謝曉東，強(qiáng)永虎，劉沈林，陳彥臻，吳旻，張星星

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

胃癌在我國(guó)惡性腫瘤中發(fā)病率和病死率均居第2位[1]。盡管現(xiàn)代治療手段不斷發(fā)展，但我國(guó)胃癌5年生存率僅為35.9%[2]。腫瘤微環(huán)境是指在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中，由腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、微血管及浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞共同構(gòu)成的局部穩(wěn)態(tài)環(huán)境。腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥因子、乳酸等，在腫瘤周圍形成特殊的炎癥微環(huán)境，招募并重塑微環(huán)境內(nèi)的免疫細(xì)胞，使其不但喪失免疫監(jiān)控、免疫清除的能力，而且釋放多種免疫抑制介質(zhì)，促進(jìn)腫瘤發(fā)展[3]，并直接減弱放化療、靶向治療的療效，甚至引起治療失敗[4]。在腫瘤微環(huán)境中，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是最重要的抑制性免疫細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞接觸和大量分泌白細(xì)胞介素-2(IL-2)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)等細(xì)胞因子而抑制免疫應(yīng)答[5]。T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(Tim3)是近年備受關(guān)注的T細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)分子，在腫瘤中該分子的過(guò)度激活可誘導(dǎo)T細(xì)胞耗竭和Treg表型的增加[6]，且Tim3+Treg細(xì)胞比普通的Treg細(xì)胞具有更強(qiáng)的免疫抑制功能[7]。目前證實(shí)，Tim3的過(guò)表達(dá)與肺癌、胃癌等惡性腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)[8]。

大量文獻(xiàn)報(bào)道，中醫(yī)藥有減輕腫瘤微環(huán)境免疫抑制狀態(tài)的作用[9]。益氣健脾化瘀法是全國(guó)名中醫(yī)劉沈林教授治療胃癌的經(jīng)驗(yàn)法則，臨床可顯著改善胃癌患者的生存質(zhì)量、延緩中晚期胃癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[10]。健脾養(yǎng)胃方即為該治法指導(dǎo)下的臨床常用處方，荷胃癌小鼠實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，該方與5-氟尿嘧啶(5-Fu)聯(lián)用，有增加小鼠抑瘤率、延長(zhǎng)小鼠生存時(shí)間的作用，但具體作用機(jī)制尚不明確[11]。新輔助化療是在實(shí)施局部治療方法(如手術(shù)或放療)前所做的全身化療，通過(guò)新輔助化療使腫瘤縮小、降期，使原本難以手術(shù)的腫瘤有手術(shù)切除機(jī)會(huì)，并減少進(jìn)入循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，對(duì)預(yù)防術(shù)后復(fù)發(fā)有積極作用，但因其有一定的免疫損傷作用及耐藥性，限制了部分臨床患者的使用及療效。本研究觀察健脾養(yǎng)胃方與新輔助化療聯(lián)合使用對(duì)胃癌脾胃氣虛證臨床療效的影響，并檢測(cè)Treg細(xì)胞、Tim3分子的表達(dá)，探討其可能的作用機(jī)制。

1 臨床資料

1.1 一般資料

納入2017年9月至2020年9月期間江蘇省中醫(yī)院胃癌住院患者56例。臨床試驗(yàn)通過(guò)江蘇省中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理批號(hào)：2017NL-097-02)。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將患者分為治療組27例和對(duì)照組29例。2組患者性別、年齡、病程、TNM分期[12]均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

表1 2組患者一般臨床資料比較

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)參照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部醫(yī)政司編寫的《胃癌治療規(guī)范》[13]，依據(jù)手術(shù)病理組織學(xué)明確診斷。TNM分期參照美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)(AJCC)公布的胃癌國(guó)際分期標(biāo)準(zhǔn)[12]。

1.2.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參考《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[14]和新世紀(jì)全國(guó)高等中醫(yī)藥院校規(guī)劃教材《中醫(yī)診斷學(xué)》[15]相關(guān)證候標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合制定而成。

脾胃氣虛證，主癥：食少納呆，食后或午后腹痛，氣短懶言，體倦乏力，大便異常(溏、爛、先硬后溏、時(shí)溏時(shí)硬)；次癥：形體消瘦，腹脹，口淡不渴，惡心嘔吐，脘悶?zāi)c鳴，肛門墜脹，面色萎黃，排便無(wú)力，舌質(zhì)淡，舌體胖或有齒印，苔薄白或白潤(rùn)，脈細(xì)弱或沉遲。具備主癥2項(xiàng)；或主癥1項(xiàng)加次癥2項(xiàng)，即可診斷。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合西醫(yī)診斷與TNM分期標(biāo)準(zhǔn)；②中醫(yī)證型屬于脾胃氣虛證；③不能行根治性手術(shù)或術(shù)后明確復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移而不能手術(shù)治療的患者；有化療適應(yīng)證且愿意接受化療；④預(yù)期生存期3個(gè)月以上；⑤理解本研究的情況并簽署知情同意書，獲得知情同意書過(guò)程符合GCP規(guī)定。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

①不能經(jīng)口進(jìn)食(包括消化道梗阻、空腸造瘺)者；②同時(shí)進(jìn)行放療或使用其他抗癌藥物者；③妊娠期、哺乳期婦女；④具有嚴(yán)重的原發(fā)性心、肝、肺、腎、血液疾病及糖尿病或影響其生存的嚴(yán)重疾病者；⑤由于智力或行為障礙不能給予充分知情同意者；⑥過(guò)敏體質(zhì)，如對(duì)2種及以上藥物或食物過(guò)敏史者；或已知對(duì)研究藥物成分過(guò)敏者；⑦正在參加其他藥物臨床試驗(yàn)的患者。

1.5 剔除標(biāo)準(zhǔn)

①依從性差，未按方案規(guī)定劑量和療程用藥；②試驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)、不良事件或并發(fā)其他疾病者；③其他研究員評(píng)估后認(rèn)為應(yīng)終止的情況。

2 方法

2.1 治療方法

對(duì)照組：患者均采用奧沙利鉑(艾恒，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，50 mg/瓶)和替吉奧(維康達(dá)，山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司，25 mg/粒)為主的SOX術(shù)前新輔助化療方案。第1天靜脈滴注奧沙利鉑，劑量130 mg/m2；第1～14天口服替吉奧，劑量40 mg/m2，每日2次，早晚餐后口服。第15天起停藥7天，21 d為1個(gè)周期。共化療2個(gè)周期。

治療組：在對(duì)照組化療方案基礎(chǔ)上服用健脾養(yǎng)胃方：炙黃芪15 g，黨參15 g，炒白術(shù)10 g，當(dāng)歸10 g，白芍10 g，陳皮6 g，法半夏10 g，三棱10 g，莪術(shù)10 g，石見穿30 g，白花蛇舌草30 g，炙甘草5 g。加減：①氣滯加木香10 g，砂仁3 g(后下)；②中焦虛寒加桂枝5 g，高良姜5 g；③胃陰不足加北沙參15 g，麥冬12 g；④脾陽(yáng)不運(yùn)加炮姜炭3 g，肉豆蔻5 g；⑤肝胃郁熱加黃連3 g，吳茱萸1.5 g，煅瓦楞子30 g(先煎)。上述中藥由江蘇省中醫(yī)院中藥房每周2次按照臨床需要量統(tǒng)一制作，按固定工藝煎煮，每袋200 mL真空包裝，保存于5 ℃冰箱。服用前用37 ℃溫水浸泡溫化，上午9:00、下午3:00各1次口服，每次200 mL。21天為1個(gè)周期，共口服2個(gè)周期。

2組患者均完成術(shù)前新輔助化療2個(gè)周期后行手術(shù)治療。

2.2 觀察指標(biāo)與方法

2.2.1 腫瘤術(shù)前輔助治療療效評(píng)估 見表2。

表2 腫瘤術(shù)前輔助治療療效評(píng)估

所有入組患者在化療完成后均按照上述方案行手術(shù)治療。胃癌標(biāo)本離體30 min內(nèi)投入4%中性甲醛溶液，固定24 h送病理科。采用2019版腫瘤術(shù)前輔助治療評(píng)估分級(jí)(腫瘤退縮分級(jí)TRG)，判斷患者術(shù)前輔助化療的療效。

2.2.2 中醫(yī)證候積分評(píng)估 參照《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》[14]中脾胃氣虛證療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)制定的分級(jí)量化表，觀察患者的主要癥狀如胃痛、乏力、納差、氣短、便溏及次要癥狀如腹脹、惡心嘔吐、消瘦，依據(jù)患者臨床表現(xiàn)分為無(wú)、輕、中、重4度，主要癥狀分別計(jì)分0分(無(wú)癥狀)、3分(輕度癥狀)、6分(中度癥狀)、9分(重度癥狀)，次要癥狀分別計(jì)分0分(無(wú)癥狀)、2分(輕度癥狀)、4分(中度癥狀)、6分(重度癥狀)。患者治療前，治療第21天、42天分別評(píng)價(jià)1次。

積分比=(治療前總積分-治療后總積分)÷治療前總積分×100%。療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)：臨床痊愈：癥狀及體征消失，積分比為100%。顯效：癥狀及體征基本消失，70%≤積分比<100%。有效：癥狀及體征好轉(zhuǎn)，35%≤積分比<70%。無(wú)效：未達(dá)到上述標(biāo)準(zhǔn)者。

2.2.3 胃癌組織檢測(cè)

(1)組織來(lái)源 胃癌標(biāo)本離體30 min內(nèi)取癌組織大小約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，放入液氮保存；其余標(biāo)本投入4%中性甲醛溶液固定24 h，送病理科梯度酒精脫水、二甲苯透明后浸蠟包埋，制成組織蠟塊。

(2)試劑及儀器 FoxP3單克隆抗體(R&D公司，AF3240-SP)；Tim3單克隆抗體(武漢三鷹公司，60355-1)；SYBR Green(ABI公司，436759)；Trizol(Ambion公司，15596018)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司，RR047A)；PCR引物(Invitrogen公司)；組織勻漿器(美國(guó)IKA公司)；實(shí)時(shí)定量PCR儀7500fast型(美國(guó)ABI公司)；高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；金屬恒溫浴(美國(guó)Thermo公司)；超純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)；各量程移液器(德國(guó)eppendorf公司)。

(3)免疫組化檢測(cè)患者瘤體中Tim3、FoxP3蛋白含量 對(duì)患者蠟塊組織進(jìn)行二甲苯脫蠟、乙醇水合、蒸餾水清洗。放入盛有抗原修復(fù)液的高壓鍋內(nèi)高壓修復(fù)3 min，待室溫冷卻后滴加FoxP3、Tim3一抗100 μL/片，37 ℃孵育2 h后，PBS浸洗3次；通用型二抗50 μL/片，37 ℃，孵育30 min后PBS浸洗3次；DAB溶液顯色；顯微鏡下觀察染色深淺以及時(shí)終止顯色反應(yīng)；蘇木素復(fù)染，分化返藍(lán)后，用梯度酒精脫水，濃度從低到高分別為70%、85%、95%、100%；二甲苯透明封片；顯微鏡下觀察，拍照保存。

(4)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)胃癌組織IL-10、IL-2、IL-8、TNF-α的mRNA表達(dá) 取出液氮中保存的腫瘤組織，PBS洗3次，加入Trizol試劑1 mL，研磨震蕩，靜置5 min；加入氯仿0.2 mL，靜置5 min；4 ℃，10 000 r/min離心15 min取上清，加入等體積異丙醇混勻，靜置10 min；4 ℃，10 000 r/min離心10 min；加入預(yù)冷的75%乙醇1 mL，輕輕混勻，4 ℃，7 500 r/min離心5 min，棄上清，室溫晾干；紫外分光光度計(jì)上測(cè)定純度及濃度。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：42 ℃，2 min，去除殘留DNA；50 ℃，15 min，85 ℃，5 s。將cDNA進(jìn)行PCR反應(yīng)，實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性，1個(gè)循環(huán)；94 ℃(5 s)，55 ℃(15 s)，72 ℃(10 s)，共40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCt方法進(jìn)行分析。引物序列見表3。

表3 目的基因的引物序列

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 2組患者術(shù)前輔助治療療效評(píng)估

2組患者胃癌病理組織TRG分級(jí)結(jié)果顯示，治療組能改善胃癌患者的TRG分級(jí)，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 2組患者TRG分級(jí)比較

3.2 2組患者治療前后中醫(yī)證候改善情況

結(jié)果見表5。

表5 2組患者治療前后中醫(yī)證候積分比較

3.3 2組治療前后中醫(yī)證候總積分對(duì)比

與治療前相比，治療組第42天后證候總積分明顯改善(P<0.05)，低于對(duì)照組(P<0.05)。見表6～7。

表6 2組患者治療前后中醫(yī)證候總積分比較

表7 2組患者中醫(yī)證候總體療效判定

3.4 2組患者胃癌組織中Tim3、FoxP3蛋白表達(dá)情況比較

與對(duì)照組相比，治療組Tim3、FoxP3蛋白表達(dá)均有下降(P<0.05)，見圖1～2，表8。

表8 2組患者瘤體組織中Tim3、FoxP3蛋白表達(dá)情況比較

圖1 2組胃癌患者病理組織Tim3表達(dá)情況(×200)

圖2 2組胃癌患者病理組織FoxP3表達(dá)情況(×200)

3.5 2組患者腫瘤組織中IL-10、IL-2、IL-8、TNF-α mRNA表達(dá)情況比較

與對(duì)照組相比，治療組腫瘤組織IL-8、IL-10的mRNA表達(dá)下降(P<0.05)，IL-2、TNF-α的mRNA表達(dá)有升高趨勢(shì)。見表9。

表9 2組患者腫瘤組織中炎癥因子mRNA表達(dá)情況比較

4 討論

在多年的臨床實(shí)踐基礎(chǔ)上，全國(guó)名中醫(yī)劉沈林教授認(rèn)為胃癌的形成，多由正氣不足，脾胃功能虛弱，而實(shí)邪踞之為患[16-17]。胃癌患者治療關(guān)鍵在于健脾益胃，扶正祛邪。健脾養(yǎng)胃方是劉沈林教授的經(jīng)驗(yàn)方，方中炙黃芪、黨參、白術(shù)、炙甘草補(bǔ)益中氣，當(dāng)歸、白芍補(bǔ)血和血，陳皮、半夏理氣和胃，三棱、莪術(shù)、石見穿、白花蛇舌草化瘀解毒，諸藥共奏健脾扶正，祛邪消癥之功。劉沈林教授運(yùn)用健脾養(yǎng)胃方治療胃癌患者取得了較好的療效，但內(nèi)在機(jī)制尚不明確。目前，NCCN、CSCO等一系列指南均明確表明，新輔助化療不僅可提高手術(shù)切除率，而且可減少術(shù)后的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，故在進(jìn)展期胃癌的治療中被廣泛采用。但新輔助化療在部分患者中存在敏感性不佳、損傷機(jī)體免疫功能的情況。如何提高機(jī)體對(duì)新輔助化療的敏感性是目前亟待解決的問(wèn)題。本研究觀察了健脾養(yǎng)胃方與新輔助化療聯(lián)用對(duì)腫瘤術(shù)前輔助治療療效的影響。結(jié)果表明，與單純新輔助化療組相比，患者加用健脾養(yǎng)胃方后，TRG分級(jí)改善，說(shuō)明本方有增加患者對(duì)術(shù)前輔助化療敏感性的作用，其機(jī)制可能與胃癌組織Tim3、FoxP3等免疫抑制性相關(guān)蛋白表達(dá)降低，抑炎因子IL-8、IL-10水平降低有關(guān)。此外，通過(guò)中醫(yī)臨床癥狀評(píng)分，本研究發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，治療組能有效降低患者乏力、納差、消瘦評(píng)分，改善胃癌患者生活質(zhì)量。

諸多文獻(xiàn)表明，化療敏感性與腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞及炎癥因子表達(dá)密切相關(guān)。Treg細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中重要的免疫抑制性T細(xì)胞之一，可有力抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)化療耐藥[18]。FoxP3是Treg細(xì)胞的標(biāo)記蛋白，可反映組織中Treg細(xì)胞的表達(dá)情況。本研究在胃癌患者瘤體中觀察到，與單純化療組相比，治療組FoxP3蛋白表達(dá)降低，表明本方可抑制Treg細(xì)胞在胃癌組織中的數(shù)量。Tim3是一種免疫負(fù)性調(diào)節(jié)因子[19]，與CTLA-4和PD-1被歸類為免疫系統(tǒng)的抑制性受體，可誘導(dǎo)T細(xì)胞耗竭，增加Treg細(xì)胞的免疫抑制功能[20-22]。提示通過(guò)調(diào)節(jié)Tim3、CTLA-4和PD-1的表達(dá)可改善腫瘤微環(huán)境中免疫抑制狀態(tài)。李園等人研究發(fā)現(xiàn)健脾扶正方可抑制CD4+CD25+FOXP3+Treg細(xì)胞水平，從而增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能，改善脾虛濕熱證大腸癌術(shù)后化療患者的臨床癥狀[23]。劉玉等研究表明中藥可通過(guò)抑制Tim3表達(dá)，負(fù)向調(diào)節(jié)使Th1表達(dá)增高，正向調(diào)節(jié)使Th2表達(dá)量下降[24]。楊玉琪等發(fā)現(xiàn)扶正抗毒丸或康愛保生丸治療的HIV感染者T細(xì)胞表面PD-1和Tim3的表達(dá)與治療前比有所下降[25]。這些研究均表明了中醫(yī)藥調(diào)節(jié)免疫抑制性細(xì)胞的可能性。本研究同樣在胃癌組織中觀察到，治療組T細(xì)胞免疫檢查點(diǎn)Tim3蛋白表達(dá)降低，這可能是健脾養(yǎng)胃方抑制胃癌中Treg細(xì)胞數(shù)量的重要原因。

文獻(xiàn)表明，Treg細(xì)胞可通過(guò)接觸依賴和釋放IL-10、IL-8等細(xì)胞因子抑制抗腫瘤免疫[26]。IL-8是體內(nèi)重要趨化因子和炎癥介質(zhì)，在感染、腫瘤等病理情況下，由具有Toll樣受體的細(xì)胞分泌，在炎癥局部、血清和體液中顯著增加。IL-8是腫瘤微環(huán)境中重要的免疫抑制因子，不僅可以促進(jìn)腫瘤進(jìn)展、參與腫瘤血管生成，還具有招募免疫抑制細(xì)胞，抑制抗腫瘤免疫應(yīng)答的能力，更與腫瘤的耐藥息息相關(guān)[27]。IL-10可由淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞產(chǎn)生，并進(jìn)一步抑制活化的T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，抑制細(xì)胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)機(jī)體免疫抑制狀態(tài)，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸[28]。一些研究也提示腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞調(diào)控的IL-10釋放與腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)[29]。近年來(lái)一些文獻(xiàn)也提示中醫(yī)藥可通過(guò)干預(yù)上述靶點(diǎn)，緩解化療耐藥。如洪文文研究發(fā)現(xiàn)相比于單純化療治療進(jìn)展期胃癌患者，香砂六君子湯聯(lián)合化療組IL-10水平較低[30]。張?jiān)畦档劝l(fā)現(xiàn)丹皮、赤芍等6味中藥同時(shí)對(duì)TNF-α刺激角質(zhì)形成細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-8的作用有抑制效果，拳參、赤芍2味藥物作用尤為明顯[31]。本研究證實(shí)健脾養(yǎng)胃方治療組胃癌組織中炎癥因子IL-10、IL-8的水平明顯降低，這可能與本方抑制Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化，減少其分泌免疫抑制因子有關(guān)。

綜上所述，健脾養(yǎng)胃方與新輔助化療聯(lián)用可增加胃癌患者化療敏感性，促進(jìn)胃癌的退縮，改善患者生活質(zhì)量。機(jī)制可能與該方抑制胃癌微環(huán)境中Tim3蛋白表達(dá)、減少Treg細(xì)胞數(shù)量，進(jìn)而降低炎癥因子IL-10、IL-8水平，減少化療耐藥，促進(jìn)機(jī)體抗腫瘤免疫有關(guān)。但本研究也存在一定局限性，如研究觀察時(shí)間較短、納入樣本量偏少、未采用多中心研究等，后期我們將對(duì)現(xiàn)有胃癌患者進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪觀察，并在臨床工作中進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，為臨床用藥提供更為明確的依據(jù)。