李娟,張中樂,吳嘉珍,沈紅藝

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)公共健康學(xué)院，上海 201203；2.上海市第一人民醫(yī)院嘉定分院,上海 201203)

非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是指在沒有大量飲酒或其他繼發(fā)性脂肪肝原因下出現(xiàn)肝脂肪變性[1]，其特征是肝臟脂肪積累的增加，涵蓋了非酒精性單純性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)及其相關(guān)肝硬化、肝衰竭或肝癌[2]。NAFLD的發(fā)病率隨肥胖的增加而增加，肝臟游離脂肪酸(FFA)的增加是NAFLD發(fā)病機(jī)制的核心[3]。

沉默信息調(diào)節(jié)因子1(SIRT1)是Sirtuins家族的一員，研究表明SIRT1可以抑制脂肪從頭合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子碳水化合物應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(ChREBP)、膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)的表達(dá)；脂肪酸合成酶(FAS)是SREBP-1c的下游靶標(biāo)，也是FFA合成的關(guān)鍵酶，當(dāng)SREBP-1c被SIRT1抑制后，F(xiàn)AS的表達(dá)也會下降，從而減少新生脂肪的合成[4-6]。黃芩苷(BA)是從黃芩干燥根中提取的黃酮類化合物，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明黃芩苷具有調(diào)節(jié)血脂、抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用[7-9]。本實(shí)驗(yàn)通過體外誘導(dǎo)肝臟脂肪沉積模型，探討黃芩苷對肝臟脂肪沉積以及SIRT1相關(guān)因子表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞、藥物和試劑

HepG2細(xì)胞由中國科學(xué)院院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫提供；黃芩苷(wkq18013013)購自四川維克奇生物科技有限公司(純度大于98%)；胎牛血清(FBS)、高糖型DMEM、胰酶、PBS購自Gibco公司；DMSO、油酸(OA)、棕櫚酸(PA)、油紅O購自Sigma公司；雙抗(青鏈霉素)購自HyClone公司；細(xì)胞培養(yǎng)板、凍存管購自Corning公司；CCK-8試劑盒購自東仁化學(xué)科技(上海)有限公司；甘油三酯(TG)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；IL-6、TNF-α酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自武漢貝萊茵生物科技有限公司；SIRT1(ab110304)、SREBP-1c(ab3259)、ChREBP(ab92809)和FAS(ab133619)抗體購自Abcam公司；β-action(NM_001101)抗體購自上海拓然生物科技有限公司；山羊抗兔(ARG65351)、山羊抗鼠(ARG65350)IgG購自Arigo公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

在DMEM培養(yǎng)基中加入10%FBS、1%雙抗于37 ℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，待細(xì)胞生長密度達(dá)80%～90%時進(jìn)行傳代以及后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 黃芩苷對HepG2細(xì)胞的毒性測定

將7組不同濃度的黃芩苷(25、50、100、200、400、800、1 000 μmol/L)分別作用于HepG2細(xì)胞24、48、72 h，采用CCK-8法檢測這3個時間點(diǎn)的細(xì)胞生存率。

1.4 模型建立及分組

HepG2細(xì)胞以1×106個/孔接種于6孔板中，貼壁孵育24 h后，分別加入0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mmol/L FFA繼續(xù)孵育24 h，油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積以及GPO-PAP法測定細(xì)胞內(nèi)TG的濃度。根據(jù)不同的處理將細(xì)胞分為5組：正常對照組、模型組(0.75 mmol/L FFA)、低劑量黃芩苷組(0.75 mmol/L FFA+50 μmol/L BA)、中劑量黃芩苷組(0.75 mmol/L FFA+100 μmol/L BA)、高劑量黃芩苷組(0.75 mmol/L FFA+200 μmol/L BA)。首先取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以接種于培養(yǎng)皿中，貼壁孵育24 h后，在模型組和藥物組中加入0.75 mmol/L FFA(OA∶PA=2∶1)工作液孵育(對照組加入等量DMEM培養(yǎng)基預(yù)處理)24 h后，在藥物組中加入相應(yīng)濃度的BA、模型組中加入等量的DMEM，孵育24 h。

1.5 HepG2細(xì)胞內(nèi)TG測定

將HepG2細(xì)胞以1×106個/孔的密度接種于6孔板內(nèi)，干預(yù)結(jié)束后收集細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，按試劑盒說明書提供的操作方法采用GPO-PAP法測定細(xì)胞內(nèi)TG的濃度。

1.6 炎癥因子TNF-α、IL-6檢測

將HepG2細(xì)胞以1×106個/孔接種于6孔板內(nèi)，按實(shí)驗(yàn)分組對細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)干預(yù)，采用ELISA法檢測細(xì)胞上清液中的炎癥因子IL-6和TNF-α的含量。

1.7 油紅O染色

將0.5 g油紅O粉末溶于100 mL異丙醇，配制成濃度為0.5%的油紅O存儲液；HepG2細(xì)胞干預(yù)結(jié)束后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入4%的多聚甲醛固定1 h后加入60%異丙醇孵育5 min；稀釋油紅O存儲液(去離子水∶油紅O存儲液=2∶3，濾膜過濾，避光靜置10 min)，染色30 min后沖洗，加入蘇木精孵育1～3 min，沖洗，拍照。

1.8 HepG2細(xì)胞蛋白表達(dá)測定

采用Western blot法檢測細(xì)胞內(nèi)SIRT1、SREBP-1c、ChREBP、FAS的蛋白表達(dá)水平。HepG2細(xì)胞干預(yù)后，收集細(xì)胞提取總蛋白，取各組蛋白在SDS-PAGE膠中電泳分離各蛋白。轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗(1∶1 000～1∶5 000稀釋抗體)孵育過夜，TBST清洗3次，每次10 min，加入1∶5 000稀釋后的二抗，搖床孵育1 h，TBST清洗3次后采用化學(xué)發(fā)光進(jìn)行顯影，拍照，采用Image J進(jìn)行蛋白半定量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 黃芩苷對HepG2細(xì)胞生存率的影響

CCK-8結(jié)果顯示：與空白組相比，當(dāng)黃芩苷濃度高于200 μmol/L時，隨干預(yù)時間的增加，黃芩苷對HepG2細(xì)胞生長具有抑制作用，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，因此，選擇50、100、200 μmol/L作為藥物干預(yù)濃度。見圖1。

2.2 HepG2細(xì)胞脂肪沉積模型的建立

2.2.1 不同濃度FFA對HepG2脂肪沉積的影響 如圖2所示，各組細(xì)胞經(jīng)油紅O染色后，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：正常組細(xì)胞排列較為緊密，細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)輕微染色；0.25 mmol/L FFA組染色結(jié)果與正常組相近，未發(fā)現(xiàn)明顯脂肪空泡，隨著FFA濃度的增加，0.5～1.25 mmol/L FFA組細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)不同程度的紅色脂滴積聚，細(xì)胞質(zhì)染色明顯。

注：A.空白對照；B.0.25 mmol/L FFA組；C.0.5 mmol/L FFA組；D.0.75 mmol/L FFA組；E.1 mmol/L FFA組；F.1.25 mmol/L FFA組

TG結(jié)果顯示，加入不同濃度FFA溶液干預(yù)24 h后，各組細(xì)胞內(nèi)TG含量均呈上升趨勢，0.25 mmol/L FFA組與空白組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，0.5 mmol/L FFA組及以上濃度組與空白組相比，細(xì)胞內(nèi)TG含量均顯著上升(P<0.05)，見圖3。

注：與空白組相比，

2.2.2 不同濃度FFA對HepG2細(xì)胞生存率的影響 CCK8結(jié)果見表1。因此選擇0.75 mmol/L FFA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞建立脂肪沉積模型。

表1 不同濃度FFA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞生存率的比較

2.3 黃芩苷對FFA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪沉積的影響

如圖2所示，各組細(xì)胞經(jīng)油紅O染色后，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：正常組細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)輕微染色；FFA干預(yù)后，模型組細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量紅色脂滴，細(xì)胞質(zhì)染色明顯；黃芩苷干預(yù)后，與模型組相比，細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴隨藥物干預(yù)濃度的增加而減少，染色變淺。與正常組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)TG含量顯著上升；中劑量黃芩苷組與高劑量黃芩苷組細(xì)胞內(nèi)TG含量與模型組相比顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4～5。

A.正常組；B.模型組；C.低劑量黃芩苷；D.中劑量黃芩苷；E.高劑量黃芩苷

注：與空白組相比，△P<0.05；與模型組相比，*P<0.05。

2.4 黃芩苷對FFA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞上清液炎癥因子IL-6、TNF-α水平的影響

與正常組相比，模型組細(xì)胞上清液TNF-α和IL-6水平呈上升趨勢，黃芩苷干預(yù)后，隨黃芩苷干預(yù)濃度的增加，細(xì)胞上清液TNF-α、IL-6的水平有所下降，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組細(xì)胞上清液炎癥因子IL-6、TNF-α水平的比較

2.5 黃芩苷對細(xì)胞內(nèi)SIRT1、SREBP-1c、CHREBP、FAS蛋白表達(dá)的影響

SIRT1蛋白表達(dá)：與正常組相比，經(jīng)FFA誘導(dǎo)的模型組細(xì)胞內(nèi)SIRT1蛋白表達(dá)顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，不同濃度黃芩苷(中劑量、高劑量組)干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)SIRT1蛋白表達(dá)明顯上升(P<0.01)。SREBP-1c蛋白表達(dá)：與正常組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)SREBP-1c蛋白表達(dá)明顯上升(P<0.05)；與模型組相比，中、高劑量黃芩苷組細(xì)胞內(nèi)SREBP1c蛋白表達(dá)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。ChREBP蛋白表達(dá)：與正常組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)ChREBP蛋白表達(dá)具有上升的趨勢，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組相比，不同濃度黃芩苷(50、100、200 μmol/L組)干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)ChREBP蛋白表達(dá)顯著下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05～0.01)。FAS蛋白表達(dá)：與正常組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)FAS蛋白表達(dá)明顯上升(P<0.05)，與模型組相比，中、高劑量黃芩苷組細(xì)胞內(nèi)FAS的蛋白表達(dá)明顯下降(P<0.01)，如圖6所示。

注：A.正常組；B.模型組；C.低劑量黃芩苷；D.中劑量黃芩苷；E.高劑量黃芩苷。與空白組相比，△P<0.05；與模型組相比，

3 討論

NAFLD疾病早期是由于TG在肝臟內(nèi)過度積累而導(dǎo)致肝臟脂肪變性，非侵入性的FFA是評價NAFLD的重要指標(biāo)[10]。研究表明飲食習(xí)慣、環(huán)境和遺傳因素可導(dǎo)致胰島素抵抗、肥胖伴脂肪細(xì)胞增殖和腸道微生物群的改變，可以引起的肝臟游離脂肪酸通量增加導(dǎo)致兩種不同情況：TG的合成和積累以及脂肪酸、游離膽固醇和其他脂質(zhì)代謝物的“有毒”水平導(dǎo)致線粒體氧化應(yīng)激功能障礙產(chǎn)生活性氧(ROS)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激激活UPR，從而導(dǎo)致肝炎[11]。在此過程中涉及眾多細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)；乙酰輔酶A羧化酶、SREBP-1c、ChREBP是調(diào)節(jié)新生脂肪形成的關(guān)鍵因子；飲食中攝入的高濃度的脂肪、葡萄糖會激活肝臟中的SREBP-1c和ChREBP，繼而激活下游因子FAS，F(xiàn)AS作為從頭合成脂肪的關(guān)鍵酶，被激活后，會在肝臟中合成TG[12-13]。

SIRT1被譽(yù)為“人類長壽基因”，近年來對其在肝臟脂肪代謝相關(guān)領(lǐng)域的研究愈來愈受關(guān)注。研究表明，高脂飲食誘導(dǎo)會引起肝臟SIRT1蛋白表達(dá)減少，而SIRT1能夠使SREBP-1c的去乙?；黾樱偈蛊浞核鼗偷鞍酌阁w降解，從而降低其穩(wěn)定性和脂肪合成基因的比率，抑制肝臟脂肪合成[14-15]。

本研究通過FFA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞脂肪變性，建立體外肝臟脂肪沉積模型，用黃芩苷進(jìn)行干預(yù)。通過油紅O染色觀察細(xì)胞中脂滴的狀態(tài)，GPO-PAP酶法檢測細(xì)胞內(nèi)TG的含量，ELISA法測定細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6的水平以及Western blot法測定細(xì)胞中SIRT1、SREBP-1c、ChREBP和FAS的蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)：游離脂肪酸可以顯著增加細(xì)胞中TG的含量，抑制SIRT1、SREBP-1c以及FAS的表達(dá)。黃芩苷(中、高劑量組)干預(yù)后，可以減少HepG2細(xì)胞內(nèi)脂滴的數(shù)量，降低TG的含量，抑制SREBP-1c、ChREBP和FAS的蛋白表達(dá)，促進(jìn)SIRT1的蛋白表達(dá)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明黃芩苷具有明顯的減脂作用，能有效改善肝臟脂肪沉積，其相關(guān)機(jī)制可能與黃芩苷通過促進(jìn)肝臟細(xì)胞SIRT1的表達(dá)，抑制其下游因子SREBP-1c、ChREBP和FAS的激活，從而減少肝臟脂肪從頭合成，減低肝臟脂肪的積累有關(guān)。而ELISA法檢測細(xì)胞上清液中炎癥因子TNF-α、IL-6的水平發(fā)現(xiàn)，各組細(xì)胞上清液中TNF-α和IL-6的水平無明顯差別(P>0.05)，這可能與高脂溶液誘導(dǎo)時間較短或者高脂溶液的濃度較低相關(guān)。

綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)黃芩苷能夠改善FFA誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞脂肪沉積，降低細(xì)胞內(nèi)TG的含量，其機(jī)制可能與上調(diào)SIRT1，下調(diào)ChREBP、SREBP-1c以及FAS有關(guān)，并且可能通過SIRT1/SREBP-1c通路發(fā)揮降脂作用。