蔣家璐，孫溧，倪姐，徐墜成，宋蒙蒙，姚衛(wèi)峰，程海波，康安，孫東東,3

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023；2.江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院·中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，江蘇 南京 210023)

半枝蓮為唇形科植物半枝蓮ScutellariabarbataD.Don的干燥全草。其性味辛、苦、寒，歸肺、肝、腎經(jīng)，是一味常用的清熱解毒藥。半枝蓮的主要活性成分為黃酮及二萜類(lèi)化合物，具有抗腫瘤、抗炎、化學(xué)預(yù)防等多種藥理作用，其中黃酮類(lèi)成分如木犀草素、野黃芩素、漢黃芩素等具有確切的抗腫瘤作用及抗炎作用[1]。研究表明半枝蓮中的黃酮類(lèi)化合物中，苷類(lèi)成分的含量顯著高于其相應(yīng)的苷元成分。而黃酮苷類(lèi)成分在體內(nèi)，可通過(guò)腸道菌群中的糖苷類(lèi)水解酶對(duì)其進(jìn)行水解，進(jìn)而發(fā)揮其效應(yīng)[2-3]。此外黃酮苷類(lèi)成分的化學(xué)預(yù)防作用可能與其和體內(nèi)藥物代謝酶，尤其是CYP1A1酶的相互作用有關(guān)[4-5]。

CYP1A1是主要的細(xì)胞色素P450酶之一，其因參與多環(huán)芳烴(PAHs)代謝活化而受到廣泛的關(guān)注[6]。PAHs暴露會(huì)誘導(dǎo)CYP1A1表達(dá)，而該酶又會(huì)將PAHs氧化代謝為具有遺傳毒性的活性代謝物。目前，CYP1A1水平已成為環(huán)境和職業(yè)暴露于多環(huán)芳烴的生物標(biāo)志物[7-9]。而當(dāng)前的研究多采用多酚類(lèi)物質(zhì)來(lái)調(diào)控CYP1A1的表達(dá)起到化學(xué)預(yù)防的作用[5,10-11]。

基于半枝蓮中富含黃酮類(lèi)成分，且未見(jiàn)從腸道菌群角度研究其活性成分對(duì)CYP1A1酶抑制能力的影響，進(jìn)而關(guān)聯(lián)其潛在的化學(xué)預(yù)防作用。因此本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用的方法測(cè)定了半枝蓮中的主要化學(xué)成分在腸道菌代謝前后的含量變化，并使用腸S9與CYP1A1特異性底物乙氧基試鹵靈溫孵，根據(jù)其產(chǎn)物試鹵靈來(lái)判斷半枝蓮提取物及其活性成分對(duì)CYP1A1酶活性的影響。最后結(jié)合體外腸道菌群代謝的結(jié)果與酶活實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出潛在的活性化合物并通過(guò)分子對(duì)接進(jìn)一步驗(yàn)證化合物與CYP1A1之間的結(jié)合能力。本研究旨在為半枝蓮能夠防治或減緩CYP1A1介導(dǎo)的致癌物的代謝活化提供新的證據(jù)支持，為其在化學(xué)預(yù)防領(lǐng)域中的應(yīng)用提供新思路。

1 材料

1.1 試劑

野黃芩素(批號(hào)：P23N4R1)，野黃芩苷(批號(hào)：YY20110513)，漢黃芩素(批號(hào)：P11M9F61014)，木犀草素(批號(hào)：YY20110606)，橙皮素(批號(hào)：HM0320KB14)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。漢黃芩苷(批號(hào)：H-019-170106)購(gòu)自成都瑞芬思生物科技有限公司。木犀草苷(批號(hào)：1444/11017)購(gòu)自上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司。半枝蓮堿A(BBP00853)，半枝蓮堿B(BBP00826)，半枝蓮堿X(BBP00933)購(gòu)自云南西力生物技術(shù)股份有限公司。所有對(duì)照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98.0%。半枝蓮藥材(批號(hào)：190605)購(gòu)自汕頭市粵東藥業(yè)有限公司。乙氧基試鹵靈(批號(hào)：076M4129V)和試鹵靈(批號(hào)：MKBT9342V)購(gòu)自Sigma公司。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(批號(hào)：080719191118，碧云天生物技術(shù)有限公司)，厭氧產(chǎn)氣袋(批號(hào)：9354ZJ-3，日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社)。乙腈，甲醇(色譜純，德國(guó)默克公司)，甲酸(色譜純，阿拉丁試劑有限公司)，純水(實(shí)驗(yàn)室自制)。

1.2 儀器

MGC三菱密封培養(yǎng)罐(日本三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社)，ZWY-103B多振幅軌道恒溫?fù)u床(上海智城分析儀器制造有限公司)，Milli-Q超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)，微量高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo Scientific公司)，Speed Vac離心濃縮儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)，AB Sciex QTRAP 5500質(zhì)譜儀(美國(guó)AB公司)，LC20A快速液相儀(裝有DGU-20A 3在線脫氣機(jī)，LC-20AD XR泵，SIL-20A XR自動(dòng)進(jìn)樣器及CTO-20AC柱溫箱，日本Shimadzu公司)，Spark 10M多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量220～250 g，購(gòu)于杭州醫(yī)學(xué)院。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(浙)2019-0002。

2 方法

2.1 半枝蓮提取液的制備

取半枝蓮藥材粗粉約0.5 g，精密稱(chēng)定，放置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量后超聲30 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量并用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾后于4 ℃保存。其中，野黃芩素、野黃芩苷、木犀草素、木犀草苷、漢黃芩素、漢黃芩苷、半枝蓮堿A、半枝蓮堿B、半枝蓮堿X的含量分別為482.03、3 540.93、93.07、17.29、3.29、1.54、176.18、121.86、147.68 μg/g。在進(jìn)行腸道菌溫孵實(shí)驗(yàn)前，將提取液放置于離心濃縮儀中揮干(45 ℃)，并用同體積的純水超聲復(fù)溶。

2.2 腸道菌群孵育液的制備

取新鮮大鼠糞便與無(wú)菌處理的PBS按質(zhì)量體積比1∶40研磨制成混懸液，過(guò)3層紗布，混勻后得腸道菌孵育液。

2.3 體外溫孵實(shí)驗(yàn)及樣品處理

將2.1項(xiàng)下處理得到的半枝蓮提取液與2.2項(xiàng)下制備的大鼠腸道菌孵育液以體積比1∶9混勻，分裝于1.5 mL離心管中，每管500 μL。在厭氧狀態(tài)下，將溫孵的樣品置于37 ℃氣浴恒溫?fù)u床中,分別孵育0、0.5、1、2、4、6、12、24 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行3份樣品。在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)取出溫孵的樣品并立即加入500 μL冰乙腈終止反應(yīng)，渦旋5 min，12 000 r/min離心10 min，取上清于4 ℃保存，100 μL上清溶液加10 μL內(nèi)標(biāo)混勻后揮干，加100 μL甲醇溶解離心后進(jìn)樣。

2.4 腸道菌溫孵液中半枝蓮8種活性化合物含量測(cè)定方法的建立

2.4.1 色譜條件 色譜柱：Thermo AcclaimTMRSLC 120 C18色譜柱(3.0 mm×100 mm,2.2 μm)；柱溫：40 ℃；流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；流動(dòng)相：0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)；梯度洗脫程序：0～1 min,10%B;1～5 min,10～35%B;5～10 min,35%B;10～12 min,35～90%B;12～16 min,90%B;16～17 min,10%B。

2.4.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)；采用多反應(yīng)檢測(cè)模式(MRM)在正離子模式下檢測(cè)；離子源噴霧電壓(IS)5 500 V；離子源溫度(TEM)550 ℃；氣簾氣(CUR)40 psi；霧化氣(GS1)60 psi；輔助加熱氣(GS2)60 psi(1 psi=6.8948 Pa)。母離子及子離子信息如圖1所示。

2.4.3 溶液的制備 混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液：取野黃芩苷、木犀草苷、野黃芩素、木犀草素、漢黃芩素、半枝蓮堿X、半枝蓮堿A、半枝蓮堿B對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為83.0、3.34、80.2、31.2、0.333、10.0、8.37、2.00 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液：取橙皮素對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加甲醇溶解，配置成質(zhì)量濃度為1.70 mg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，臨用前稀釋成1.70 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液。

腸道菌標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)控樣品：將儲(chǔ)備液稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，腸菌液與系列標(biāo)準(zhǔn)溶液以1∶1的比例混勻，離心后取100 μL上清溶液加10 μL內(nèi)標(biāo)，揮干后用100 μL甲醇溶解離心取上清進(jìn)樣。低、中、高質(zhì)控樣品配制參照標(biāo)準(zhǔn)曲線配制的方法，其中野黃芩素的濃度分別為0.500、2.00、6.00 μg/mL,野黃芩苷的濃度分別為0.050、0.500、6.60 μg/mL，木犀草素的濃度分別為0.100、0.600、1.20 μg/mL，木犀草苷的濃度分別為0.002、0.020、0.270 μg/mL，漢黃芩素的濃度分別為0.002、0.020、0.050 μg/mL，半枝蓮堿A的濃度分別為0.090、0.900、1.30 μg/mL，半枝蓮堿B的濃度分別為0.020、0.100、0.300 μg/mL。半枝蓮堿X的濃度分別為0.010、0.050、0.160 μg/mL。

2.5 腸S9的制備

取新鮮的腸黏膜加入4倍量的PBS勻漿，4 ℃，9 000×g，離心20 min得到的上清即為腸S9，檢測(cè)腸S9的蛋白含量并分裝保存于-80 ℃。

2.6 腸道菌與半枝蓮共孵溶液的提取

以等體積的正丁醇及乙酸乙酯萃取在腸道菌中孵育0、0.5、1、2、4、6、12、24 h的半枝蓮提取液，合并正丁醇及乙酸乙酯層并揮干，隨后以甲醇復(fù)溶，離心取上清，每1 mL相當(dāng)于原藥材1 g。

2.7 CYP1A1活性檢測(cè)(EROD)[12]

體外溫孵體系包含氯化鎂10 mmol/L，乙氧基試鹵靈2 μmol/L,腸S9 0.24 mg/mL，NADPH 0.5 mmol/L。溫度為37 ℃，反應(yīng)時(shí)間為20 min，結(jié)束后立即加入等量冰乙腈，混勻離心后取上清100 μL加入到96孔板中。使用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng)535/590 nm處的值。

2.8 分子對(duì)接

配體野黃芩素，木犀草素，漢黃芩素的3D結(jié)構(gòu)從PubChem獲得，蛋白CYP1A1的3D結(jié)構(gòu)(PDB：4I8V)從Protein Data Bank(PDB)獲得[13]。CYP1A1對(duì)接盒子中心坐標(biāo)設(shè)置為:center_x=-16.955,center_y=36.683,center_z=-28.371，盒子維度設(shè)置為:size_x=40,size_y=40,size_z=40。使用AutoDockTools 1.5.6和PyMOL1.7對(duì)小分子及蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理。采用AutoDockTools 1.5.6進(jìn)行分子對(duì)接，使用PyMOL1.7和Discovery studio 2019令結(jié)果可視化。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 專(zhuān)屬性 取空白腸道菌，空白腸道菌加對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)，樣品溶液參照2.4項(xiàng)下方法檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示，空白腸菌液(A)未出現(xiàn)與腸菌液加對(duì)照品和內(nèi)標(biāo)(B)中9種待測(cè)成分保留時(shí)間一致的色譜峰，樣品溶液(C)未在相應(yīng)位置出現(xiàn)其他干擾成分，表明該方法專(zhuān)屬性良好。

注：A.空白腸道菌;B.空白腸道菌加對(duì)照品和內(nèi)標(biāo);C.樣品溶液

3.1.2 線性關(guān)系 參照2.3項(xiàng)下方法制備腸道菌系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，記錄樣品中各化合物及對(duì)應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積，以化合物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，化合物與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)(Y),用加權(quán)(1/X)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，分別求得各化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程如表1所示，結(jié)果表明各化合物在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)

3.1.3 準(zhǔn)確度和精密度 以低、中、高濃度的質(zhì)控樣品進(jìn)行準(zhǔn)確度與精密度考察，每個(gè)濃度平行6份，連續(xù)3 d進(jìn)樣。結(jié)果表明，野黃芩素、野黃芩苷、木犀草素、木犀草苷、漢黃芩素、半枝蓮堿A、半枝蓮堿B、半枝蓮堿X的日內(nèi)準(zhǔn)確度分別為96.5%～100.9%、97.5%～102.6%、95.1%～100.8%、96.1%～99.9%、97.7%～101.3%、98.6%～102.2%、98.4%～104.6%、99.1%～103.4%，日間準(zhǔn)確度分別為97.1%～102.1.3%、96.2%～102.3%、95.1%～101.4%、95.8%～102.7%、96.7%～101.2%、98.6%～100.5%、98.4%～103.6%、86.1%～100.9%，所有化合物的日內(nèi)精密度均小于9.6%，日間精確度均小于11.2%。

3.1.4 回收率、基質(zhì)效應(yīng)和穩(wěn)定性 低、中、高濃度腸道菌質(zhì)控樣品中化合物的峰面積為A，空白腸道菌樣品經(jīng)提取揮干后加入對(duì)應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)得的化合物譜峰面積為B，以“A/B×100%”計(jì)算回收率，結(jié)果表明野黃芩素、野黃芩苷、木犀草素、木犀草苷、漢黃芩素、半枝蓮堿A、半枝蓮堿B、半枝蓮堿X和橙皮素的回收率分別為86.1%～96.3%、89.8%～96.8%、85.1%～92.1%、87.1%～90.7%、86.7%～98.4%、91.6%～98.2%、90.4%～99.6%、89.1%～97.9%和98.6%。

以6只大鼠腸菌液制備的基質(zhì)樣本和以流動(dòng)相制備的無(wú)基質(zhì)樣本中目標(biāo)化合物峰面積比值來(lái)考察基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effect，ME)。結(jié)果表明野黃芩素(ME：90.8%～102.4%)、野黃芩苷(ME：90.3%～100.5%)、木犀草素(ME：91.9%～103.3%)、木犀草苷(ME：91.1%～99.2%)、漢黃芩素(ME：93.9%～102.1%)、半枝蓮堿A(ME：95.0%～106.5%)、半枝蓮堿B(ME：96.5%～103.4%)、半枝蓮堿X(ME：94.1%～101.4%)和橙皮素(ME：95.6%)的基質(zhì)效應(yīng)均符合要求。

對(duì)低、中、高3個(gè)濃度質(zhì)控樣品進(jìn)行穩(wěn)定性考察(n=6)。各成分在室溫放置4 h(準(zhǔn)確度：82.5%～101.3%)，經(jīng)過(guò)3次凍融(準(zhǔn)確度：87.9%～102.1%)，進(jìn)樣室內(nèi)放置24 h(準(zhǔn)確度：82.2%～100.3%)，-80 ℃放置1個(gè)月(準(zhǔn)確度：85.4%～103.8%)穩(wěn)定性良好。

3.2 半枝蓮提取液經(jīng)腸道菌轉(zhuǎn)化前后主要化學(xué)成分的經(jīng)時(shí)變化過(guò)程

含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2，半枝蓮中的黃酮類(lèi)化合物經(jīng)過(guò)腸道菌的轉(zhuǎn)化后含量變化較為明顯，而二萜類(lèi)化合物含量變化不明顯。野黃芩苷、木犀草苷和漢黃芩苷這些黃酮苷的含量顯著降低，在2 h內(nèi)均降到了較低的水平，由于從樣品中檢測(cè)到漢黃芩苷較少，無(wú)法精確的定量，因此采用峰面積比值來(lái)反映其變化。另外，相應(yīng)的苷元在腸道菌代謝后均發(fā)生了顯著變化，總體呈增加的趨勢(shì)。野黃芩素經(jīng)腸道菌溫孵4 h后含量增加6倍多，隨后逐漸減少。木犀草素與漢黃芩素在孵育2 h后含量增至原來(lái)的2倍左右，隨后無(wú)明顯的增加或減少趨勢(shì)。

圖2 半枝蓮腸道菌共孵育液中各化學(xué)成分的含量

3.3 半枝蓮提取物經(jīng)腸道菌代謝轉(zhuǎn)化前后對(duì)CYP1A1酶活的抑制作用

圖3結(jié)果顯示，半枝蓮提取液對(duì)腸S9中的CYP1A1酶活性具有一定的抑制作用，經(jīng)過(guò)腸道菌轉(zhuǎn)化2、4、6 h的提取液對(duì)酶的抑制作用較0 h點(diǎn)增強(qiáng)，但經(jīng)腸道菌轉(zhuǎn)化12、24 h后這種抑制作用減弱。結(jié)合前面的研究可知，在腸道菌中溫孵2 h后，半枝蓮中的黃酮苷含量普遍降低到較低水平，而相應(yīng)黃酮苷元升高到較高水平，在代謝12、24 h后含量較高的野黃芩素含量逐漸減少，暗示半枝蓮腸道菌溫孵液對(duì)CYP1A1的抑制活性可能與其中的黃酮苷元的含量有關(guān)，特別是野黃芩素的含量。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了3對(duì)黃酮苷及其苷元對(duì)腸S9中CYP1A1酶活的影響，結(jié)果如圖4所示，這3個(gè)黃酮苷元對(duì)CYP1A1的酶活抑制作用均強(qiáng)于其相應(yīng)的黃酮苷。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與0 h組比較，#P<0.05。

圖4 半枝蓮主要化學(xué)成分對(duì)CYP1A1酶的抑制作用

3.4 分子對(duì)接

本實(shí)驗(yàn)以野黃芩素、木犀草素及漢黃芩素作為配體分子對(duì)接至CYP1A1的催化活性空腔。配體與CYP1A1的結(jié)構(gòu)和結(jié)合模式如圖5所示，與先前發(fā)現(xiàn)的抑制劑α-萘黃酮與CYP1A1的相互作用一致，這些配體與CYP1A1的PHE224形成π-π堆積作用[13]，此外，氫鍵、靜電、范德華力等相互作用是復(fù)合物形成的主要驅(qū)動(dòng)力。CYP1A1與各配體的結(jié)合自由能及相互作用的氨基酸殘基列于表2中，這些相互作用都提示了野黃芩素、木犀草素和漢黃芩素與CYP1A1酶產(chǎn)生較強(qiáng)的結(jié)合。

表2 配體與人CYP1A1的結(jié)合能及相互作用

圖5 野黃芩素、木犀草素和漢黃芩素與CYP1A1的分子對(duì)接圖

4 討論

CYP1A1參與外源性物質(zhì)以及內(nèi)源性物質(zhì)的代謝清除，在脫毒和化學(xué)預(yù)防中起著重要的作用[14]。但其也因參與BaP和相關(guān)多環(huán)芳烴的氧化代謝而受到廣泛關(guān)注。BaP存在于工業(yè)廢氣、汽車(chē)尾氣、香煙煙霧以及熏烤油炸食品之中，是一種有毒、有害的五環(huán)芳烴類(lèi)化合物。機(jī)體暴露于BaP會(huì)引起芳烴受體(AHR)的激活，激活的AHR從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核中并與芳烴受體核轉(zhuǎn)運(yùn)子(ARNT)形成復(fù)合物，隨后該復(fù)合物與異種生物反應(yīng)元件(XRE)結(jié)合并誘導(dǎo)CYP 1家族成員特別是CYP1A1基因的高表達(dá)。CYP1A1酶促進(jìn)BaP的代謝，加速致癌代謝物二羥環(huán)氧苯并[a]芘(BPDE)的產(chǎn)生，BPDE與DNA相互作用形成加合物造成DNA損傷，具有致癌、致突變的作用[15]。

腸道菌被稱(chēng)為“隱形的器官”，其對(duì)藥物的代謝能力遠(yuǎn)強(qiáng)于肝臟[16]。腸道菌群可以代謝中藥使其成分組成發(fā)生變化而改變其藥理活性。本實(shí)驗(yàn)利用腸道菌溫孵半枝蓮提取物以模擬藥物的代謝，建立UPLC-Q-TRAP-MS方法用于同時(shí)定量半枝蓮中的主要活性成分在經(jīng)過(guò)腸道菌轉(zhuǎn)化后的含量變化，結(jié)果提示黃酮苷類(lèi)化合物有可能發(fā)生了脫糖代謝而轉(zhuǎn)化成相應(yīng)的黃酮苷元。另外，考慮到腸道為口服半枝蓮可以直接接觸的部位，因此以腸S9作為酶體研究藥物對(duì)CYP1A1酶活的影響。結(jié)合含量測(cè)定以及半枝蓮中黃酮苷元及其苷的單體對(duì)CYP1A1酶活抑制作用的研究結(jié)果，我們推測(cè)半枝蓮對(duì)CYP1A1的抑制作用與黃酮苷元的含量有關(guān)。最后將野黃芩素、木犀草素和漢黃芩素作為配體與CYP1A1蛋白進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們之間有較強(qiáng)的結(jié)合，由此推測(cè)這些苷元可能是通過(guò)與CYP1A1的活性位點(diǎn)結(jié)合而抑制CYP1A1酶的活性。

綜上，本研究為半枝蓮用于化學(xué)預(yù)防提供了一定的證據(jù)支持及研究基礎(chǔ)。在實(shí)驗(yàn)中，野黃芩素、木犀草素和漢黃芩素已被驗(yàn)證對(duì)CYP1A1酶具有抑制作用，但無(wú)法排除一些代謝產(chǎn)物也對(duì)CYP1A1的抑制作用，這需要在以后的研究中對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。