重排和質子化作用生成齊墩果烷型三萜。有研究認為在β-AS中還存在MWCYCR保守序列，該保守序列中的色氨酸可能對三萜類物質骨架的生成起重要作用[22]。

β-香樹脂烷是這類β-香樹脂烷型三萜類化合物生物合成的共同前體，這類物質包括甘草酸、山楂酸等化合物[23]。多個β-AS基因已在人參、甘草、擬南芥、珠子參、青蒿等植物中被克隆驗證[24-25]。隨著研究的深入，β-AS的同源基因在不同植物中已發(fā)現超過300余條。Yin等在白樺樹中得到編碼Bpβ-AS的全長cDNA，并通過反向遺傳學鑒定其在樺木的三萜合成中的功能，發(fā)現Bpβ-AS基因的抑制能夠正向調節(jié)樺木酸的合成[24]。Liu等從麻花秦艽中分離得到編碼β-AS的GsAS1和GsAS2，通過酵母異源表達發(fā)現，GsAS2產生的β-香樹脂烷產量要多于GsAS1，過表達實驗結果顯示GsAS2催化齊墩果酸積累的效率是GsAS1的1.9倍，表明GsAS2在麻花秦艽中的齊墩果酸生物合成中起著比GsAS1更重要的作用[25]。

1.7 羽扇豆醇合成酶(LUS)

LUS催化2,3-氧化鯊烯發(fā)生環(huán)化反應生成羽扇豆醇(Lupeol)。在催化過程中，2,3-氧化鯊烯形成“C-C-C”構象的排列，產生四環(huán)素達瑪陽離子中間體，進一步生成羽扇豆陽離子，最終生成羽扇豆醇?，F有的研究表明羽扇豆醇在抗腫瘤方面具有很好的效果[26]。

已有多種來源于不同物種的LUS通過異源表達實驗進行功能驗證，如來源于甘草的LUS[27]，來源于栓皮櫟的LUS[28]，來源于蓖麻的RcLUS[29]等。在三萜合酶中，LUS和β-AS在四環(huán)結構轉化為五環(huán)結構的質子重排過程中的關鍵位點具有相同的芳香族保守殘基。

1.8 α-香樹脂醇合成酶(α-AS)

α-AS能夠催化2,3-氧化鯊烯發(fā)生環(huán)化反應形成α-香樹脂醇(α-Amyrin)。α-香樹脂醇是植物當中重要的五環(huán)三萜，具有重要的生理和藥理活性。Li等克隆了枇杷和蘋果中的α-AS，并在酵母中進行表達，發(fā)現枇杷中的α-AS以17∶3的比例產生α-香樹脂醇和β-香樹脂醇，蘋果中的α-AS以86∶13∶1的比例產生α-香樹脂醇，β-香樹脂醇和羽扇豆醇[30]。Pisanee等通過釀酒酵母的體內試驗證實巴西羊蹄甲中的α-AS2能夠以高達90%的比例催化2,3-氧化鯊烯轉化為α-Amyrin，這是豆科植物中第1個被報道的合成α-香樹脂醇的α-AS[31]。

1.9 木栓酮合成酶(FS)

FS能夠催化2,3-氧化鯊烯發(fā)生環(huán)化反應形成木栓酮(Friedelane)，屬于木栓烷型五環(huán)三萜類化合物。FS目前在雷公藤、山楊等植物中有報道[32]。Zhou等通過同源堿基PCR方法成功得到了雷公藤中FS1和FS3的cDNA序列，并在酵母中進行表達，通過UPLC分析發(fā)現生成木栓酮，進一步通過底物飼養(yǎng)實驗，證實木栓酮參與雷公藤紅素的生物合成[32]。

2 參與三萜生物合成的細胞色素P450(CYP450)研究現狀

CYP450是一個古老的超基因家族，同時也是植物代謝中最大的酶家族。CYP450具有廣泛的催化活性，最常見反應是單加氧酶反應，其催化的三萜碳骨架修飾顯著促進三萜類成分的結構多樣性。CYP450是根據氨基酸的同源性來進行分類，同源性大于40%歸為同一基因家族，同源性大于55%則歸為同一亞家族[33]。目前，植物中已有127個CYP450家族被發(fā)現，根據系統(tǒng)發(fā)育樹上的分類，又被分為11個簇，其中CYP51、CYP74、CYP97、CYP710、CYP711、CYP727、CYP746為單家族簇，CYP71、CYP72、CYP85、CYP86為多家族簇[34]。但是CYP450的分類只能代表系統(tǒng)進化關系，與其所屬功能無必然聯系。特異性調控三萜類成分生物合成的CYP450基因主要歸屬于CYP51、CYP71、CYP72、CYP85家族[35]。

2.1 CYP51家族

CYP51家族是最古老，最保守的真核CYP450家族之一。其中，CYP51H亞家族是該家族中目前發(fā)現的唯一參與三萜類骨架修飾的亞家族，屬于單子葉植物特有的P450亞家族，進行五環(huán)三萜的骨架修飾。在燕麥中，CYP51H10對于燕麥毒素(齊墩果烷型三萜皂苷)的合成是必不可少的，其能催化β-香樹脂醇形成12,13β-環(huán)氧-16β-羥基-β-香樹脂醇，包括2個連續(xù)反應：首先是β-香樹脂醇的C-16位發(fā)生羥基化反應，形成16β-羥基-β-香樹脂醇，進一步在C環(huán)上的C-12/C-13位發(fā)生環(huán)氧化反應[36]。

2.2 CYP71家族

CYP71家族是植物CYP450中最大的家族，其中CYP71A、CYP71D、CYP81Q、CYP89A、CYP93E和CYP705A亞家族參與三萜類成分的結構修飾。

目前關于CYP71A亞家族的CYP450基因報道還僅限于擬南芥中的CYP71A16，研究發(fā)現當CYP71A16與OSC(MRN1)同時在酵母中表達時，C-23位會發(fā)生羥基化反應，通過分析擬南芥CYP71A16突變體系和過表達體系的結果，證實CYP71A16在三萜中的氧化作用[37]。

CYP71D353是CYP71D亞家族參與三萜生物合成的唯一成員，其他CYP71D亞族成員主要參與單萜和類黃酮羥基化。日本金蓮花中的CYP71D353具有氧化羽扇豆烷型五環(huán)三萜的功能，催化二氫羽扇豆醇C-20位進行羥基化反應生成20-羥基羽扇豆醇[38]。CYP71D353還被證實可以將20-羥基羽扇豆醇的C-28位依次進行三步氧化后轉化為20-羥基白樺脂酸[38]。

利用酵母單雜交和RNA干擾實驗發(fā)現，黃瓜中CYP81Q58、CYP81Q59、CYP89A140均參與葫蘆素C的生物合成[39]，CYP81Q58可以氧化19-羥基葫蘆二烯醇的C-25位生成19,25-二羥基葫蘆二烯醇。在西瓜和甜瓜中還發(fā)現了與葫蘆素B和葫蘆素E生物合成相關的CYP81Q59，將CYP81Q59轉入產11-羰基-20β-羥基葫蘆二烯醇的工程菌中驗證其催化功能，證實CYP81Q59能氧化11-羰基-20β-羥基-葫蘆二烯醇的C-2位生成11-羰基-2β,20β-二羥基-葫蘆二烯醇[39]。

目前發(fā)現的CYP93E的亞家族成員僅限于豆類植物中三萜的生物合成，催化三萜骨架的C-24位氧化。大豆中發(fā)現的CYP93E1可將β-香樹脂醇和槐葉二醇分別轉化為24-羥基-β-香樹脂醇和大豆皂醇B[40]。CYP93E1也代表三萜生物合成途徑中發(fā)現的第1個CYP93E亞家族的P450。在紫花苜蓿中，CYP93E2能夠催化β-香樹脂醇的C-24羥基化。同樣，甘草中發(fā)現的CYP93E3在β-香樹脂醇的C-24發(fā)揮羥基化作用。迄今為止，從8個豆科植物物種中鑒定出另外9個CYP93Es[41]。

CYP705A的亞家族成員目前僅在擬南芥中發(fā)現，其中CYP705A1能夠催化裂解擬南芥比醇的側鏈獲得14-apo-擬南芥比醇[42]。

2.3 CYP72家族

在植物中，CYP72是促進次生代謝產物生成的最大酶類之一，其中CYP72A亞家族成員被證實參與三萜骨架的修飾。Liu等在歐洲山芥中獲得CYP72A522，通過體外酶促反應證實CYP72A522可以催化齊墩果酸的C-23位發(fā)生羥基化反應[43]。研究顯示，苜蓿中的CYP72A61，CYP72A63，CYP72A67和CYP72A68參與齊墩果烷型三萜骨架的氧化反應。CYP72A61的功能被證實為C22-羥化酶，將24-羥基-β-香樹脂醇轉化為大豆皂酚B[44]。CYP72A67和CYP72A68分別為C2β-羥化酶(齊墩果酸)和C23-氧化酶(齊墩果酸)[45]。烏拉爾甘草中的CYP72A154是C30-氧化酶，催化11-氧代-β-香樹脂醇發(fā)生三步氧化反應形成甘草次酸，參與甘草甜素的合成[46-47]。同時，體外酶促實驗和酵母表達實驗均證實CYP72A154為多功能酶，能氧化D環(huán)和E環(huán)上不同位置的碳原子，與甘草中三萜類成分的多樣性密切相關。CYP72A154也可氧化β-香樹脂醇的C-30位生成30-羥基-β-香樹脂醇[48]。在蒺藜草中發(fā)現的CYP72A63也具有C30-氧化酶活性，并且在三步氧化后將β-香樹脂醇轉化為11-脫氧甘草次酸[49]。

2.4 CYP85家族

CYP85是一個多家族簇，其中的CYP88、CYP716、CYP87、CYP708參與三萜結構修飾。

在甘草酸途徑中，CYP88D6催化β-香樹脂醇的C-11位發(fā)生連續(xù)兩步氧化反應，產生11-氧代-β-香樹脂醇[27]。在擬南芥三環(huán)三萜類成分生物合成中，CYP708A2能夠催化擬南芥醇(Thalianol)形成7β-羥基擬南芥醇[42]。

CYP716被歸類為CYP85，大多數的CYP716參與五環(huán)三萜骨架的修飾[33]。從超過200種植物中收集到的關于CYP716的進化分析報告顯示，CYP716家族主要參與三萜的生物合成，其中CYP716A、CYP716C、CYP716E、CYP716S、CYP716U和CYP716Y等亞家族已被證實能催化三萜的生物合成。

迄今為止，大約20種CYP716A的特征是具有香樹脂醇/羽扇豆醇的C28-氧化酶的活性。這些CYP716As中的大多數催化香樹脂醇/羽扇豆醇骨架的連續(xù)三步氧化反應，導致C-28位置連續(xù)形成羥基，醛和羧基部分[50]。Tamura發(fā)現CYP716A179為多功能酶，將CYP716A179在酵母工程菌中異源表達，結果表明CYP716A179為C-28位氧化酶，其能氧化α-香樹脂醇、β-香樹脂醇及羽扇豆醇的C-28位分別生成烏蘇酸、齊墩果酸和樺木酸[51]。

Park等采用酵母表達系統(tǒng)對CYP716A47和CYP716A53v2進行功能研究，CYP716A47為原人參二醇合酶，能夠氧化達瑪烯二醇的C-12位生成原人參二醇，CYP716A53v2則進一步氧化原人參二醇的C-6位生成原人參三醇[52]。CYP716A47和CYP716A53v2參與達瑪烷型三萜生物合成過程中2個連續(xù)的氧化反應。研究人員還利用農桿菌介導轉化的方法在煙草中共表達人參達瑪烯二醇合酶(PgDDS)、CYP716A47和CYP716A53v2，在轉基因煙草的葉片中檢測到達瑪烯二醇、原人參二醇和原人參三醇，在煙草體系中進一步驗證了PgDDS、CYP716A47和CYP716A53v2的功能[53]。Han等通過酵母表達系統(tǒng)對CYP716A52v2進行功能研究，發(fā)現其具有β-香樹脂醇C28-氧化酶活性，能夠氧化β-香樹脂醇的C-28位生成齊墩果酸[54]。Dai等將人參中的β-香樹脂醇合酶、CYP716A53v2、CYP716A52v2與PgDDS、CYP716A47同時導入酵母中，獲得了能同時產生原人參二醇、原人參三醇和齊墩果酸3種人參皂苷苷元的酵母工程菌[55]。少數植物CYP716A還靶向除C28以外的香樹脂醇骨架的碳原子，比如擬南芥中CYP716A2為C22α羥基化，桔梗中CYP716A141為C16β羥基化，青蒿中CYP716A14v2為C3氧化。

Miettinen等發(fā)現積雪草中CYP716C11可以催化齊墩果酸，6β-羥基油醇酸和熊果酸的C2α羥基化[56]。番茄CYP716E26和積雪草CYP716E41的催化特征為C6β-羥化酶，催化底物分別為α/β-香樹脂醇和齊墩果酸/熊果酸[57]。

桔梗中CYP716S5能夠催化β-香樹脂醇生成12,13α-環(huán)氧-β-香樹脂醇，12,13α-環(huán)氧齊墩果酸和12α-羥基-β-香樹脂醇-13,28β-內酯[56]，其中12,13α-環(huán)氧齊墩果酸可自發(fā)形成12α-羥基-β-香樹脂醇-13,28β-內酯，說明CYP716S5能催化β-香樹脂醇及齊墩果酸的C-12,13α環(huán)氧化反應及某一位置的羥基化。

人參CYP716U1和CYP716S1v2在人參的生物合成途徑中催化2個連續(xù)的羥化反應[58]。CYP716U1參與達瑪烯二醇的C-12位羥基化，產生原人參二醇。CYP716S1v2催化原人參二醇C-6位羥基化產生原人參三醇。此外，柴胡中CYP716Y1是一種C16α-羥化酶，對β-香樹脂醇和α-香樹脂醇骨架具有修飾作用[59]。

CYP87D是CYP85家族除CYP88D、CYP708A和CYP716s外的另一個亞家族。杉木中的CYP87D16是目前發(fā)現與五環(huán)三萜骨架修飾相關的唯一CYP87D亞家族成員。CYP87D16通過催化β-香樹脂醇C16α-羥基化參與三萜合成。羅漢果中發(fā)現的CYP87D18是1個多功能酶，對葫蘆二烯醇、24,25-環(huán)氧葫蘆二烯醇和24,25-二羥基葫蘆二烯醇的C-11位均具有氧化活性。Zhang等將酵母中表達的CYP87D18與葫蘆二烯醇進行反應，結果發(fā)現CYP87D18能連續(xù)氧化葫蘆二烯醇的C-11位生成11-羥基葫蘆二烯醇和11-羰基葫蘆二烯醇[60]。

3 結語與展望

綜上，OSC在三萜類成分的生物合成中能催化2,3-氧化鯊烯環(huán)化形成不同類型的碳骨架，是三萜類成分多樣性的基礎，為三萜類成分的生物合成提供重要的先導化合物。CYP450則參與植物三萜類成分的骨架修飾，催化三萜骨架空間立體結構發(fā)生特異性氧化，形成各種官能團，最終產生結構各異的三萜類成分。因CYP450數量龐大且催化功能多樣，既可以催化不同底物的同一位點，也可以催化同一底物的不同位點，這些功能豐富的CYP450的發(fā)現對于催化機制的研究具有重要意義。目前植物三萜類成分生物合成途徑的研究已有一定的進展，但三萜骨架構建和修飾的研究，因三萜類成分結構復雜及修飾酶基因種類繁多，具體合成步驟還未清楚。利用合成生物學的方法合成三萜類成分還需對其碳環(huán)骨架建立以及復雜的官能團反應進行深入研究。目前通過序列同源性較高或者化合物結構相似的方法研究OSC和CYP450功能只能起到簡單的預測作用，進行功能驗證實驗是明確其催化作用的有效方法。因此，進一步開展OSC和CYP450的克隆及催化功能研究，為解析三萜類成分生物合成中關鍵酶的功能研究提供思路，最終為通過基因調控實現不同單體三萜的異源合成奠定基礎。