汪洋，王玉娟，武九龍，徐天舒

(南京鼓樓醫(yī)院中醫(yī)科，江蘇 南京 210008)

卒中后抑郁(Post-stroke depression，PSD)是卒中后常見并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為情緒低落、興趣喪失、睡眠障礙等，嚴重者甚至?xí)凶詺?、自殺的行為[1]。其發(fā)病可能與炎癥細胞因子、神經(jīng)內(nèi)分泌、海馬神經(jīng)元再生障礙、卒中損傷部位等因素有關(guān)[2]。目前，針對腦卒中后抑郁的主要治療方法有藥物治療、心理治療和中醫(yī)干預(yù)等。藥物治療由于價格昂貴、起效慢、治療周期長等副作用，限制了其在臨床中的應(yīng)用[3]。中醫(yī)學(xué)認為，腦卒中后抑郁為“中風(fēng)”“郁癥”合病。其病位在腦，與五臟六腑的功能失調(diào)有關(guān)[4]。氣機不暢、氣血虧虛是其主要病因；發(fā)病機制為正虛邪中、血瘀痰阻、蒙蔽清竅；故治療應(yīng)以行氣活血、調(diào)理陰陽、寧心安神為治則。針刺法基于中醫(yī)的經(jīng)絡(luò)學(xué)說，是中醫(yī)治療中風(fēng)和郁證的常法。電針是在毫針針刺機體得氣后，將電針儀連接毫針輸出連續(xù)或斷續(xù)的脈沖電流，以達到防治疾病的一種針刺方法，具有可重復(fù)性、療效好、不良反應(yīng)少等優(yōu)勢[5]。近年來有很多臨床案例采用針刺療法治療PSD表現(xiàn)出良好治療效果，但是其作用機制尚不明確。故本研究通過制作PSD大鼠模型，探索電針療法對卒中后抑郁癥狀的改善作用，以及是否與血清炎癥因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子的調(diào)節(jié)及神經(jīng)功能保護有關(guān)。

1 材料

1.1 實驗動物

健康成年SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量220～250 g，斯貝福(北京)生物科技有限公司，許可證號：SCXK(京)2019-0010，飼養(yǎng)于室溫22～26 ℃，晝夜節(jié)律，相對濕度40%～70%，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 實驗試劑與儀器

大鼠白細胞介素-1β(IL-1β)酶聯(lián)免疫試劑盒(abcam，ab100767)，大鼠白細胞介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫試劑盒(abcam，ab234570)，大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫試劑盒(abcam，ab46070)，Anti-BDNF antibody(abcam，ab108319)，Anti-IGF1 antibody(abcam，ab36532)，Anti-NGF antibody(ab52918)，尼氏染色試劑盒(索萊寶，G1436)，蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(索萊寶，G1120)，鹽酸氟西汀(上海上藥中西醫(yī)有限公司，國藥準(zhǔn)字H19980114)，TTC染色液(索萊寶，G3005)。

生物倒置顯微鏡(OLYMPUS，IX73-A21PH)，全波長酶標(biāo)儀(Thermo，Multiskan Sky)，低溫離心機(Thermo，F(xiàn)resco17/17R)，電針儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)，切片機(徠卡，RM2235)，電泳及轉(zhuǎn)模系統(tǒng)(Bio-Rad，1658033)，凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司，4600)。

2 方法

2.1 實驗分組與模型建立

將適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后的大鼠隨機按假手術(shù)組、卒中后抑郁組、電針組、氟西汀組分為4組，每組10只。除假手術(shù)組外，參照Longa等[6]行大鼠中動脈阻塞手術(shù)(MCAO)，將線栓由頸外動脈插入大腦前動脈，完成大腦中動脈血流阻塞；假手術(shù)組，不插入線栓其余操作相同。除假手術(shù)組，其余組手術(shù)結(jié)束后2 h再灌注，按照Longa評分法，選取評分1～3分入組，手術(shù)結(jié)束后恢復(fù)1周后進行慢性不可以預(yù)測溫和刺激(CUMS)，每日選取1種刺激，持續(xù)28 d，建立大鼠PSD模型。MCAO模型結(jié)束24 h后用TTC染色計算梗死面積、HE染色驗證腦卒中模型成功建立。

2.2 給藥干預(yù)

從刺激之日開始，假手術(shù)組和卒中后抑郁組分別灌胃生理鹽水2 mL；電針組予30 min電針治療，取穴：取心俞、肝俞、神門、太沖、膻中、百會等穴，神門、太沖接電針儀，頻率2 Hz，電流強度以大鼠耐受為宜。氟西汀組灌胃鹽酸氟西汀5 mg/kg，每日1次，持續(xù)28 d。

2.3 TTC染色

MACO模型手術(shù)后，在假手術(shù)組和腦卒中組中隨機挑選3只大鼠，取腦，取出的腦組織放入-20 ℃冷凍30 min后，每隔2 mm切1片，切成5片。將腦片置于TTC染色液中，37 ℃水浴鍋中避光染色30 min，間或翻轉(zhuǎn)腦片，使染色均勻。染色后10%甲醛固定10 min拍照，并計算梗死面積。

2.4 HE染色

MACO模型手術(shù)后，在假手術(shù)組和腦卒中組中隨機挑選3只大鼠，取血后用生理鹽水灌注直至肝臟發(fā)白，再用4%的多聚甲醛灌注，充分固定后斷頭取腦，并用4%多聚甲醛固定24 h后，經(jīng)脫水、浸蠟和包埋，用石蠟切片機切成4 μm石蠟切片，烤片脫蠟后進行HE染色封片后，用顯微鏡觀察組織形態(tài)。

2.5 行為學(xué)指標(biāo)

2.5.1 糖水偏好實驗 快感缺乏是抑郁模型動物的主要癥狀，糖水偏好實驗用于檢測動物的快感缺乏癥狀。正式測試前，給予質(zhì)量濃度為1%的蔗糖水適應(yīng)24 h。適應(yīng)結(jié)束后，大鼠單籠飼養(yǎng)并禁水禁食12 h，然后每只大鼠分別給予提前稱質(zhì)量的1瓶質(zhì)量濃度為1%的蔗糖水和1瓶自來水，12 h后蔗糖水和自來水互換位置。再過12 h后，收集剩余的蔗糖水和自來水，再次稱質(zhì)量，并計算糖水偏好率(Sucrose preference，SP)。

SP=蔗糖水?dāng)z入量/(蔗糖水?dāng)z入量+自來水?dāng)z入量)×100%。

2.5.2 強迫游泳實驗 將治療后的所有動物進行強迫游泳實驗，將大鼠放入水深50 cm的圓柱形桶內(nèi)，桶內(nèi)水溫25 ℃，持續(xù)觀察6 min，并記錄后4 min內(nèi)不動時間，用攝像機拍攝記錄大鼠游泳過程。

2.5.3 曠場實驗 曠場實驗是用來評價動物在新環(huán)境下自主行為、探究行為和緊張度的方法。建立100 cm×100 cm×40 cm的立方體曠場，底面用黑線分成等面積的50塊小方格。以大鼠移動距離為活動評分，記錄大鼠在5 min內(nèi)活動距離。每次實驗后清理動物排泄物并保持曠場內(nèi)干燥整潔。

2.6 ELISA實驗

每組隨機取6只大鼠，在行為學(xué)檢測結(jié)束后，用10%水合氯醛進行麻醉，通過腹主動脈取血，裝入5 mL無抗凝劑負壓管內(nèi)，室溫靜置6 h后用3 000 r/min，離心20 min，取上清液待測。根據(jù)ELISA試劑盒說明書操作檢測血清中炎癥指標(biāo)IL-1β、IL-6、TNF-α在樣本中的含量。

2.7 Western blot實驗

取血后的大鼠，取大腦海馬部分，加入10倍體積的RIPA裂解液勻漿、離心取上清液為總蛋白。蛋白溶液加入一定體積的上樣緩沖液并通過高溫變性即得樣品，備用。經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳分別孵育一抗BDNF(1∶1 000)、IGF-1(1∶1 000)、NGF(1∶1 000)4 ℃過夜，二抗孵育后加入ECL顯影液放入凝膠成像儀中曝光并拍照保存。

2.8 免疫熒光

每組隨機挑選3只大鼠，在行為學(xué)檢測結(jié)束后，按照2.4的方法制作石蠟切片。石蠟切片經(jīng)過脫蠟水化，用0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液微波爐加熱保持微沸狀態(tài)10 min，雙氧水室溫孵育10 min，再用正常山羊血清室溫封閉30 min，一抗BDNF按1∶100稀釋，4 ℃過夜孵育。二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h，并用DAPI進行核復(fù)染。染色結(jié)束后用生物熒光顯微鏡觀察拍照，并統(tǒng)計陽性率。

2.9 尼氏染色

石蠟切片常規(guī)脫水至水，置于50～60 ℃尼氏染色液浸染30 min。95%乙醇迅速分化，之后經(jīng)乙醇、二甲苯脫水、封片。用顯微鏡觀察尼氏小體并拍照。

2.10 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 MCAO模型建立

完成MCAO手術(shù)后，經(jīng)神經(jīng)機能學(xué)評價，與假手術(shù)組相比，經(jīng)過MCAO手術(shù)的大鼠神經(jīng)機能評分明顯升高(P<0.01，圖1d)，說明腦卒中模型制備成功。經(jīng)過TTC染色，明顯看出MCAO手術(shù)后的大鼠腦梗死面積明顯增加(P<0.01，圖1c)。再通過HE染色病理切片證明，與假手術(shù)組相比，經(jīng)過MCAO手術(shù)的大鼠腦組織，大片神經(jīng)細胞稀疏且排列不規(guī)則，數(shù)量明顯減少。細胞質(zhì)水腫疏松，細胞核致密深染(圖1b)。以上實驗證明MCAO手術(shù)成功，完成腦卒中模型建立。

注：與假手術(shù)組相比，**P<0.01。

3.2 電針組對卒中后抑郁大鼠抑郁行為的影響

從腦卒中模型大鼠中挑選出行為學(xué)評分1～3分入組，手術(shù)結(jié)束后恢復(fù)1周后進行CUMS造模4周，建立PSD模型同時進行電針和氟西汀治療。最后一次給藥1 h后進行行為學(xué)檢測。糖水偏好實驗結(jié)果，與假手術(shù)組相比，卒中后抑郁組的糖水飲用比例明顯減少，而與卒中后抑郁組相比，經(jīng)過電針和鹽酸氟西汀治療后糖水飲用比例升高(P<0.01，圖2a)。在強迫游泳實驗中，與假手術(shù)組相比，卒中后抑郁組大鼠不動時間明顯增加，而與卒中后抑郁組相比，電針組和氟西汀組大鼠不動時間減小(P<0.01，圖2b)。曠場數(shù)據(jù)表明，電針和氟西汀均不是通過引起大鼠中樞興奮性產(chǎn)生抗抑郁作用，表明電針的安全性。

注：與卒中后抑郁組相比，**P<0.01。

3.3 電針對腦卒中抑郁大鼠炎癥因子的影響

ELISA結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，卒中后抑郁組大鼠血清中的IL-1β、IL-6和TNF-α含量顯著增加，而電針組和氟西汀組顯著降低了卒中后抑郁組大鼠血清中的IL-1β、IL-6和TNF-α含量(P<0.01，圖3)。

注：與卒中后抑郁組相比，**P<0.01。

3.4 電針對腦卒中抑郁大鼠神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響

Western blot結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，卒中后抑郁組大鼠海馬中BDNF、IGF-1和NGF含量顯著減小(P<0.01)，而電針組和氟西汀組與卒中后抑郁組相比，大鼠海馬中的BDNF、IGF-1和NGF含量顯著升高(P<0.01，圖4)。

注：與卒中后抑郁組相比，*P<0.05，**P<0.01。

3.5 電針治療可增加PSD大鼠海馬內(nèi)BDNF表達

免疫熒光結(jié)果表明，卒中后抑郁組海馬內(nèi)BDNF表達量相對于假手術(shù)組明顯減少，而電針組和氟西汀組明顯增加腦卒中抑郁大鼠海馬內(nèi)BDNF的表達(P<0.01，圖5)。

注：與卒中后抑郁組相比，**P<0.01。

3.6 電針對PSD大鼠神經(jīng)元受損的影響

采用尼氏染色法觀察神經(jīng)元的損傷情況，尼氏小體是分布于各種神經(jīng)細胞內(nèi)的小塊狀物質(zhì)，可被甲基紫、焦油紫等堿性染料染成紫藍色。尼氏小體會因生理狀態(tài)的變化而改變，當(dāng)神經(jīng)細胞受到刺激時，胞體內(nèi)的尼氏小體會明顯減少。經(jīng)尼氏染色的腦片可以看出，卒中后抑郁組尼氏小體缺失較為明顯(P<0.05)，表明神經(jīng)細胞損失嚴重，而給予電針組和氟西汀組治療可顯著改善卒中后抑郁大鼠的神經(jīng)元損傷，說明電針治療可改善PSD大鼠的神經(jīng)元損傷(P<0.01，圖6)。

注：與卒中后抑郁組相比，**P<0.01。

4 討論

腦卒中是一種急性腦血管疾病，起病急、愈后差，易伴隨出現(xiàn)抑郁、焦慮等情感功能障礙。卒中后抑郁為腦卒中后常出現(xiàn)的情感功能障礙之一，據(jù)相關(guān)報道顯示，25%～75%的腦卒中患者會出現(xiàn)腦卒中后抑郁障礙[7]。主要有情緒低落、食欲減退和睡眠障礙、自我效能感低下等表現(xiàn)。腦卒中后抑郁常規(guī)治療方法是在治療腦卒中藥物的基礎(chǔ)上給予抗抑郁藥物，最常見的抗抑郁方法是口服鹽酸氟西汀，但存在起效慢，伴隨胃腸道反應(yīng)、坐立不安等不良反應(yīng)的弊端[8]。

中醫(yī)認為，腦卒中后抑郁為“中風(fēng)”“郁證”之合病，患者多表現(xiàn)為“神”的異常，腦是主宰神的器官，故治療腦卒中后抑郁當(dāng)從腦論治。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的經(jīng)絡(luò)學(xué)說在治療精神疾病方面具有悠久的歷史，針刺即為經(jīng)絡(luò)學(xué)說實施治療的主要手段之一[9]。原絡(luò)調(diào)神針刺法是根據(jù)張道宗教授“病變在腦，首取督脈”的學(xué)術(shù)思想發(fā)展而來，通過針刺神門、太沖這2個原穴，調(diào)節(jié)陰陽平衡、通達臟腑氣血;針刺心俞、肝俞這2個背俞穴，發(fā)揮養(yǎng)心安神、疏肝理氣和益腎的功效;針刺膻中，寬胸理氣、協(xié)調(diào)陰陽;針刺百會穴，提升陽氣，開竅醒腦。故通過針刺心、肝的原穴及背俞穴再配合任脈、督脈穴位，共奏安神解郁、醒腦開竅的良好功效[10]。既往研究表明針刺刺激可對腦神經(jīng)進行信息反饋，幫助腦組織修復(fù)，在腦卒中康復(fù)治療中應(yīng)用較多[11]。本實驗研究表明，對PSD大鼠進行針刺治療后，抑郁相關(guān)的行為學(xué)體征得到了很好的改善作用，血清內(nèi)相關(guān)的炎癥指標(biāo)和神經(jīng)營養(yǎng)因子指標(biāo)也趨于向正常指標(biāo)靠攏；腦內(nèi)的BDNF水平和尼氏小體明顯增加。進一步證實了臨床療效的確切性。

發(fā)生腦卒中后，為去除損傷壞死組織、維持機體功能，機體IL-6、IL-1β和TNF-α炎癥指標(biāo)應(yīng)激性分泌增加，導(dǎo)致組織發(fā)生炎癥水腫，引發(fā)神經(jīng)功能損傷[12]。IGF-1是一種促生長細胞子，可通過血腦屏障，其水平升高可促進神經(jīng)細胞的再生，進而改善神經(jīng)功能；BDNF和NGF是作用于神經(jīng)元的細胞因子，其高表達可營養(yǎng)神經(jīng)，促進受損神經(jīng)元的再生，改善腦卒中后抑郁病情[13]。BDNF廣泛存在于海馬、大腦皮層等部位，作用是增加突出可塑性，營養(yǎng)并支持多種神經(jīng)元，提高神經(jīng)元生存率，減少神經(jīng)細胞凋亡，促進神經(jīng)再生[14]。尼氏小體是合成更新細胞器所需的結(jié)構(gòu)蛋白、合成神經(jīng)遞質(zhì)所需的酶類以及肽類的神經(jīng)調(diào)質(zhì)，可作為神經(jīng)元功能狀態(tài)的標(biāo)志。當(dāng)神經(jīng)元受到損傷時，尼氏小體可減少、解體甚至消失。本實驗結(jié)果顯示，經(jīng)過治療后，PSD模型大鼠的行為學(xué)指標(biāo)明顯好轉(zhuǎn)；與模型組相比，電針組和氟西汀組炎癥因子水平均降低，神經(jīng)營養(yǎng)因子水平升高；腦內(nèi)BDNF水平上升，尼氏小體也明顯增加。究其原因可能是，中醫(yī)針刺治療具有“經(jīng)脈所過，主治所及”的特點。針刺神門、太沖、百會等穴能增加腦內(nèi)血流量，減輕腦卒中帶來的腦組織損傷，同時調(diào)節(jié)腦組織內(nèi)血管活性物質(zhì)的含量，從而修復(fù)腦神經(jīng)元，達到改善神經(jīng)功能的目的[15]。針刺心俞、肝俞可調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺軸，從而抑制炎癥因子的釋放，減輕機體炎癥反應(yīng)；還能減少促腎上腺皮質(zhì)激素的釋放，有助于增加BDNF、IGF-1、NGF等神經(jīng)營養(yǎng)因子的含量，從而改善抑郁癥狀[12]。針刺太沖，具有熄肝風(fēng)、清頭目、疏肝養(yǎng)血的功效。

綜上所述，采用電針療法治療卒中后抑郁大鼠，可以很好地改善抑郁癥狀，減輕機體炎癥反應(yīng)，增加神經(jīng)營養(yǎng)因子，修復(fù)神經(jīng)元，減輕腦組織損傷，進一步闡明了針灸治療腦卒中后抑郁的相關(guān)機制。