劉 艷，謝 君，王 竹，李睿萍，孫萬森△

1 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西 西安710004；2 西安市胸科醫(yī)院

汪昂《醫(yī)方集解》云：“肺為水之上源，腎為水之下源”，水通道蛋白（aquaporin-4，AQP4）與機(jī)體水液代謝密切相關(guān)。本研究觀察AQP4在單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）大鼠肺、腎組織的不同表達(dá)及祛風(fēng)通絡(luò)方的干預(yù)作用，探求肺、腎在水液代謝過程中的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，為祛風(fēng)通絡(luò)方的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與藥品健康SPF 級(jí)雄性成年SD 大鼠40 只，體質(zhì)量（200±20）g，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（陜）2017-001；纈沙坦膠囊（代文，北京諾華制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H20040217，規(guī)格：80 mg/片）；祛風(fēng)通絡(luò)方購于西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院草藥房，由黃芪、烏梢蛇、防風(fēng)、海風(fēng)藤、生地黃、桑寄生組成，每劑含生藥130 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑兔抗大鼠一抗（美國Santa Cruz 公司，批號(hào)：sc-32739）；SP 試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：SP-9001）；Anti-Aquaporin 4 antibody（美國abcam 公司，批號(hào)：ab952）；Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody（批號(hào)：L3031）及Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody（批 號(hào)：L3011）均 由Signalway antibody 公司提供；總RNA 極速抽提試劑盒（上海飛捷生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：RNAfast200）；PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa 公 司，批號(hào)：RR036A）；SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（TaKaRa公司，批號(hào)：RR820A）。

1.3 動(dòng)物分組及模型制備48 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后按隨機(jī)數(shù)字表法選出8 只作為空白組。剩余40只采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎法［1］建立大鼠腎病模型，1 周后從造模大鼠中按隨機(jī)數(shù)字表法抽取8只，腹腔注射10%水合氯醛（0.4 mL/100 g）麻醉，取大鼠腎臟組織HE 染色，若見大量腎小管萎縮，炎癥細(xì)胞浸潤，大量基質(zhì)沉積，提示造模成功［2］。將造模成功32 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、纈沙坦組及祛風(fēng)通絡(luò)方大、小劑量組，每組8 只。術(shù)后第一天開始灌胃，祛風(fēng)通絡(luò)方大、小劑量組分別給予2、1 g/mL濃度藥液2 mL，空白組、模型組灌服等體積生理鹽水，每日1次，共20天。給藥結(jié)束后處死大鼠，取術(shù)側(cè)肺、腎組織，一半置于4%多聚甲醛溶液中固定，脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，一半用生理鹽水沖洗、吸干后液氮速凍，置-80℃冰箱保存。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 免疫組化法檢測肺、腎組織AQP4表達(dá)石蠟切片梯度酒精脫蠟后以微波熱修復(fù)進(jìn)行抗原修復(fù)，低火微波加熱3 min，高火10 min，室溫放置60 min，一抗按l∶200 進(jìn)行稀釋，4℃過夜，PBS 沖洗4次后滴加二抗，DBA顯色，脫水、封片。每個(gè)組織取3 張切片，各觀察3 個(gè)視野，用Image-pro pluss 6.0 彩色圖像分析系統(tǒng)分別掃描測量陽性細(xì)胞的積分光密度值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.2 Western blot 檢測肺、腎組織AQP4 蛋白表達(dá)分別取大鼠肺、腎組織100 mg研磨，加入裂解液（比例：600～700μL/100 mg）混勻，充分裂解后，轉(zhuǎn)移至離心管，4℃，離心半徑8 cm，1500 r/min，離心15 min，-20℃保存。Western blot步驟：制膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，傾去封閉液，加入一抗（1∶600），4℃過夜，將PVDF 膜用PBST 洗4 次，每次10 min，加入二抗（山羊抗小鼠，1∶10 000），搖床上孵育1.5 h 后回收二抗，再將PVDF膜用PBST洗3次，每次10 min。計(jì)算機(jī)掃描記錄結(jié)果，采用美國BIO-RAD公司的Quantity One 軟件半定量分析檢測條帶的灰度值。

1.4.3 RT-PCR 法檢測胃及腎組織AQP4 mRNA 表達(dá)分別取大鼠肺、腎組織100 mg，總RNA 提取按照RNAfast200總RNA極速抽提試劑盒說明書進(jìn)行，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script RT Master Mix 說明書進(jìn)行操作，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參擴(kuò)增AQP4 基因片段，引物序列由生工生物工程股份有限公司合成。按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，PCR條件為：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火并延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析產(chǎn)物特異性，參數(shù)為95℃變性15 s，60℃退火30 s，95℃延伸15 s。在凝膠成像分析儀上成像，計(jì)算AQP4 mRNA和GAPDH mRNA平均吸光度比值。引物序列見表1。

表1 AQP4及GAPDH的引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肺、腎組織AQP4 表達(dá)各組大鼠肺、腎組織AQP4積分光密度表達(dá)結(jié)果見表2及圖1—2。

表2 各組大鼠肺、腎組織AQP4積分光密度表達(dá)（±s）

表2 各組大鼠肺、腎組織AQP4積分光密度表達(dá)（±s）

注：*表示與空白組比較，P＜0.01；△表示與模型組比較，P＜0.01；▲表示與祛風(fēng)通絡(luò)方小劑量組、纈沙坦組組比較，P＜0.05

圖1 各組大鼠肺組織AQP4表達(dá)（免疫組織化學(xué)法，×200）

圖2 各組大鼠腎組織AQP4表達(dá)（免疫組織化學(xué)法，×200）

2.2 大鼠肺、腎組織AQP4 western blot 檢測結(jié)果各組大鼠肺組織中AQP4蛋白表達(dá)結(jié)果見表3及圖3—4。

2.3 大鼠肺、腎組織AQP4 RT-PCR檢測結(jié)果各組大鼠肺、腎組織AQP4 RT-PCR含量變化見表4。

表3 各組大鼠肺、腎組織中AQP4蛋白含量的變化（±s）

表3 各組大鼠肺、腎組織中AQP4蛋白含量的變化（±s）

注：*表示與空白組比較，P＜0.01；△表示與模型組比較，P＜0.01；▲表示與祛風(fēng)通絡(luò)方小劑量組、纈沙坦組組比較，P＜0.05

圖3 各組大鼠肺組織中AQP4蛋白表達(dá)Western blot結(jié)果

圖4 各組大鼠腎組織中AQP4蛋白表達(dá)Western blot結(jié)果

表4 各組大鼠肺、腎組織AQP4 mRNA含量的變化（±s）

表4 各組大鼠肺、腎組織AQP4 mRNA含量的變化（±s）

注：*表示與空白組比較，P＜0.01；△表示與模型組比較，P＜0.01；▲表示與祛風(fēng)通絡(luò)方小劑量組、纈沙坦組比較，P＜0.05

3 討論

AQP 是一種生物膜通道蛋白，是細(xì)胞膜上與水的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，AQP4 是水通道蛋白家族中的一員，其在腎臟主要表達(dá)于內(nèi)髓集合管上皮細(xì)胞基底膜及近曲小管上皮的頂質(zhì)膜內(nèi)側(cè)囊，在呼吸系統(tǒng)主要表達(dá)于氣道黏膜上皮及肺泡上皮細(xì)胞［3-4］。AQP是機(jī)體水液轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝的重要生物學(xué)基礎(chǔ)［5］。機(jī)體的水液代謝依賴于肺氣的宣降，腎陽的蒸化和脾的轉(zhuǎn)輸，而三焦是水液升降的通道，由于肺居上而腎居下，籍三焦而相互連系共司行水之機(jī)，所以有“肺為水之上源，腎為水之下源”之說［6］。水濕既是慢性腎臟疾病的主要致病因素，也是其主要病理產(chǎn)物，故治腎病必當(dāng)治水濕。祛風(fēng)通絡(luò)方是以“腎絡(luò)空虛，風(fēng)伏腎絡(luò)，水濕不化，久則腎絡(luò)不通”為病機(jī)而組成的治療慢性腎臟疾病的中藥復(fù)方，該方具有保護(hù)腎小球?yàn)V過屏障、減輕尿蛋白、抑制系膜細(xì)胞增殖、延緩腎小球硬化進(jìn)展、保護(hù)腎功能等作用［7-8］。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，UUO 模型組AQP4 的表達(dá)減少，各治療組AQP4 表達(dá)增加，其中祛風(fēng)通絡(luò)方大劑量組增加較明顯，且肺、腎組織中AQP4的表達(dá)呈一致性，可見祛風(fēng)通絡(luò)方可通過調(diào)節(jié)肺、腎AQP4的表達(dá)來改善機(jī)體水液代謝功能，從而達(dá)到防治慢性腎臟疾病的目的。但是其療效是否存在劑量及依賴關(guān)系，或者在慢性腎臟疾病治療中是否存在最佳劑量及取得最好的療效，尚需要進(jìn)一步研究。AQP4的表達(dá)受到多種因素調(diào)節(jié)，不同組織和病理狀態(tài)下，其調(diào)控方式不盡相同，需要深入研究。