肖歡容 王少鋒 蔡志鋼

肺結(jié)核是我國(guó)臨床常見(jiàn)的一種慢性傳染病，其主要病因?yàn)榻Y(jié)核分枝桿菌，且已嚴(yán)重威脅人類(lèi)身體健康，因而尋找肺結(jié)核相關(guān)基因及快速診斷對(duì)提高肺結(jié)核治療效果具有重要意義[1]。單核細(xì)胞在機(jī)體免疫及免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并可作為感染防御中的第一道防線，其可通過(guò)清除結(jié)核分枝桿菌從而發(fā)揮作用[2]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA在肺結(jié)核患者中異常表達(dá)并可能作為診斷肺結(jié)核的重要輔助標(biāo)志物[3-4]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA CASC7(LncRNA CASC7)在缺血再灌注損傷大鼠中表達(dá)水平降低，上調(diào)其表達(dá)可抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[5]。生物信息學(xué)分析顯示微小RNA-27b-3p(miR-27b-3p)可能是CASC7的靶基因，研究表明miR-27b通過(guò)下調(diào)TET2表達(dá)而促進(jìn)ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡[6]。但CASC7是否通過(guò)調(diào)控miR-27b-3p的表達(dá)從而參與肺結(jié)核發(fā)生過(guò)程尚未闡明。因此，本研究主要探討CASC7與miR-27b-3p在肺結(jié)核外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)及其意義。

資料與方法

一、一般資料

選取2018年3月至2019年10月本院收治的肺結(jié)核患者120例為研究組，所有患者均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)《臨床診療指南:呼吸病學(xué)分冊(cè)》相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。經(jīng)痰涂片檢查顯示均為陽(yáng)性，且肺部無(wú)其他細(xì)菌、真菌及病毒感染，患者均無(wú)合并心、肝、腎等臟器疾病，其中男70例，女50例，年齡48～75歲，平均年齡(59.63±8.59)歲。根據(jù)活動(dòng)性肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)將肺結(jié)核患者分為非活動(dòng)性肺結(jié)核組60例、活動(dòng)性肺結(jié)核組60例[8]，其中活動(dòng)性肺結(jié)核患者治療方案為2HREZ/4HR。同時(shí)選取同期健康體檢者60例為對(duì)照組，其中男30例，女30例，年齡50～70歲，平均年齡(60.21±9.25)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并自身免疫性疾??；合并腫瘤患者。各組研究對(duì)象年齡(t=0.416，P=0.678)、性別(=1.125，P=0.289)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情且簽署同意書(shū)。

二、主要試劑及儀器

Trizol試劑、Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Invotrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司；熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；miR-27b-3p寡核苷酸模擬物(miR-27b-3p mimics)及陰性對(duì)照mimic NC序列(miR-NC)、CASC7小分子干擾RNA(si-CASC7)、亂序無(wú)意義陰性序列(si-NC)購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；pcDNA3.1購(gòu)自上海索寶生物科技有限公司；熒光素酶報(bào)告基因載體及其活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；結(jié)核菌強(qiáng)毒株H37Rv與弱毒株H37Ra購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；CD14+免疫磁珠購(gòu)自德國(guó)Miltenyi公司；7500型熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司；MACS自動(dòng)磁珠分選儀購(gòu)自上海秉新生物科技有限公司。

三、方法

1 分離外周血單核細(xì)胞

分別抽取所有研究對(duì)象外周血5 mL，采用肝素鋰抗凝，應(yīng)用密度梯度離心法分離外周血單核細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)(1×107個(gè)/mL)，加入CD14+免疫磁珠(5 μL)，置于4 ℃冰箱內(nèi)孵育20 min，應(yīng)用MACS自動(dòng)磁珠分選儀分離CD14+單核細(xì)胞。

2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)CASC7與miR-27b-3p的表達(dá)水平

采用Trizol法提取單核細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，用2-ΔΔCt法計(jì)算CASC7與miR-27b-3p相對(duì)表達(dá)量。

3 體外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)[9]

H37Rv、H37Ra分別感染單核細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育90 min，取出細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，qRT-PCR法檢測(cè)CASC7與miR-27b-3p相對(duì)表達(dá)量。

4 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)CASC7與miR-27b-3p的靶向關(guān)系

利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，將結(jié)合位點(diǎn)與突變位點(diǎn)載入熒光素酶報(bào)告基因載體分別構(gòu)建野生型載體WT-CASC7與突變型載體MUT-CASC7，分別將miR-NC、miR-27b-3p mimcs與WT-CASC7、MUT-CASC7共轉(zhuǎn)染至人單核細(xì)胞，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，檢測(cè)各組熒光素酶活性。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CASC7與miR-27b-3p的表達(dá)量

與感染前比較，H37Rv、H37Ra感染后單核細(xì)胞中CASC7的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，miR-27b-3p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CASC7與miR-27b-3p的表達(dá)量

二、CASC7靶向調(diào)控miR-27b-3p

LncBase v.2預(yù)測(cè)顯示CASC7與miR-27b-3p存在靶向結(jié)合位點(diǎn)(見(jiàn)圖1)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-27b-3p過(guò)表達(dá)可明顯抑制野生型載體WT-CASC7的熒光素酶活性(P<0.05)(見(jiàn)表2)。CASC7負(fù)向調(diào)控miR-27b-3p的表達(dá)(P<0.05)(見(jiàn)表3)。

圖1 CASC7的序列中含有與miR-27b-3p互補(bǔ)的核苷酸序列

表2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表3 CASC7靶向調(diào)控miR-27b-3p的表達(dá)

三、肺結(jié)核患者外周血單核細(xì)胞中CASC7與miR-27b-3p的表達(dá)量

與對(duì)照組比較，研究組患者外周血單核細(xì)胞中CASC7的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，miR-27b-3p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(見(jiàn)表4)。

表4 肺結(jié)核患者外周血單核細(xì)胞中CASC7與miR-27b-3p的表達(dá)量

四、活動(dòng)性肺結(jié)核與非活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血單核細(xì)胞中CASC7與miR-27b-3p的表達(dá)量

與非活動(dòng)性肺結(jié)核組比較，活動(dòng)性肺結(jié)核組患者外周血單核細(xì)胞中CASC7的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，miR-27b-3p的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(見(jiàn)表5)。

表5 活動(dòng)性肺結(jié)核與非活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血單核細(xì)胞中CASC7與miR-27b-3p的表達(dá)量

五、ROC分析CASC7與miR-27b-3p對(duì)肺結(jié)核的診斷價(jià)值

ROC分析CASC7與miR-27b-3p對(duì)肺結(jié)核的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示CASC7診斷時(shí)敏感度為57.50%，特異度為91.67%，AUC面積為0.781，95%CI：0.713-0.839，截?cái)嘀禐?.85；miR-27b-3p診斷時(shí)敏感度為57.50%，特異度為81.67%，AUC面積為0.665，95%CI：0.591～0.733，截?cái)嘀禐?.08；聯(lián)合檢測(cè)時(shí)敏感度為96.67%，特異度為60.00%，AUC面積為0.802，95%CI：0.736～0.858，截?cái)嘀禐?.51(見(jiàn)圖2)。

圖2 ROC分析CASC7與miR-27b-3p對(duì)肺結(jié)核的診斷價(jià)值

討 論

CASC7可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-21的表達(dá)而抑制心肌缺血再灌注大鼠的心肌細(xì)胞凋亡[10]。CASC7通過(guò)靶向miR-21而抑制PI3K / AKT信號(hào)通路從而增強(qiáng)嚴(yán)重哮喘患者糖皮質(zhì)激素的敏感性[11]。CASC7還可在神經(jīng)母細(xì)胞瘤等腫瘤中異常表達(dá)，并可參與腫瘤發(fā)生及發(fā)展過(guò)程[12]。本研究結(jié)果顯示肺結(jié)核患者外周血單核細(xì)胞中CASC7的表達(dá)水平降低，提示CASC7在肺結(jié)核發(fā)生過(guò)程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。進(jìn)一步研究顯示活動(dòng)性肺結(jié)核組患者外周血單核細(xì)胞中CASC7的表達(dá)水平低于非活動(dòng)性肺結(jié)核組，提示CASC7水平高低可能用于判斷肺結(jié)核疾病嚴(yán)重程度或疾病進(jìn)展。同時(shí)本研究采用ROC分析CASC7對(duì)肺結(jié)核的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示敏感度與特異度較高，提示CASC7對(duì)肺結(jié)核具有一定診斷價(jià)值。但單項(xiàng)檢測(cè)具有一定假陽(yáng)性或假陰性，而兩項(xiàng)或多項(xiàng)聯(lián)合檢測(cè)可提高診斷效率。

本研究結(jié)果顯示肺結(jié)核患者外周血單核細(xì)胞中miR-27b-3p的表達(dá)水平升高，進(jìn)一步分析顯示活動(dòng)性肺結(jié)核患者外周血單核細(xì)胞中miR-27b-3p的表達(dá)水平高于非活動(dòng)性肺結(jié)核患者。miR-27b-3p在急性缺血性卒中患者中表達(dá)水平升高，并可能作為診斷急性缺血性卒中的生物標(biāo)志物[13]。miR-27b-3p過(guò)表達(dá)可減輕心房纖維化[14]。miR-27b-3p通過(guò)靶向HIPK2而抑制類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的軟骨細(xì)胞凋亡[15]。表明miR-27b-3p在炎癥性疾病中高表達(dá)，并可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究結(jié)果提示miR-27b-3p在肺結(jié)核發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。進(jìn)一步分析顯示CASC7與miR-27b-3p聯(lián)合檢測(cè)可明顯提高敏感度。目前關(guān)于CASC7與miR-27b-3p在肺結(jié)核發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中作用機(jī)制尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)H37Rv、H37Ra菌株可明顯抑制CASC7的表達(dá)及促進(jìn)miR-27b-3p的表達(dá)，分析原因可能是單核細(xì)胞在結(jié)核菌感染過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而肺結(jié)核患者單核細(xì)胞中CASC7、miR-27b-3p分子的差異表達(dá)，可準(zhǔn)確反映單核細(xì)胞感染結(jié)核菌后機(jī)體出現(xiàn)免疫應(yīng)答反應(yīng)，因而CASC7、miR-27b-3p可能作為診斷肺結(jié)核的潛在生物標(biāo)記，并可能作為肺結(jié)核靶向治療的潛在靶點(diǎn)。同時(shí)本研究采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)與qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)CASC7可靶向結(jié)合miR-27b-3p，并可負(fù)向調(diào)控miR-27b-3p的表達(dá)。提示CASC7可能通過(guò)負(fù)向調(diào)控miR-27b-3p的表達(dá)從而參與肺結(jié)核發(fā)生及發(fā)展過(guò)程。(過(guò)多的描述了本文的研究結(jié)果，而沒(méi)有與以往研究進(jìn)行機(jī)理上或者不同疾病中發(fā)揮作用的對(duì)比)回復(fù)：CASC7與miR-27b-3p在肺結(jié)核發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中作用機(jī)制撒尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

綜上所述，肺結(jié)核外周血單核細(xì)胞中CASC7的表達(dá)水平降低，miR-27b-3p的表達(dá)水平升高，二者聯(lián)合檢測(cè)可提高肺結(jié)核診斷效率，CASC7可能作為肺結(jié)核治療的潛在靶點(diǎn)，但關(guān)于CASC7在肺結(jié)核患者體內(nèi)表達(dá)降低是否與細(xì)胞凋亡有關(guān)，及其具體作用機(jī)制仍需深入探究。