徐疏影，李文倩，洪浩，蔡云，吳旭，朱冰梅，彭擁軍

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.四川大學(xué)華西醫(yī)院，四川 成都 610041；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院·養(yǎng)生康復(fù)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

腦缺血是由大腦局部供血不足引起，繼發(fā)各種病理生理變化的一種常見神經(jīng)系統(tǒng)疾病，具有高發(fā)生率、高致殘率及高死亡率的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害患者的健康及生活質(zhì)量[1-2]。腦缺血再灌注損傷是指腦血流中斷后再次灌流至腦缺血半暗區(qū)，在挽救瀕死神經(jīng)細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)其產(chǎn)生迅速的級(jí)聯(lián)反應(yīng)損傷，最終導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡或壞死，進(jìn)一步加重腦組織損傷[3-4]。有研究證明，在再灌注階段，細(xì)胞自噬參與調(diào)控了神經(jīng)細(xì)胞的損傷與凋亡[5]。針灸被廣泛用于干預(yù)腦缺血的發(fā)生發(fā)展期[6],然其治療機(jī)制尚不明確。因此本研究擬通過建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，探討電針對(duì)大鼠神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用與細(xì)胞自噬的關(guān)聯(lián)性，以期探究電針的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，6～8周齡，體質(zhì)量250～280 g，共72只(重慶威斯騰生物科技有限公司)。動(dòng)物自購回后保持動(dòng)物房12 h/12 h晝夜交替，保持動(dòng)物自由飲水、進(jìn)食，溫度23～25 ℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑與儀器 TTC溶液(Sigma公司，美國)；蘇木素染液(南京建成生物工程研究所)；伊紅染液(上海碧云天生物公司)；LC3-Ⅱ、Beclin1兔來源單抗(Abcam，英國)；山羊抗兔IgG二抗(Sigma，美國)；G6805-Ⅱ型電針治療儀(上海醫(yī)療電子儀器有限公司)；RNA提取試劑盒(Takara，日本)；Tanon-1600凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；倒置顯微鏡(Olympus，日本)；照相系統(tǒng)(Olympus，日本)；PTC-100 PCR儀(Bio-Rad，美國)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與造模 將72只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字法分為對(duì)照組、模型組和電針組，每組24只。對(duì)照組大鼠不作任何處理。參照Longa線栓法阻塞大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈(MCA)，建立改良的急性局灶性腦缺血再灌注模型(MCAO)[7]。大鼠稱質(zhì)量，7%水合氯醛(每100 g體質(zhì)量給予0.5 mL)腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥位放置于操作臺(tái)上，鈍性分離右側(cè)皮下組織及肌肉，暴露出頸總動(dòng)脈，眼科鑷小心分離伴行于頸總動(dòng)脈的迷走神經(jīng)及動(dòng)脈周圍黏膜組織，可見頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈與頸總動(dòng)脈呈“Y”字形分布。頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端結(jié)扎，近心端埋線以備結(jié)扎拴線，再用微動(dòng)脈夾夾閉頸總動(dòng)脈近心端和頸內(nèi)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端，用顯微外科剪將頸外動(dòng)脈剪一小口，將栓線由頸外動(dòng)脈切口處插入頸內(nèi)動(dòng)脈，松開微動(dòng)脈夾，將栓線送入顱內(nèi)，進(jìn)入18～20 mm時(shí)有明顯的阻力感，表明栓線已插入大腦中動(dòng)脈，MCAO即告成功。

插線成功即為腦缺血開始，1 h后，將栓線輕柔退至頸外動(dòng)脈處，即為再灌注開始。術(shù)后動(dòng)態(tài)觀察大鼠的反應(yīng)。麻醉后保溫至動(dòng)物蘇醒，肛溫(36.5±0.5)℃。

1.2.2 電針治療方法 電針組在造模成功后5 min和16 h(模擬大鼠腦缺血再灌注急性期損傷的2個(gè)時(shí)間點(diǎn))進(jìn)行電針干預(yù)，穴位皮膚常規(guī)用75%酒精消毒后，用華佗牌0.25 mm×15 mm毫針，針刺大鼠的人中(Du26)和百會(huì)(Du20)穴。穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[8],人中穴在大鼠唇正中裂，鼻尖下1 mm，向上斜刺1 mm。百會(huì)穴在頭頂骨正中，平刺4 mm。并給予電針治療，接G6805-Ⅱ型電針治療儀，電針人中、百會(huì)，電流強(qiáng)度以大鼠胡須微微顫動(dòng)為標(biāo)準(zhǔn)，采用疏密波，疏波頻率3.85 Hz，持續(xù)1.28 s；密波頻率6.25 Hz，持續(xù)2.08 s，電針30 min。大鼠固定方法：以110～120 cm長的棉線繩2根，6 cm寬口徑的透明膠帶，20 cm長、1 cm寬的絲帶為材料，對(duì)大鼠進(jìn)行“X”型固定操作[9]。對(duì)照組與模型組不針刺，但在針灸組進(jìn)行針灸時(shí)，均行統(tǒng)一固定操作。

1.2.3 大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分 參照改良的Zea Longa 8級(jí)(0～7分)神經(jīng)功能缺損評(píng)分法對(duì)大鼠進(jìn)行評(píng)分[7]。大鼠無任何不對(duì)稱活動(dòng)為0分；提起尾巴時(shí)左前爪不能完全伸展為1分；在1分的基礎(chǔ)上左前肢活動(dòng)障礙為2分；左前肢緊貼胸壁為3分；大鼠自由活動(dòng)時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)彎為4分；伴有明顯的左前爪后推動(dòng)作為5分；只能圍繞原點(diǎn)旋轉(zhuǎn)為6分；左側(cè)肢體完全不能支撐身體，只能躺向左側(cè)為7分。

1.2.4 TTC染色觀察大鼠腦梗死面積 于再灌注后24 h快速斷頭取材，-80 ℃冷凍5 min，待大腦凍硬后用特制刀具將大腦等分切成2 mm厚腦片(去小腦，整腦可切5～6片)，浸入37 ℃ 2%TTC溶液中孵育15 min。待TTC染色完成后將腦片浸入4%中性多聚甲醛固定保存，拍照，掃描，用Ulead photo Express2.0圖像分析軟件進(jìn)行腦梗死輪廓勾畫，用法醫(yī)損傷測量軟件測量梗死組織面積。

1.2.5 HE染色觀察大鼠腦組織病理學(xué)變化 于再灌注后24 h快速斷頭取材，取腦組織后用PBS清洗，4%多聚甲醛固定，根據(jù)大鼠解剖圖譜選取紋狀體顯示明顯區(qū)域的腦切片，并制備石蠟切片；常規(guī)乙醇、二甲苯脫水；將組織浸泡于石蠟中包埋，切片、烤片；石蠟切片脫蠟復(fù)水后，蘇木精染色10 min，流水沖洗；伊紅染色復(fù)染3 min，中性樹脂封片,顯微鏡下觀察切片。

1.2.6 Western blot檢測大鼠腦組織中LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表達(dá) 采用Western blot檢測大鼠右側(cè)紋狀體腦組織中LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表達(dá)量，RIPA裂解液裂解組織，玻璃勻漿器勻漿，離心后提取上清，提取總蛋白；BCA法測定蛋白濃度；配制工作液，等量蛋白樣品(每孔10 μL)上樣，酶標(biāo)儀波長設(shè)定在562 nm處進(jìn)行測定；電泳后將目的蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，TBST清洗；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗1∶1 000稀釋后室溫孵育1.5 h，TBST清洗3次，每次5 min；二抗1∶1 000稀釋后室溫孵育1.5 h，TBST清洗4次，每次5 min，將ECL曝光液按A液∶B液為1∶1混勻后，均勻覆蓋在整片膜上，反應(yīng)2 min放入曝光儀曝光檢測，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行灰度值比較。

1.2.7 qPCR檢測大鼠右側(cè)紋狀體腦組織Beclin1 mRNA表達(dá) 于再灌注后24 h快速斷頭取材，取新鮮腦組織，根據(jù)RNA提取試劑盒說明書提取RNA，參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qPCR，反應(yīng)體系為：2×SYBR Mix 5 μL，引物各0.5 μL，10×cDNA 1 μL，ddH2O 10 μL。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為:50 ℃ 2 min,95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。引物序列見下表1。以GAPDH作為內(nèi)參基因,根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算Beclin1 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 qPCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 電針對(duì)MCAO大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響

對(duì)照組無行為學(xué)改變，模型組神經(jīng)功能評(píng)分顯著高于對(duì)照組，而與模型組比較，電針組的神經(jīng)功能缺損評(píng)分顯著降低(P<0.01)。見圖1。

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，

2.2 TTC染色觀察電針對(duì)3組大鼠腦梗死體積

對(duì)各組大鼠進(jìn)行TTC染色檢測腦組織梗死體積，紅色為正常腦組織，蒼白色為梗死灶；對(duì)照組無肉眼可見梗死組織；與對(duì)照組比較，模型組梗死體積百分比顯著升高(P<0.01),而電針干預(yù)可顯著減少梗死體積(P<0.01)。見圖2～3。

圖2 3組大鼠腦梗死TTC染色圖

注：與對(duì)照組比較，**P<0.01；與模型組比較，

2.3 HE染色觀察電針對(duì)3組大鼠腦組織病理學(xué)影響

圖4顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠大腦組織疏松水腫，神經(jīng)細(xì)胞萎縮、數(shù)量明顯較少，細(xì)胞核固縮，呈空泡狀；電針組大鼠神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量也有減少，少部分細(xì)胞架構(gòu)不完整，出現(xiàn)固縮現(xiàn)象，但相對(duì)模型組神經(jīng)元損傷減輕，神經(jīng)元細(xì)胞明顯較多。

圖4 3組大鼠腦組織HE染色圖

2.4 電針對(duì)MCAO大鼠右側(cè)紋狀體腦組織中LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白表達(dá)影響

圖5結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白的表達(dá)明顯上升(P<0.01～0.05)，電針可使LC3-Ⅱ、Beclin1表達(dá)顯著上升(P<0.05)。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，

2.5 電針對(duì)MCAO大鼠右側(cè)紋狀體腦組織中Beclin1 mRNA表達(dá)影響

圖6的qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組Beclin1 mRNA表達(dá)無顯著增加；與模型組比較，電針組Beclin1 mRNA表達(dá)顯著增加(P<0.01)。

注：組間比較，

3 討論

急性腦缺血在中醫(yī)學(xué)中屬“中風(fēng)”范疇，病因病機(jī)多為腦脈痹阻、腦髓失養(yǎng)等，而人中穴為督脈所屬穴，可調(diào)督脈之經(jīng)氣，針感強(qiáng)烈，可醒神開竅、調(diào)和陰陽、鎮(zhèn)靜安神、解痙通脈，是治療急性腦缺血的經(jīng)驗(yàn)要穴[10]。百會(huì)穴居顛頂，與腦聯(lián)系甚密，通達(dá)陰陽脈絡(luò)，連貫周身經(jīng)穴，針刺百會(huì)可開竅醒腦,調(diào)理髓海。兩穴均是急性腦卒中臨床經(jīng)驗(yàn)要穴，合用可調(diào)節(jié)氣血，疏通腦絡(luò)。針灸作為祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的非藥物療法，其治療腦卒中的療效已被廣泛認(rèn)可。

查天柱等[11]通過臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)針刺能顯著改善缺血性腦卒中患者凝血功能，增加腦血流量，以促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)及干細(xì)胞增殖，加快神經(jīng)損傷修復(fù)。而關(guān)于針刺防治腦缺血再灌注損傷的機(jī)制研究目前還在不斷深入，已有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬參與針刺抑制腦缺血再灌注損傷的過程[10，12]。然而，針灸是通過抑制還是促進(jìn)細(xì)胞自噬改善腦缺血再灌注損傷目前尚無定論。黃亞光等[13]發(fā)現(xiàn)與模型組相比，電針可顯著減少自噬小體與皮層缺血區(qū)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值等，因此猜想電針預(yù)處理可能通過抑制自噬改善腦缺血再灌注損傷。而劉昊等[14]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，針刺可顯著改善大鼠神經(jīng)功能缺損，且與模型組相比，針刺組大鼠腦組織中LC3蛋白呈陽性表達(dá)，且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明顯升高，同時(shí)，針刺誘發(fā)的自噬水平較雷帕霉素組低，說明針刺可適度激活腦出血后自噬的水平，從而改善大鼠腦損傷程度。而本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，電針不僅顯著降低了腦缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損評(píng)分，降低腦梗死體積，且可上調(diào)自噬相關(guān)因子LC3-Ⅱ、Beclin1蛋白與Beclin1 mRNA的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞自噬以加速神經(jīng)元損傷的恢復(fù)，緩解再灌注損傷。

細(xì)胞自噬參與人類許多重要的生理病理過程[15]，如細(xì)胞生長、存活和分化的各階段，在抗癌、抗衰老和神經(jīng)保護(hù)等方面具有不同的作用[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，模型組自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1顯著上調(diào)，Beclin1 mRNA表達(dá)也顯著升高，說明自噬在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。LC3的形成來源于前體LC3通過蛋白水解或自噬體LC3-磷脂酰乙醇胺(PE)去離子化。在半胱氨酸蛋白酶Atg4的作用下，將LC3前體加工成可溶性LC3-Ⅰ，其與PE的作用下Atg7和Atg3形成的脂溶性LC3-Ⅱ-PE相關(guān)聯(lián)，與機(jī)體細(xì)胞膜的延伸直至自噬溶酶體形成相關(guān)[17-18]。LC3-Ⅱ是與自噬體相關(guān)的唯一可靠的標(biāo)記蛋白，其同時(shí)也存在于吞噬體。Beclin1在自噬的起始過程中起著重要的作用，主要通過與PI3K和Atg14形成三聚體，并持續(xù)招募自噬相關(guān)蛋白介導(dǎo)自噬的啟動(dòng)[19-20]。Beclin1作為自噬過程中不可缺少的調(diào)節(jié)因子，通過調(diào)節(jié)Ⅲ類PI3K依賴性的3-磷酸磷脂酰肌醇(PI3P)的產(chǎn)生以及隨后補(bǔ)充ATG蛋白促進(jìn)自噬體的形成，在自噬過程中起主導(dǎo)作用[21-23]。因此，LC3-Ⅱ與Beclin1是檢測自噬水平的2種關(guān)鍵生物標(biāo)志物。

綜上，通過電針MCAO大鼠人中、百會(huì)穴影響腦缺血再灌注損傷的研究，可知細(xì)胞自噬參與調(diào)控腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞的代謝與凋亡過程，且從細(xì)胞自噬的角度提示了電針預(yù)防腦卒中的保護(hù)機(jī)制，并證明了針刺治療腦血管等疾病多方位、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，為進(jìn)一步研究電針抗腦缺血再灌注損傷機(jī)制提供新思路和科學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但其具體通過何種通路影響自噬相關(guān)因子的表達(dá)目前尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。