楊春媚，戴小斌，鄭維維，錢(qián)程，劉洋，楊葛俊，鄭孟凱，陸茵，王愛(ài)云

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.江蘇省中藥藥效與安全性評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023；3.浙江施強(qiáng)制藥有限公司，浙江 杭州 311508)

勃起功能障礙(Erectile dysfunction,ED)指陰莖不能持續(xù)達(dá)到或維持足以進(jìn)行性行為的勃起狀態(tài)，是男性泌尿科常見(jiàn)的疾病之一，涉及血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌、心肌、神經(jīng)和激素系統(tǒng)的綜合同步作用[1-2]。目前，臨床用于治療ED的常用藥物包括PDE5抑制劑和中成藥等。PDE5抑制劑通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制磷酸二酯酶，抑制cGMP水解，松弛平滑肌，使血液流入陰莖組織，刺激機(jī)體產(chǎn)生勃起[3]。但長(zhǎng)期使用PDE5抑制劑會(huì)引起一系列的不良反應(yīng)，尤其會(huì)對(duì)心血管造成嚴(yán)重?fù)p傷[4]。

ED屬于中醫(yī)學(xué)精濁和陽(yáng)痿范疇，其主要病理特點(diǎn)是肝郁，并且具有一定普遍性。發(fā)病的主要病理趨勢(shì)是腎虛，發(fā)病的最終病理趨勢(shì)是血瘀[5]。因此，中醫(yī)對(duì)ED的論治以肝、腎為中心，以疏肝、益腎、活血為基本治法。男科臨床上常用的活血化瘀藥有紅花、丹參、三七、川芎等，皆入肝經(jīng)，以疏通宗筋之血脈。

山海丹顆粒作為活血化瘀類(lèi)中成藥，全方由丹參、決明子、葛根、山羊血、麥冬、靈芝、人參、佛手、黃芪、紅花、香附、蒲黃、海藻、何首烏、川芎、三七16味藥材組成，具有活血化瘀、通脈止痛、降低血脂的功效。臨床研究顯示，山海丹顆粒可以改善ED患者的內(nèi)皮功能，和復(fù)方玄駒膠囊聯(lián)用能治療高血脂癥患者的勃起功能障礙[6]。前期課題組采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)山海丹顆?；钚猿煞趾图膊“悬c(diǎn)進(jìn)行整合篩選，初步發(fā)現(xiàn)山海丹顆?？赡芡ㄟ^(guò)凋亡途徑和靶向NOS等關(guān)鍵蛋白來(lái)發(fā)揮治療ED的作用[7]。據(jù)此，在本研究中，我們進(jìn)一步探索了山海丹顆粒對(duì)ED的改善作用和相關(guān)機(jī)制，以期為山海丹顆粒的臨床應(yīng)用和ED疾病治療提供一定的理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康Wistar大鼠，體質(zhì)量250～300 g，140只，雌雄各半，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2016-0006，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(蘇)2014-0001。涉及的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定章程，動(dòng)物倫理批號(hào)：202101A038。

1.2 藥品和試劑

山海丹顆粒(浙江施強(qiáng)制藥有限公司，批號(hào)：20190402)；西地那非(廣州白云山醫(yī)藥集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20143255，批號(hào)：1190004)；疏肝益陽(yáng)膠囊(貴州益佰制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z20110030，批號(hào)：180818)；鹽酸阿樸嗎啡(APO)(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100839-201502)。一步法TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(金益柏，批號(hào)：DWSJH)；抗熒光淬滅封片液(Beyotime，批號(hào)：P0126)。RIPA裂解液(南京化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：080960574)；BCA試劑盒(Thermo Scientific，批號(hào)：MJ164047)；ECL試劑盒(Millipore,批號(hào)：17104B4)；nNOS抗體(博奧森，批號(hào)：AH06118332)；iNOS抗體(博奧森，批號(hào)：AI10161987)；eNOS抗體(博奧森，批號(hào)：AI11186519)；p38抗體(Cell Signaling Technology，批號(hào)：8690S)；p-p38抗體(Cell Signaling Technology，批號(hào)：4511S)；GAPDH(BIOWORLD公司，批號(hào)：AA55151)。PCR引物序列(上海生工生物合成有限公司)。

1.3 儀器

小動(dòng)物麻醉機(jī)(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，型號(hào)：R540)；石蠟包埋儀(LEICA公司，型號(hào)：EG1150c)；石蠟切片機(jī)(LEICA公司，型號(hào)：RM2245)；蔡司倒置顯微鏡(ZEISS公司，型號(hào)：Discovery V20)；多孔離心機(jī)(Beckman公司，型號(hào)：Allegra X30-R)；電泳儀(BIO-RAD公司，型號(hào)：Mini Protean 3 Cell)；凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司，型號(hào)：ChemiDocTMXRS+)；酶標(biāo)儀(BioTek公司，型號(hào)：270133)；梯度PCR儀(Thermo Fisher Scientific公司，型號(hào)：Applied Biosystems Life Veriti96)；熒光定量PCR儀(BIO-RAD公司，型號(hào)：iQ5)。

2 方法

2.1 動(dòng)物造模和給藥

將3月齡雄性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，經(jīng)交配實(shí)驗(yàn)確認(rèn)有正常的勃起和性功能，再隨機(jī)分為正常組、模型組、西地那非組、疏肝益陽(yáng)膠囊組、山海丹顆粒低劑量組、山海丹顆粒中劑量組、山海丹顆粒高劑量組，每組10只。除正常組外，其余組均選用雙側(cè)髂內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎法建立血管性勃起障礙模型，即使用異氟烷呼吸機(jī)將大鼠麻醉，從腹部切開(kāi)皮膚，暴露股動(dòng)脈，沿股動(dòng)脈小心分離至髂內(nèi)動(dòng)脈，使用8-0結(jié)線扎雙側(cè)髂內(nèi)動(dòng)脈。正常組只暴露血管不結(jié)扎。術(shù)后觀察2周，選取無(wú)感染并發(fā)癥大鼠。之后對(duì)大鼠進(jìn)行APO檢測(cè)實(shí)驗(yàn)，將APO按100 μg/kg注射于大鼠頸項(xiàng)皮膚松軟處，記錄30 min內(nèi)勃起次數(shù)，以陰莖頭充血、陰莖體增長(zhǎng)、末端陰莖體出現(xiàn)算勃起1次，勃起次數(shù)不多于1次算作造模成功。

山海丹顆粒和西地那非臨用前用雙蒸水溶解；疏肝益陽(yáng)膠囊稱(chēng)取適量細(xì)粉用雙蒸水配置成一定濃度的混懸液。所有藥物現(xiàn)配現(xiàn)用。灌胃給藥持續(xù)8周，灌胃體積為每100 g給藥1.2 mL。按照臨床劑量換算，分別給大鼠西地那非0.010 5 g/(kg·d),疏肝益陽(yáng)膠囊0.315 g/(kg·d)。山海丹顆粒低劑量組3.15 g/(kg·d)，山海丹顆粒中劑量組6.30 g/(kg·d)，山海丹顆粒高劑量組12.60 g/(kg·d)，其中以臨床給藥換算劑量作為低劑量。正常組和模型組均給予等體積雙蒸水。

2.2 大鼠交配實(shí)驗(yàn)測(cè)定性行為學(xué)指標(biāo)

觀察時(shí)選擇安靜、燈光昏暗的房間，從夜間7點(diǎn)開(kāi)始，每只雄鼠放入觀察籠后，適應(yīng)環(huán)境10 min，隨后放入1只雌鼠與之同籠，并開(kāi)始計(jì)時(shí)20 min，記錄20 min內(nèi)的撲捉潛伏期和射精潛伏期。撲捉潛伏期指自雌鼠投入至雄鼠第一次撲捉雌鼠的時(shí)間；射精潛伏期指自雌鼠投入至雄鼠第一次射精時(shí)間。

2.3 體質(zhì)量和臟器指數(shù)檢測(cè)

每周記錄各組大鼠的體質(zhì)量。末次給藥結(jié)束后，注射過(guò)量空氣處死大鼠，取各組大鼠的肝、腎、前列腺、陰莖和睪丸，稱(chēng)質(zhì)量。臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。

2.4 TUNEL染色檢測(cè)睪丸組織內(nèi)細(xì)胞凋亡情況

8周給藥結(jié)束后，收集大鼠睪丸，PBS沖洗后放入4%多聚甲醛固定過(guò)夜，經(jīng)包埋和切片等處理后，制得5 μm石蠟切片。按常規(guī)方法進(jìn)行脫蠟，60 ℃烘片60 min，1×PBS漂洗3次，每次5 min。每個(gè)組織切片上滴加100 μL Proteinase K工作液(PBS稀釋)，37 ℃反應(yīng)30 min，1×PBS漂洗3次。在1張樣本片上滴加100 μL DNaseⅠ反應(yīng)液，37 ℃處理30 min，1×PBS漂洗。樣本周?chē)梦埼桑總€(gè)樣本上滴加50 μL TdT酶反應(yīng)液，放入溫盒中，37 ℃避光反應(yīng)60 min，PBS漂洗3次。每個(gè)樣本上滴加50 μL Streptavidin-TRITC標(biāo)記液(5 μL Streptavidin-TRITC+45 μL Labeling buffer)，放入濕盒，37 ℃避光反應(yīng)30 min，PBS避光漂洗3次。DAPI染色液復(fù)染細(xì)胞核，室溫避光反應(yīng)10 min。洗去DAPI染色液后，加適量抗淬滅封片液。熒光顯微鏡檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)543 nm，發(fā)射波長(zhǎng)571 nm)。

2.5 Western blot檢測(cè)陰莖組織關(guān)鍵蛋白的表達(dá)

基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，前期找出中藥復(fù)方山海丹顆粒的主要活性成分及治療ED的潛在作用靶點(diǎn)為nNOS、iNOS、eNOS、p38蛋白等。取冷凍陰莖組織約0.1 g，加入800 μL蛋白裂解液(RIPA裂解液+1%PMSF)提取蛋白，經(jīng)過(guò)BCA試劑盒測(cè)定濃度后，用1×Loading buffer稀釋樣品，100 ℃加熱10 min進(jìn)行蛋白變性，室溫冷卻后-20 ℃保存。經(jīng)SDS-PAGE電泳和濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用封閉液(5%脫脂奶粉/TBST)室溫封閉2 h，加一抗4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗脫5 min×4次后，加二抗室溫孵育1.5 h，再洗脫4次，經(jīng)ECL試劑盒顯影，用凝膠成像系統(tǒng)拍照。以GAPDH為內(nèi)參，用Image J軟件定量分析nNOS、iNOS、eNOS、p38和p-p38蛋白條帶。

2.6 qPCR檢測(cè)關(guān)鍵蛋白mRNA水平

取冷凍大鼠的陰莖組織，勻漿后，加入TRIzol Regent裂解液，輕輕吹打均勻，于冰上靜置5 min。將裂解的反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至新EP管中，加入200 μL氯仿，常溫靜置孵育5 min。離心后轉(zhuǎn)移上層溶液，每孔加入等量異丙醇，混勻后常溫孵育10 min，離心棄上清。加入由DEPC水配置的75%乙醇，離心棄上清，通風(fēng)處?kù)o置揮干。加入50 μL DEPC水，置于55 ℃烘箱中孵育10 min，輕輕吹打均勻，用BioTek酶標(biāo)儀在260 nm/280 nm處進(jìn)行純度檢測(cè)。將樣品稀釋至500 ng/μL，取1 μL mRNA至微量EP管中，加入11 μL RNase free ddH2O和4 μL 4×gDNA wiper mix，混勻后42 ℃水浴2 min。每管加入4 μL 5×Hiscript qRT Super mix，充分混勻后經(jīng)梯度PCR儀合成cDNA。在96孔板中依次加入10 μL Super mix,2 μL cDNA,0.4 μL Forward primer,0.4 μL Reverse primer,7.2 μL的RNase free ddH2O，輕輕吹打混勻，用熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增得到各cDNA的Ct，通過(guò)2-ΔΔCt計(jì)算mRNA相對(duì)變化。引物序列如下：β-actin上游5'-ATCGTGGGGCCGCCCCTAGGC-3'，下游5'-TGGCCTTAGGGTTCAGAGG-3'；nNOS上游5'-TCAAAGCCATCCAGCGCATA-3'，下游5'-GCGGTTGGTCACTTCATACGTTC-3'；iNOS上游5'-CTCACTGTGGCTGTGGTCACCTA-3'，下游5'-GGGTCTTCGGGCTTCAGGTTA-3'；p38上游5'-CCGTTTCAGTCCTTGTTGGG-3'，下游5'-TCATTTCGTCATCAGTGTGC-3'。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 山海丹顆粒對(duì)ED模型大鼠性行為的影響

APO實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，造模動(dòng)物30 min內(nèi)勃起次數(shù)顯著減少(P<0.01)，勃起次數(shù)均不多于1次，提示造模成功(表1)。

表1 APO實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠勃起次數(shù)

3.1.1 大鼠體質(zhì)量和臟器指數(shù)的變化情況 與正常組相比，模型組大鼠體質(zhì)量沒(méi)有明顯變化，但前列腺臟器指數(shù)有顯著改變(P<0.01)；與模型組比，西地那非組,疏肝益陽(yáng)膠囊組,山海丹顆粒低、中、高劑量組體質(zhì)量均有降低趨勢(shì)，但各組大鼠體質(zhì)量和臟器指數(shù)均無(wú)顯著性差異；和疏肝益陽(yáng)組相比，山海丹各劑量給藥組對(duì)大鼠體質(zhì)量和臟器指數(shù)均無(wú)顯著差異(圖1～2)。

圖1 山海丹顆粒對(duì)ED大鼠體質(zhì)量的影響

注：與正常組比較，。

3.1.2 山海丹顆粒對(duì)ED模型大鼠撲捉潛伏期的影響 同模型組相比，在給藥1～8周間，西地那非組大鼠的撲捉潛伏期時(shí)間顯著縮短(P<0.01)；從給藥第2周起，疏肝益陽(yáng)膠囊組大鼠的撲捉潛伏期時(shí)間顯著縮短(P<0.05～0.01)；同時(shí)，從給藥第3周起，山海丹顆粒高劑量組大鼠撲捉潛伏期顯著縮短(P<0.05～0.01)；而山海丹顆粒低、中劑量組大鼠撲捉潛伏期在給藥4～8周間，才出現(xiàn)顯著縮短的情況(P<0.05～0.01)。提示山海丹顆粒的藥效與劑量呈正相關(guān)。與疏肝益陽(yáng)膠囊相比，山海丹顆粒中、高劑量對(duì)ED模型大鼠撲捉潛伏期的影響相當(dāng)；而低劑量組效果顯著不如疏肝益陽(yáng)組(P<0.05～0.01)(表2)。

表2 山海丹顆粒對(duì)ED大鼠撲捉潛伏期的影響

3.1.3 山海丹顆粒對(duì)ED模型大鼠射精潛伏期的影響 同模型組相比，給藥1～8周間，西地那非組大鼠的射精潛伏期顯著縮短(P<0.05～0.01)；從給藥第5周起，疏肝益陽(yáng)膠囊組大鼠的射精潛伏期顯著縮短(P<0.05～0.01)；在給藥3～8周間，山海丹顆粒高劑量組大鼠的射精潛伏期顯著縮短(P<0.05～0.01)；在給藥第6～8周時(shí)，山海丹顆粒中劑量組大鼠的射精潛伏期顯著縮短(P<0.05～0.01)；給藥第7周起，山海丹顆粒低劑量組大鼠的射精潛伏期顯著縮短(P<0.05)。提示山海丹顆粒的藥效與劑量呈正相關(guān)。與疏肝益陽(yáng)膠囊相比，山海丹顆粒各給藥劑量組對(duì)ED模型大鼠射精潛伏期的影響無(wú)顯著差異，說(shuō)明山海丹顆粒縮短射精潛伏期的效果與疏肝益陽(yáng)膠囊相當(dāng)(表3)。

表3 山海丹顆粒對(duì)ED大鼠射精潛伏期的影響

3.2 山海丹顆粒對(duì)大鼠睪丸組織內(nèi)細(xì)胞凋亡的影響

TUNEL染色的正常細(xì)胞胞核為藍(lán)色，陽(yáng)性凋亡細(xì)胞胞核呈紅色。熒光圖顯示(圖3)，在各組大鼠睪丸組織切片中均可觀察到紅色的凋亡細(xì)胞，背景清晰。與正常組比較，模型組TUNEL陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞比例顯著上升(P<0.01)；和模型組相比，各給藥組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞占比顯著增多(P<0.05～0.01)；山海丹顆粒治療組呈濃度依賴(lài)性地降低凋亡生精細(xì)胞數(shù)，且和疏肝益陽(yáng)組相比，山海丹顆粒治療組無(wú)顯著差異，表明山海丹顆粒抑制生精細(xì)胞凋亡的作用效果與疏肝益陽(yáng)膠囊相當(dāng)。

注：A.正常組；B.模型組；C.西地那非組；D.疏肝益陽(yáng)膠囊組；E.山海丹顆粒低劑量組；F.山海丹顆粒中劑量組；G.山海丹顆粒高劑量組;與正常組比較，。

3.3 山海丹顆粒對(duì)陰莖組織關(guān)鍵蛋白NOS和p38表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果表明(圖4)，與正常組相比，模型組大鼠陰莖組織nNOS、iNOS和eNOS蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.05～0.01)，p-p38蛋白表達(dá)顯著增多(P<0.05)。與模型組相比，山海丹顆粒低劑量組可以顯著增加nNOS蛋白表達(dá)(P<0.01)；山海丹顆粒中劑量組可以顯著增加nNOS和eNOS蛋白表達(dá)(P<0.05～0.01)；山海丹顆粒高劑量組可以顯著增加nNOS、iNOS和eNOS蛋白表達(dá)(P<0.05～0.01)。另外，山海丹顆粒自低劑量起就能明顯降低p-p38/p38比例(P<0.05)。提示山海丹顆?？赡芡ㄟ^(guò)調(diào)控iNOS、eNOS和nNOS蛋白表達(dá)及p38蛋白磷酸化，發(fā)揮治療ED的作用。

注：A.正常組；B.模型組；C.山海丹顆粒低劑量組；D.山海丹顆粒中劑量組；E.山海丹顆粒高劑量組;與正常組比較,。

3.4 山海丹顆粒對(duì)陰莖組織關(guān)鍵蛋白mRNA水平的影響

結(jié)果見(jiàn)圖5。與正常組相比，模型組大鼠陰莖組織nNOS、iNOS和eNOS mRNA表達(dá)顯著減少(P<0.01)，p38 mRNA表達(dá)顯著增多(P<0.01)。與模型組相比，山海丹顆粒低、中劑量組可以顯著下調(diào)p38 mRNA表達(dá)水平(P<0.01)；山海丹顆粒高劑量組可以顯著上調(diào)nNOS、eNOS和iNOS的mRNA水平(P<0.05～0.01)，顯著降低p38 mRNA表達(dá)水平(P<0.01)。山海丹顆粒可能通過(guò)影響nNOS、eNOS、iNOS和p38的mRNA水平，從而發(fā)揮對(duì)ED的治療作用。

注：與正常組比較,。

4 討論

ED是一種常見(jiàn)的男科疾病，PDE5抑制劑是ED的一線治療藥物，但其有效率僅為60%～70%，且常見(jiàn)心血管損傷等不良反應(yīng)[8]。因此，尋找各種替代療法或補(bǔ)充療法來(lái)提高治療ED藥物的療效成為當(dāng)務(wù)之急。腎和肝是與ED相關(guān)的2個(gè)主要器官。腎藏精，肝藏血，腎和肝負(fù)責(zé)機(jī)體的生長(zhǎng)、發(fā)展和繁殖[9]。山海丹顆粒能入心散血中之滯，入肝理血之壅，具有疏肝理氣，益氣養(yǎng)血，滋陰復(fù)脈的功效。在本研究中，我們采用經(jīng)典的雙側(cè)髂內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎的方法，建立血管性ED大鼠模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，山海丹顆粒能濃度依賴(lài)性地縮短撲捉潛伏期和射精潛伏期，且只改變大鼠前列腺臟器指數(shù)(P<0.01)，對(duì)大鼠的體質(zhì)量和其他臟器無(wú)影響。提示山海丹顆粒可能是一種治療ED比較有效安全的中成藥。

ED的發(fā)生發(fā)展常伴隨著睪丸組織內(nèi)的細(xì)胞凋亡。睪丸組織結(jié)構(gòu)發(fā)生病變導(dǎo)致生精細(xì)胞大量凋亡，精子嚴(yán)重減少。本研究對(duì)ED大鼠睪丸進(jìn)行TUNEL染色，發(fā)現(xiàn)山海丹顆粒中、高劑量組能夠顯著降低睪丸組織中生精細(xì)胞的凋亡數(shù)(P<0.05～0.01)，但是其影響組織內(nèi)細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步探索。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，NO在勃起功能中起關(guān)鍵作用，可用于ED的治療[10]。NO由iNOS、eNOS、nNOS三種不同類(lèi)型的酶產(chǎn)生。NOS催化人體內(nèi)L-精氨酸產(chǎn)生NO，NO擴(kuò)散至陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞內(nèi)，催化生成cAMP和cGMP，磷酸化某些蛋白質(zhì)和離子通道，導(dǎo)致陰莖海綿體內(nèi)小動(dòng)脈及血管平滑肌細(xì)胞舒張，海綿體血流量增多，從而引起陰莖勃起[11-12]。此外，p38絲裂原活化蛋白激酶可增強(qiáng)精氨酸酶活性，引起內(nèi)皮細(xì)胞功能異常，激活p38/MAPK通路可提高精氨酸酶在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)[13]，與ED的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在本研究中，我們對(duì)大鼠陰莖組織的關(guān)鍵蛋白NOS和p38及其mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)山海丹顆粒能夠上調(diào)iNOS、eNOS、nNOS和p38的表達(dá)，同時(shí)抑制p38蛋白磷酸化，這與課題組先前的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果相一致，證實(shí)山海丹顆粒能通過(guò)調(diào)控iNOS、eNOS、nNOS和p38，發(fā)揮治療ED的作用。

綜上所述，山海丹顆?？捎行Ц纳艵D模型大鼠的疾病狀態(tài)，對(duì)ED的治療作用機(jī)制可能部分是通過(guò)調(diào)控iNOS、eNOS、nNOS和p38來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這為山海丹顆粒應(yīng)用于臨床治療ED提供了科學(xué)可靠的依據(jù)。