趙 軍，師建平，董重陽，劉 巖，常 虹，劉 晉

1 內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010020；2 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學中醫(yī)學院；3 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥中最常見的一種，隨著女性絕經(jīng)后雌激素水平的降低，骨形成與骨吸收代謝失衡，導致骨量減少，骨微細結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，嚴重者發(fā)展為脆性骨折。其發(fā)病機制是成骨細胞和破骨細胞維持的骨代謝失衡。其中成骨細胞起著重要作用，而目前應用的抗骨質(zhì)疏松藥物（降鈣素、二磷酸鹽、雌激素等）多為抑制破骨細胞活性的藥物，缺乏刺激成骨細胞活性或既刺激成骨細胞又抑制破骨細胞的藥物。因此，深入研究具有以上優(yōu)勢的植物化合物防治骨質(zhì)疏松癥的機制，對提高患者的生活質(zhì)量具有重要意義［1］。

骨質(zhì)疏松屬蒙醫(yī)中“骨枯癥”范疇。蒙醫(yī)經(jīng)典醫(yī)籍《觀者之喜》中有“老年人赫依偏盛，易骨枯，治以補為主，補暖補精，而抑赫依過?！钡恼撌?。老年人屬“體熱趨于減弱，顯示赫依優(yōu)勢”的體質(zhì)［2］，此時人體內(nèi)“赫依”體素過剩，使體內(nèi)“三根、七素”平衡失調(diào)，隨著七素三根分解與吸收以及排泄功能的紊亂，精華與糟粕的分解不充分，骨之精華減少，從而發(fā)生骨枯癥［3］，使骨脆性增加而易于骨折。蒙藥藍刺頭味苦，性涼，效稀、柔、鈍、輕，有固骨質(zhì)、接骨愈傷、清熱解毒，殺“黏”止痛等功效，主治筋骨折傷、骨傷熱、刺痛、金創(chuàng)、瘡瘍等癥［4］。有研究顯示［5］：蒙藥藍刺頭具有植物雌激素樣作用，可通過雌激素樣作用及促進骨形成對骨吸收、骨形成偶聯(lián)有一定調(diào)節(jié)作用，能降低骨轉(zhuǎn)換率，以此達到防治PMOP 的目的。藍刺頭可通過降低卵巢切除使雌激素水平急劇下降所致的骨高轉(zhuǎn)換率，抑制骨吸收，調(diào)節(jié)骨吸收-骨形成偶聯(lián)，防止骨量快速丟失，從而延緩絕經(jīng)后骨量丟失的發(fā)生發(fā)展，以此起到防治PMOP 的作用［6］。為豐富藍刺頭基于”補腎壯骨”（經(jīng)典雌激素通路）抗骨質(zhì)疏松機制的實驗研究內(nèi)容，本研究進一步探討蒙藥藍刺頭對去卵巢大鼠瘦素（leptin，LEP）、股骨β2腎上腺素能受體（β2-adrenergic receptor，ADRβ2R）的調(diào)節(jié)作用，為基于蒙醫(yī)“腎主骨，治以補暖補精”理論防治骨質(zhì)疏松提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑蒙藥藍刺頭制劑（廣州中醫(yī)藥大學技術(shù)產(chǎn)業(yè)園有限公司）；強骨膠囊（北京岐黃制藥有限公司，批號：20181103，規(guī)格：0.25 g/粒）；己烯雌酚片（合肥久聯(lián)制藥有限公司，批號：20181004，規(guī)格：0.5 mg/片）；水合氯醛（上海恒遠生物技術(shù)發(fā)展有限公司，批號：H32022265，規(guī)格：100 g/瓶）；LEP Elisa 試劑盒、兔抗大鼠ADRβ-2R 抗體、DAB 顯色試劑盒、PBS 緩沖液均由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供。

1.2 動物與飼養(yǎng)環(huán)境4 月齡雌性Wistar 大鼠70 只，平均體質(zhì)量（250±20.00）g，購于內(nèi)蒙古大學實驗動物研究中心，實驗動物合格證號：SCXK（蒙）2002-0001。實驗室：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學基礎(chǔ)實驗樓病理學實驗室。大鼠為清潔級，飼養(yǎng)條件一致，標準飼料喂養(yǎng)，恒溫、恒濕，室溫（25±3）℃，空氣濕度55%～65%，自然光照、通風良好、自由進食水，養(yǎng)于專用鼠籠內(nèi)，每籠10 只，購回適應性飼養(yǎng)7天左右。

1.3 動物分組與模型復制將Wistar大鼠70只隨機分為藍刺頭高、中、低劑量組及強骨膠囊組、己烯雌酚組、模型組、假手術(shù)組。PMOP 模型的復制參考文獻［7］進行，假手術(shù)組不切卵巢只切除卵巢周圍少量脂肪，造?？p合創(chuàng)口后5 天將大鼠陰道脫落細胞進行涂片并觀察［1］。方法為將蘸有PBS 緩沖液的消毒棉簽輕輕插入大鼠陰道，慢慢轉(zhuǎn)動后移出，然后將蘸有陰道脫落細胞的棉簽沿同一方向滾動，均勻涂抹于干凈的載玻片上，迅速滴加36%甲醛溶液1滴覆蓋載玻片涂片處，固定15 min，然后浸沒于20%甲基藍染液中染色45 min，蒸餾水沖洗透明，水溶性封片劑封片，普通光學顯微鏡下觀察細胞的著色情況及形態(tài)。結(jié)果為假手術(shù)組大鼠陰道涂片充滿有核細胞、白細胞和角質(zhì)化細胞，而模型組中很少見上述細胞，表明造模成功，見圖1—2。

圖1 假手術(shù)組（甲基藍染色，×400）

圖2 模型組（甲基藍染色，×400）

1.4 藥物干預及標本采集正常飼養(yǎng)90 天后灌胃給藥。藍刺頭高、中、低劑量組依據(jù)人鼠體質(zhì)量比例及人鼠代謝速率比折算后分別以27.5000、13.7500、6.8750 mg/mL 的劑量灌胃給藥，以低劑量組為臨床等效劑量。強骨膠囊23.4375 mg/mL，己烯雌酚0.0313 mg/mL，均按成人劑量的有效量給藥；模型組和假手術(shù)組灌胃相應體積的0.9%氯化鈉溶液。同時將各組大鼠給藥濃度換算為按大鼠體質(zhì)量每克每天灌胃0.02 mL。處死前1 天停止給食，腹腔注射10%水合氯醛0.8 mL麻醉，心內(nèi)采血約6～10 mL于離心管內(nèi)，以3 000 r/min離心5 min后分離血清，檢測血清LEP；處死大鼠剖取雙側(cè)完整股骨，分離附著的肌肉組織，保留完整骨膜，標記股骨，測定右側(cè)股骨離體骨密度（bone mineral density，BMD）、骨小梁體積/組織體積（bone trabecula volume/tissue volume，BV/TV）；用4%甲醛溶液浸泡左側(cè)股骨、大鼠子宮，室溫保存10天，檢測骨ADRβ2R表達及子宮重量/體質(zhì)量（uterus weight/body weight，UW/BW）。

1.5 骨組織形態(tài)計量學測定采用顯微CT 分析大鼠右側(cè)股骨BMD、BV/TV及子宮UW/BW。

1.6 血清LEP 表達水平測定運用酶聯(lián)儀檢測各孔吸光度（OD）值，實驗步驟按試劑盒說明書操作。

1.7 股骨頭ADRβ2R表達測定采用免疫化學組織法檢測左側(cè)股骨頭ADRβ2R表達。

1.7.1 大鼠左側(cè)股骨脫鈣方法將大鼠左側(cè)股骨于4%甲醛固定液中固定10天后，用EDTA脫鈣液連續(xù)脫鈣20天，以能將針頭刺入骨皮質(zhì)為宜；然后采用免疫組織化學法檢測股骨頭中ADRβ2R的表達。

1.7.2 蠟塊的制備及免疫組化染色常規(guī)包埋、染色（由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學病理學學實驗中心協(xié)助完成）。每組大鼠取5 張切片，每張切片隨機選擇5 個視野，在光學顯微鏡下觀察各組染色情況，采用醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)測定鏡下細胞光密度值。ADRβ2R以細胞質(zhì)、膜染成淡黃色或棕黃色為陽性。

1.8 統(tǒng)計學方法采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 骨組織形態(tài)計量學變化顯微CT 掃描大鼠右側(cè)股骨近心端，結(jié)果顯示：1）與假手術(shù)組比較，模型組BMD、BV/TV及UW/BW降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；藍刺頭高、低劑量組BMD、BV/TV 降低明顯（P＜0.05），而UW/BW 升高明顯（P＜0.05）；2）與模型組比較，藍刺頭中劑量組及己烯雌酚組BMD、BV/TV 及UW/BW 升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而藍刺頭高、低劑量組升高不顯著（P＞0.05）；3）藍刺頭中劑量組、己烯雌酚組、假手術(shù)組之間BMD、BV/TV 比較差異不明顯（P＞0.05），UW/BW比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠組織形態(tài)計量學比較（±s）

表1 各組大鼠組織形態(tài)計量學比較（±s）

注：與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與假手術(shù)組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

2.2 血清LEP 水平與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清LEP升高顯著（P＜0.01），藍刺頭高、低劑量組升高（P＜0.05）；與模型組比較，藍刺頭中劑量組LEP 降低明顯（P＜0.01），己烯雌酚組LEP 降低（P＜0.05），藍刺頭高、低劑量組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；藍刺頭中劑量組、己烯雌酚組、假手術(shù)組之間LEP比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清LEP含量比較（±s）

表2 各組大鼠血清LEP含量比較（±s）

注：與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與假手術(shù)組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

2.3 各組大鼠左側(cè)離體股骨頭ADRβ2R表達與假手術(shù)組比較，模型組ADRβ2R表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，藍刺頭中劑量組ADRβ2R降低明顯，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），藍刺頭高、低劑量組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與藍刺頭高、低劑量組比較，藍刺頭中劑量組、強骨膠囊組、己烯雌酚組、假手術(shù)組ADRβ2R 降低，差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；藍刺頭中劑量組、強骨膠囊組、己烯雌酚組、假手術(shù)組比較，ADRβ2R 差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3、圖3。

表3 各組大鼠左側(cè)離體股骨頭ADRβ2R光密度值比較（±s）

表3 各組大鼠左側(cè)離體股骨頭ADRβ2R光密度值比較（±s）

注：與模型組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與假手術(shù)組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

圖3 各組大鼠左側(cè)離體股骨頭ADRβ2R表達情況（免疫組化染色，×400）

3 討論

交感神經(jīng)系統(tǒng)對骨量調(diào)控具有重要作用。交感神經(jīng)系統(tǒng)廣泛分布于外周組織器官，骨小梁和成骨細胞附近有交感神經(jīng)纖維，成骨細胞和破骨細胞上都具有ADRβ2R［8］。骨組織能通過神經(jīng)骨骼信號通路調(diào)節(jié)骨骼系統(tǒng)微循環(huán)營養(yǎng)環(huán)境，通過交感神經(jīng)末梢直接釋放神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)骨代謝。近年研究發(fā)現(xiàn)LEP 對骨代謝有至關(guān)重要的調(diào)控作用。LEP 介導的交感神經(jīng)活動能抑制骨組織形成［9］，LEP 可透過大腦血腦屏障作用于下丘腦神經(jīng)細胞，刺激興奮外周交感神經(jīng)系統(tǒng)，成骨細胞表面的ADRβ2R 介導其發(fā)揮作用，ADRβ2R 被激活后可促進LEP 和白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）等破骨因子的表達［10］，進而促進破骨細胞生成和分化，導致骨量下降，骨微結(jié)構(gòu)破壞，從而抑制骨形成［11-12］。成骨細胞和破骨細胞上均存在ADRβ2R，β2受體激動劑可刺激骨髓破骨細胞生成而增強人和大鼠成熟破骨細胞的骨吸收活性［13］，導致骨量下降；相反，抑制該受體會促進骨形成，增加骨量。ADRβ2R 拮抗劑能刺激成骨細胞上ADRβ2R，能下調(diào)成骨細胞分化，降低核心結(jié)合因子α1 的表達［14］；外周交感神經(jīng)系統(tǒng)通過骨組織表面ADRβ2R抑制骨形成。

LEP 是一種能引起攝食減少、體內(nèi)能耗增加的抗肥胖因子，近來研究表明它同樣參與了骨形成的調(diào)節(jié)［15］。LEP 在中樞抑制骨形成。LEP 抑制骨形成的中樞神經(jīng)通路與硫葡萄糖敏感的神經(jīng)元有關(guān)，與LEP 抑制食欲效應的促黑色素和促阿黑皮素原途徑無關(guān)，交感神經(jīng)系統(tǒng)參與了該途徑［16］。LEP在外周促進骨形成。骨細胞有LEP受體表達，LEP 可直接作用于成骨細胞，促進其分化和成熟。LEP是骨重建的重要調(diào)節(jié)劑。

本研究中與模型組比較，己烯雌酚組治療效果顯著，大鼠BMD、BV/TV、UW/BW均增加（P＜0.01）；藍刺頭高、低劑量組增加不顯著（P＜0.01）；藍刺頭中劑量組治療效果與強骨膠囊組相似。說明在骨組織形態(tài)學結(jié)構(gòu)變化方面，藍刺頭防治模型大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松有效，中劑量組表現(xiàn)明顯。模型組血清LEP 和股骨頭ADRβ2R 的表達量顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05），說明大鼠在人為去卵巢術(shù)后體內(nèi)LEP 含量增高，股骨ADRβ2R 表達上升，骨破壞作用增強。藍刺頭低、高劑量組與模型組相比，血清LEP 和股骨頭ADRβ2R 的表達均未見明顯差異（P＞0.05），說明在一定濃度范圍內(nèi)，藍刺頭可抑制去卵巢大鼠血清LEP 和股骨頭ADRβ2R 的表達，從而起到一定的骨保護作用。

“腎主骨生髓”是中醫(yī)腎臟生理功能的一個重要組成部分，同時也是蒙醫(yī)“骨枯癥”的重要內(nèi)容。蒙醫(yī)認為人年幼時發(fā)病以巴達干為主，青壯年以稀日為主，老年以赫依為主。骨是蒙醫(yī)“三元”氣（赫）所存之區(qū)，所以骨骼的生長和功能取決于腎氣的盛衰。老年人赫依偏盛，易骨枯，治以補為主，補暖補精。因此，無論中醫(yī)還是蒙醫(yī)，“補腎壯骨”治法均應貫穿始終，而蒙藥藍刺頭是蒙醫(yī)補腎常用藥。本研究中大鼠去卵巢后血清LEP 和股骨頭ADRβ2R 的表達均明顯增高，而蒙藥藍刺頭能降低LEP 和股骨頭ADRβ2R，效果與己烯雌酚、強骨膠囊相當，能顯著提高去卵巢大鼠骨密度及骨形態(tài)學指標，起到骨保護作用。這種效應可能通過蒙藥藍刺頭下調(diào)LEP 和ADRβ2R 表達，抑制破骨細胞生成和分化，進一步促進骨形成，增加骨量有關(guān)。這為蒙藥藍刺頭依據(jù)“腎主骨，治以補暖補精”理論防治PMOP 提供了實驗依據(jù)，但詳細機制和作用通道還需進一步研究。