謝海納，潘志強

(上海中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，上海 201203)

皮質醇增多癥是腎上腺皮質長期分泌過量皮質激素引起的綜合征，其中，促腎上腺皮質激素(ACTH)非依賴性皮質醇增多癥是由于腎上腺皮質腫瘤或增生導致自主分泌過量皮質醇。血液中高皮質醇通過影響血糖、血脂、電解質和其他激素的平衡，會導致滿月臉、向心性肥胖、高血壓、痤瘡、繼發(fā)性糖尿病、月經失調、性功能障礙、骨質疏松等臨床表現(xiàn)。

中醫(yī)臨床發(fā)現(xiàn)皮質醇增多癥常伴隨陰虛內熱證候發(fā)生，采用滋陰清熱中藥比如黃柏、知母、丹皮、生地黃、鱉甲等均有助于改善證候。其中，黃柏是代表性的中藥，其性苦、寒，歸腎、膀胱經，具有清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡的功效。現(xiàn)代藥理研究表明[1-2]，黃柏含有小檗堿、黃柏堿、黃柏酮等多種活性成分，其中小檗堿具有抗菌、抗炎、解熱、降血糖、降血壓、免疫調節(jié)、抗腫瘤、抗衰老等藥理活性，而對黃柏堿、黃柏酮的抗炎、抗腫瘤活性也有散在報道[3-5]。本研究在探索黃柏主要成分對腎上腺皮質激素合成影響過程中，發(fā)現(xiàn)黃柏酮具有抑制Y1細胞皮質酮合成與分泌作用，茲報道如下。

1 材料

1.1 藥品與試劑

黃柏酮(分子式:C26H30O7，分子量:454.51，分子結構見圖1)。

圖1 黃柏酮的分子結構

米托坦(Sigma-Aldrich，貨號：SML1885);Cell Cycle Staining(聯(lián)科生物，貨號：A92380144)試劑盒；Mito-Tracker Green線粒體綠色熒光探針(上海碧云天生物技術公司，貨號：C1048)；Hoechst 33342活細胞染色液(100×)(上海碧云天生物技術公司，貨號：C1029)；乳酸脫氫酶(LDH)細胞毒性檢測試劑盒(上海碧云天生物技術公司,貨號：C0017)。RIPA裂解液(上海碧云天生物技術公司，貨號：P0013C)；RNAiso Plus(TaKaRa，貨號：9109)，PrimeScript?RT reagent Kit(TaKaRa，貨號：RR036A)，SYBR?Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)Ⅱ(TaKaRa，貨號：RR820A)；小鼠皮質酮ELISA試劑盒(Cayman，貨號：501320)，β-actin抗體(Sigma-Aldrich，貨號：A5441)；類固醇合成急性調節(jié)蛋白(StAR)抗體(Abcam，貨號：ab96637)、膽固醇側鏈裂解酶(CYP11A1)抗體(Abcam，貨號：ab175408)、11β-羥化酶1(CYP11B1)(Abcam，貨號：ab229884)、Mitofusin 1(Mfn1)(Abcam，貨號：ab129154)、Mitofusin 2(Mfn2)(Abcam，貨號：ab124773)。

胎牛血清(Corning，貨號：35-015-CV)、100 U/L青鏈霉素(Corning，貨號：30-002-CIa)、DMEM-F12培養(yǎng)液(Corning，貨號：10-092-CV)，胰蛋白酶-EDTA溶液(Sigma-Aldrich，貨號：T3924)。采用Primer3(v0.4.0)在線軟件設計引物并委托Life Technologies公司合成，見表1。

表1 引物序列

1.2 儀器

實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司，QuantStudio 3型)；酶標儀(美國BioTek公司，Elx800型)；臺式冷凍離心機(德國Eppendorf公司，5417R型)；小型垂直電泳槽(美國BIO-RAD公司)，轉膜儀(Mini-PROTEAN Tetra型)；化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國Protein-Simple公司，Alpha型)；流式細胞儀(美國Beckman公司，CytoFlex S型)；激光掃描共聚焦顯微鏡(德國Leica公司，SP-8型)。

2 方法

2.1 MTT法檢測黃柏酮對Y1細胞活性的影響

Y1細胞種植于96孔板中，每孔細胞密度1×104，次日采用2.5～160 μmol/L黃柏酮干預24 h后，吸棄培養(yǎng)液并用PBS沖洗1次。加入5 g/L的MTT溶液(避光保存)繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，棄上液加入150 μL的DMSO，在搖床上避光混勻15 min后，在酶標儀上檢測OD570讀數(shù)值。每個濃度組設4個復孔，獨立重復2次實驗。

2.2 黃柏酮對細胞毒性(LDH法)的影響

采用含10%血清生長培養(yǎng)液，將Y1細胞種植于96孔板中，次日采用低血清培養(yǎng)液(含體積分數(shù)為1%的血清)配藥，經過40～160 μmol/L黃柏酮處理24 h后，依據LDH細胞毒性檢測試劑盒使用說明，采用Y1細胞培養(yǎng)上液，檢測細胞培養(yǎng)液中LDH含量。

2.3 流式細胞術檢測黃柏酮對Y1細胞周期的影響

采用6孔板鋪板Y1細胞，以80 μmol/L黃柏酮處理24 h，50 μmol/L米托坦作為陽性對照，用0.25%胰酶-EDTA消化，PBS洗1次后采用Cell Cycle Staining試劑盒進行PI單染，避光孵育30 min后在流式儀中檢測細胞周期。

2.4 共聚焦顯微鏡檢測黃柏酮對Y1細胞線粒體膜的影響

采用共聚焦顯微鏡專用培養(yǎng)皿進行鋪板，80 μmol/L黃柏酮與50 μmol/L米托坦干預24 h后，吸出培養(yǎng)液，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，固定5～10 min后，PBS洗2次，先用Mito-Tracker Green線粒體綠色熒光探針染色，再用Hoechst 33342活細胞染色液染色，在激光共聚焦下拍攝細胞染色照片。

2.5 ELISA法檢測細胞分泌液皮質酮含量

Y1細胞在低血清培養(yǎng)液(血清體積分數(shù)為1%)中，經過80 μmol/L黃柏酮處理24 h后，收集細胞培養(yǎng)上清液，依據ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測未稀釋的原液中皮質酮含量。

2.6 qPCR檢測黃柏酮對Y1細胞皮質酮合成酶mRNA表達

采用6孔板鋪板Y1細胞，以40、80、160 μmol/L黃柏酮干預Y1細胞24 h，及80 μmol/L黃柏酮干預Y1細胞24、36、48 h。按照RNAiso Plus試劑盒說明書抽提細胞總RNA；逆轉錄反應體系20 μmol/L，反應條件為37 ℃×15 min，85 ℃×5 s，4 ℃；PCR擴增反應體系為20 μL，反應程序為95 ℃×3 min，95 ℃×5 s，60 ℃×30 s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析。

2.7 Western blot檢測黃柏酮對Y1細胞皮質酮合成酶蛋白表達

采用6孔板鋪板Y1細胞，以80 μmol/L黃柏酮干預Y1細胞24 h，采用RIPA裂解液處理Y1細胞，收集蛋白質樣品并予以定量，通過變性處理，分別執(zhí)行聚丙烯凝膠電泳、轉膜、封閉、一抗孵育、洗滌、二抗孵育、再洗滌、顯影等實驗流程，其中，一抗?jié)舛葍葏ⅵ?actin以1∶20 000稀釋，抗體StAR、CYP11A1、CYP11B1均以1∶2 000稀釋；Mfn1以1∶10 000稀釋；Mfn2以1∶5 000稀釋。以β-actin為內參對照，分析蛋白相對表達量。

2.8 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 黃柏酮對Y1細胞活性的影響

采用2.5～160 μmol/L黃柏酮干預Y1細胞24 h，MTT法檢測細胞OD570讀數(shù)值。結果顯示，與對照組比較，2.5～40 μmol/L黃柏酮對細胞的抑制率約為35%(P<0.01)，160 μmol/L黃柏酮對細胞抑制率達60%以上(P<0.01)。提示黃柏酮可以顯著抑制Y1細胞活性。進而檢測黃柏酮對細胞毒性的影響，結果顯示，80 μmol/L以上黃柏酮對Y1細胞有10%～20%的毒性作用。見圖2。

注：與對照組比較，。

3.2 黃柏酮對細胞周期的影響

結果見圖3。與對照組比較，80 μmol/L黃柏酮與50 μmol/L米托坦均導致G1期細胞顯著增加(P<0.01)，表明黃柏酮具有阻滯Y1細胞周期于G1期的作用。

注：與對照組比較，。

3.3 黃柏酮對Y1細胞線粒體膜的影響

與對照組比較，米托坦處理后細胞線粒體增亮；黃柏酮處理后細胞線粒體更加明亮，提示黃柏酮可能通過影響線粒體膜擴張導致線粒體膜更加豐富，從而影響線粒體膜類固醇激素合成酶功能及其皮質酮合成過程，見圖4。進而檢測了黃柏酮對線粒體膜蛋白表達，發(fā)現(xiàn)黃柏酮顯著抑制Mfn1、Mfn2蛋白表達(P<0.01)，提示黃柏酮可影響線粒體功能，見圖5。

對照組 米托坦組 黃柏酮組

注：與對照組比較，。

3.4 黃柏酮對Y1細胞皮質酮分泌的影響

與對照組比較，黃柏酮可降低皮質酮含量，提示黃柏酮可能具有抑制Y1細胞皮質酮分泌的作用，見圖6。

注：與對照組比較，

3.5 不同濃度黃柏酮對Y1細胞皮質酮合成酶基因表達的影響

本實驗采用40～160 μmol/L黃柏酮干預Y1細胞24 h，檢測皮質酮合成酶基因表達。與對照組比較，各濃度黃柏酮均顯著抑制Cyp11a1、Cyp11b1、Hsd3b2、SF-1基因表達(P<0.05～0.01)，160 μmol/L黃柏酮顯著增強Star、Cyp21a1、Nr4a1、Nr4a2基因表達(P<0.01)，見圖7。由于Star、Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1是皮質酮合成的重要酶的基因，Nr4a1、Nr4a2、SF-1、Hsd3b2是調節(jié)各酶的重要轉錄因子，提示黃柏酮主要通過抑制皮質酮合成酶基因表達，抑制皮質酮合成過程。

注：與對照組比較，。

3.6 黃柏酮48 h對Y1細胞皮質酮合成酶基因表達的影響

進一步檢測黃柏酮延長給藥至48 h后對Y1細胞類固醇激素合成酶基因表達的影響。與對照組比較，黃柏酮持續(xù)給藥48 h內，均顯著抑制Cyp11a1、Cyp21a1、Cyp11b1、Hsd3b2基因表達(P<0.01)，然而促進Star基因表達(P<0.01)，見圖8。

注：與對照組比較，。

3.7 黃柏酮對Y1細胞皮質酮合成酶蛋白表達的影響

與對照組比較，黃柏酮與米托坦均顯著抑制CYP11A1和StAR蛋白表達(P<0.01)，見圖9，提示黃柏酮可能主要通過CYP11A1酶發(fā)揮抑制皮質酮生成的作用。

注：與對照組比較，

4 討論

腎上腺皮質細胞是合成皮質激素的主要場所(人類有活性的是皮質醇，嚙齒動物有活性的是皮質酮)。皮質激素合成以膽固醇為原料，經線粒體外膜StAR接受膽固醇后快速轉運到線粒體內膜，在線粒體內膜P450側鏈裂解酶(P450scc，由Cyp11a1基因編碼)作用下，膽固醇裂解為孕烯醇酮，再經線粒體-內質網相關連接膜(Mitochondria-ER associated membranes,MAMs)轉運到內質網，在內質網相關酶3β-HSD、CYP21A作用下合成各種類固醇激素的中間產物，最后類固醇激素中間產物經MAMs返回穿梭至線粒體內，在CYP11B1作用下合成皮質酮。因此，皮質酮合成量主要受線粒體膜上重要酶的影響，腎上腺皮質癌一線治療的靶向藥物米托坦的藥理作用機制正是通過作用于線粒體抑制了類固醇激素合成酶的活性，從而阻止了皮質細胞激素的合成過程。

臨床皮質醇增多癥所致的陰虛內熱常使用黃柏，因此，本研究選擇黃柏所含成分黃柏酮進行了研究。黃柏酮主要來源于蕓香科柑橘屬、能清熱解毒燥濕的黃柏、白鮮皮等，研究發(fā)現(xiàn)黃柏酮具有抗炎[6-7]、防治肺損傷和肺纖維化[8]等作用。此外，黃柏酮在乳腺癌、胰腺癌、結腸癌等多種癌癥中具有抑制細胞增殖和促進細胞凋亡的作用[9-12]，也可通過下調Akt磷酸化水平來抑制血管平滑肌細胞的增殖，減輕內膜增生，抑制靜脈橋再狹窄的發(fā)生[13]。本研究發(fā)現(xiàn)黃柏酮具有顯著抑制Y1小鼠腎上腺皮質瘤細胞活性，且黃柏酮與米托坦一樣，均顯著阻滯細胞于G1期，提示黃柏酮可以通過阻滯細胞周期以抑制細胞增殖。

值得注意的是，本研究重點探索了黃柏酮對線粒體膜的影響，通過共聚焦顯微鏡，發(fā)現(xiàn)黃柏酮可以導致Y1細胞線粒體膜亮度增強，進一步檢測了線粒體膜上重要的標志性蛋白Mfn1與Mfn2，以及合成皮質酮的線粒體膜類固醇激素合成酶，發(fā)現(xiàn)黃柏酮可抑制Cyp11b1基因表達，提示黃柏酮可以通過影響線粒體膜結構及相關功能分子，從而抑制皮質酮合成與分泌。此外，黃柏酮還顯著抑制了定位于內質網的脫氫酶HSD3B2與胞漿中的轉錄因子SF-1，SF-1參與類固醇激素合成酶CYP11A1、CYP11B1、HSD3B2的調控作用，且隨著給藥時間延長，上述基因被抑制得更加顯著，提示黃柏酮可能靶向作用于類固醇激素合成酶及其轉錄調控因子，從而抑制了皮質酮合成過程。然而，160 μmol/L黃柏酮卻顯著增強孤兒核受體Nr4a1、Nr4a2基因表達，也促進Star與Cyp21a1基因表達，其中，Star、Nr4a1、Nr4a2屬于即刻早期基因，Cyp21a1可轉錄定位于內質網上的皮質酮前體物質合成酶，提示黃柏酮處理Y1細胞后，可能導致細胞代償性反應。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)了黃柏酮可抑制腎上腺皮質激素合成與分泌，臨床使用黃柏治療具有陰虛內熱證的皮質醇增多癥患者，黃柏酮是其藥效發(fā)揮的重要物質基礎。