程宇航，邱 靜，鄢文靜，張雨婷，汪怡萍，譚子虎

湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢430065

阿爾茨海默病（alzheimer’s disease，AD）是一種以認(rèn)知功能障礙為核心、伴有日常生活能力及社會(huì)功能損害為特點(diǎn)的神經(jīng)退行性疾病，占癡呆總數(shù)的50%～70%，遠(yuǎn)高于其他類型癡呆［1］。目前AD 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，尚缺乏有效預(yù)防和治療藥物，積極尋求新的治療方法顯得尤為重要。本課題組以健脾補(bǔ)腎、祛瘀化痰為法擬定加減薯蕷丸，前期臨床研究［2］發(fā)現(xiàn)其能提高輕、中度AD 患者簡(jiǎn)易智能量表、日常生活功能量表評(píng)分，因此有必要對(duì)加減薯蕷丸對(duì)AD 的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，本研究應(yīng)用APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠探討加減薯蕷丸治療AD的可能機(jī)制，為藥物的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF 級(jí)5 月齡APP/PS1 雄性雙轉(zhuǎn)基因小鼠，購(gòu)于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（蘇）20180008，體質(zhì)量（33.7±3.2）g。飼養(yǎng)于湖北省中醫(yī)院SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。溫度（21±3）℃，相對(duì)濕度（60±5）%，自由飲食飲水，12 h明暗交替。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物加減薯蕷丸濃縮劑（薯蕷健脾益智合劑，湖北省中醫(yī)院制劑中心制備，鄂藥制字Z20150027，批號(hào)：20190101）。藥物組成：山藥30 g，制何首烏24 g，熟地黃24g，黨參20 g，麩炒白術(shù)18 g，茯苓18 g，白芍20 g，當(dāng)歸20 g，川芎10 g，杜仲15 g，炙遠(yuǎn)志12 g，石菖蒲14 g，枸杞子18 g，五味子10 g。加水煎煮3 次，每次1 h，過(guò)濾合并，經(jīng)物理方法濃縮提純，制成口服液，含生藥1 g/mL，真空包裝，250 mL/袋，4℃冷藏備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器RIPA 裂解液（批號(hào)：P0013B）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于碧云天（批號(hào)：P0010）；ECL 底物液（Thermo，批號(hào)：NCI5079）、兔多抗p-AMPKα1（thr172，批號(hào)：2535S）、兔多抗p-eEF2（thr56，批號(hào)：A00830-2）、兔多抗eEF2K（批號(hào)：A02277-1）購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；鼠單抗p-eEF2K（ser366，批號(hào)：3691S)購(gòu)于santa cruz；SYN-1(批號(hào)：5297S、111-005-003）及PSD-95(批號(hào)：36233s、115-005-003)檢驗(yàn)所用一抗、二抗均由湖北中醫(yī)藥大學(xué)提供。mulISKANMK3型酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）；HI650型離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；微量移液器（Eppendorf）；CPA 電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；DYCZ-24DN 垂直電泳槽、DYCZ-40轉(zhuǎn)膜儀、DYCZ-24K電泳儀（北京六一儀器廠）；三套自制新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)工具（每套包含1 個(gè)40 cm×40 cm×40 cm 空箱，2 個(gè)相同物體及1 個(gè)大小與前者相同、但顏色形狀不同的新物體）。

1.4 分組與給藥20 只雄性5 月齡APP/PS1 小鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、中藥組各10 只；另取10 只同窩野生型小鼠作為空白組，中藥組按14 g/（kg·d）灌胃（根據(jù)大鼠有效灌胃劑量進(jìn)行換算）加減薯蕷丸濃縮劑，每日1次，連續(xù)28天；模型組和空白組灌胃同體積生理鹽水。

1.5 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)空箱均安置于安靜環(huán)境中，實(shí)驗(yàn)分為3 個(gè)部分：適應(yīng)期，將小鼠放置于空箱中，每天上下午各1 次，10 min/次，持續(xù)3 天；熟悉期，將兩個(gè)相同物體放入同一空箱內(nèi)對(duì)稱位置，讓小鼠自由探索10 min；測(cè)試期24 h后，將測(cè)試箱中的1 個(gè)物體替換為另一種大小相近、顏色和形狀不同的新物體，位置不變，記錄小鼠探索新物體的時(shí)間A（s）和探索原物體的時(shí)間B（s）。每次將小鼠放入空箱內(nèi)的位置和方向相同，不同小鼠之間測(cè)試時(shí)需清理測(cè)試箱，測(cè)試完成后計(jì)算各組小鼠的相對(duì)分辨指數(shù)（A-B）/（A+B）。

1.6 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)蛋白水平小鼠水合氯醛麻醉后斷頭取腦，冰上分離海馬，根據(jù)實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行海馬蛋白提取。采用BCA 試劑盒對(duì)蛋白樣品進(jìn)行濃度測(cè)定，每孔蛋白上樣量30μg，電泳、轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉或5%BSA室溫封閉2 h，按不同比例稀釋一抗（AMPKα1 1∶2000，eEF2 1∶400，p-AMPKα1、p-eEF2、eEF2K、p-eEF2K均為1∶1000，SYN-1 為1∶500，PSD-95 為1∶1000）4℃過(guò)夜；1×TBST 液洗3×5 min；二抗（羊抗兔1∶1萬(wàn)，兔抗鼠1∶1萬(wàn)）室溫?fù)u床1 h；1×TBST液洗3×10 min。ECL 發(fā)光液使條帶可視化，Image J 1.41軟件測(cè)量條帶灰度值，以目的蛋白灰度值除以內(nèi)參蛋白β-actin 灰度值，進(jìn)行歸一化處理，將蛋白質(zhì)水平的相對(duì)變化標(biāo)準(zhǔn)化為對(duì)照樣品。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以±s表示，采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 APP/PS1 小鼠分辨指數(shù)小鼠相對(duì)分辨指數(shù)空白組為0.598±0.179，模型組為0.109±0.072，中藥組為0.299±0.172。模型組小鼠的新物體識(shí)別能力較空白組下降，中藥組小鼠新物體識(shí)別能力較模型組提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 APP/PS1 小 鼠 海 馬 區(qū)p-AMPKα1/AMPK α1、p-eEF2K/eEF2K及p-eEF2/eEF2相對(duì)水平與空白組比較，模型組小鼠海馬區(qū)p-AMPKα1/AMPKα1、p-eEF2K/eEF2K 及p-eEF2/eEF2 相對(duì)表達(dá)水平升高（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組p-AMPKα1/AMPKα1、p-eEF2K/eEF2K 及p-eEF2/eEF2 相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.01）。見(jiàn)表1及圖1—3。

表1 各組小鼠海馬蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

表1 各組小鼠海馬蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較（±s）

注：與空白組相比，**表示P＜0.01，*表示P＜0.05；與模型組相比，△△表示P＜0.01，△表示P＜0.05

圖1 小鼠海馬區(qū)AMPKα1電泳圖

圖2 小鼠海馬區(qū)eEF2K電泳圖

圖3 小鼠海馬區(qū)eEF2電泳圖

2.3 加減薯蕷丸對(duì)海馬突觸蛋白SYN 和PSD-95的影響與空白組相比，模型組小鼠SYP、PSD-95相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，中藥組小鼠SYN、PSD-95相對(duì)表達(dá)水平增加（P＜0.01）。見(jiàn)表2及圖4。

表2 各組小鼠海馬突觸相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表2 各組小鼠海馬突觸相關(guān)蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：**表示與空白組比較，P＜0.01；△△表示與模型組比較，P＜0.01

圖4 小鼠海馬區(qū)SYN-1、PSD-95電泳圖

3 討論

加減薯蕷丸是已故名老中醫(yī)呂繼端教授根據(jù)《金匱要略》中薯蕷丸化裁而成，全方以補(bǔ)腎填精、化痰開(kāi)竅為法，前期基于頻數(shù)分析及關(guān)聯(lián)規(guī)則對(duì)古代治療癡呆的方劑進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘發(fā)現(xiàn)，加減薯蕷丸符合中醫(yī)對(duì)呆病“腎虛髓減為本、痰瘀互結(jié)為標(biāo)”的病機(jī)認(rèn)識(shí)［3］。前期研究發(fā)現(xiàn)，加減薯蕷丸可調(diào)節(jié)慢性腦低灌注模型小鼠海馬區(qū)AMPK 水平，降低自噬水平［4］，而加減薯蕷丸是否參與AD 模型AMPK 表達(dá)水平的調(diào)節(jié)尚不清楚。因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠研究加減薯蕷丸對(duì)AMPK、eEF2K/eEF2 蛋白水平的影響，探討加減薯蕷丸參與改善AD學(xué)習(xí)記憶功能的可能調(diào)節(jié)機(jī)制。

突觸可塑性是指突觸之間通過(guò)連接方式的改變以響應(yīng)特定刺激，是長(zhǎng)期記憶形成的基礎(chǔ)。突觸內(nèi)的核糖體、mRNA、翻譯因子對(duì)突觸蛋白質(zhì)合成有重要幫助，這一過(guò)程需要消耗大量能量。大腦因?yàn)槠淠芰績(jī)?chǔ)備少的特性，幾乎所有能量消耗都來(lái)自于線粒體分解葡萄糖產(chǎn)生，而AD 患者腦內(nèi)葡萄糖代謝下降，且這種下降與認(rèn)知功能障礙程度密切相關(guān)［5］，因此腦內(nèi)葡萄糖代謝障礙是突觸可塑性受損的關(guān)鍵因素之一。AMPK 作為調(diào)節(jié)人體能量代謝的關(guān)鍵因子，可以在任何導(dǎo)致ADP/ATP、AMP/ATP 比例升高的情況下激活、增強(qiáng)AMPK 的磷酸化水平以抑制蛋白質(zhì)的合成、減少能量消耗，短時(shí)間內(nèi)恢復(fù)能量代謝穩(wěn)態(tài)，這是一種生理?xiàng)l件下細(xì)胞應(yīng)對(duì)壓力的保護(hù)策略。AMPK由α、β、γ3種亞基構(gòu)成，其中α-催化亞基包含兩種亞型α1、α2，AMPK 的激活依賴于α-亞基的蘇氨酸172 位點(diǎn)磷酸化［6］。在病理狀態(tài)下AMPK 長(zhǎng)時(shí)間激活會(huì)使mRNA 翻譯、合成蛋白質(zhì)這一過(guò)程受阻，導(dǎo)致突觸可塑性破壞和記憶形成障礙［7］，尤其是AD 患者存在糖、脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激增加等多種病理變化［8］，AMPK 磷酸化以抑制蛋白質(zhì)合成的不利影響將被進(jìn)一步擴(kuò)大，加速細(xì)胞應(yīng)激造成的損害。本研究結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組p-AMPKα1/AMPKα1 相對(duì)表達(dá)水平增加，表明APP/PS1 小鼠腦內(nèi)存在合成代謝障礙，同時(shí)存在AMPK 高磷酸化狀態(tài)，加減薯蕷丸干預(yù)后p-AMPKα1/AMPKα1 相對(duì)表達(dá)水平下調(diào)，說(shuō)明加減薯蕷丸可參與AD 能量調(diào)節(jié)，改善AMPK的過(guò)度磷酸化狀態(tài)。

eEF2K 屬于α-激酶的非典型蛋白激酶小家族，可被AMPK 磷酸化其絲氨酸366 位點(diǎn)而激活［9］。eEF2 是eEF2K 目前已知的唯一底物，也是蛋白質(zhì)合成延伸期間肽異位所必需的翻譯因子，eEF2 通過(guò)三磷酸鳥(niǎo)苷（Guanosinetriphosphate，GTP）水解促進(jìn)tRNA 從核糖體的A 位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到P 位點(diǎn)，進(jìn)一步介導(dǎo)核糖體沿mRNA 運(yùn)動(dòng)，以完成肽鏈的延伸。eEF2K 能夠磷酸化eEF2 的蘇氨酸56 位點(diǎn)，使其失去與核糖體結(jié)合的能力，不能參與肽鏈的延長(zhǎng)，降低蛋白質(zhì)合成水平，導(dǎo)致突觸重塑受阻，影響學(xué)習(xí)和記憶功能［10］。有研究者通過(guò)敲除TG19959小鼠的eEF2K 基因，eEF2 的磷酸化水平降低，且eEF2K 的減少不影響雙轉(zhuǎn)基因小鼠的海馬體積與eEF2總水平，其蛋白質(zhì)合成增加，同時(shí)因腦內(nèi)eEF2K被抑制，認(rèn)知功能得到改善［11］。eEF2磷酸化引起的翻譯控制異常，會(huì)破壞細(xì)胞穩(wěn)定性，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡［12］。eEF2的磷酸化水平與樹(shù)突內(nèi)腦神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）合成密切相關(guān)，其可通過(guò)調(diào)節(jié)BDNF 表達(dá)改變樹(shù)突棘的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響突觸可塑性［13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組小鼠海馬區(qū)eEF2K、eEF2 磷酸化水平高于空白組，加減薯蕷丸干預(yù)后APP/PS1 小鼠海馬區(qū)eEF2K、eEF2 磷酸化水平下調(diào)，提示加減薯蕷丸可通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK，影響eEF2K/eEF2信號(hào)。

SYN 是突觸囊泡膜上的特定蛋白，參與突觸囊泡的轉(zhuǎn)運(yùn)、神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，且SYN 的表達(dá)與突觸的形成有密切關(guān)系。SYN-1 作為SYN 蛋白家族中的一員，具有調(diào)控突觸發(fā)育、神經(jīng)遞質(zhì)釋放等作用，其含量可作為檢測(cè)突觸可塑性的指標(biāo)。PSD-95 是一種位于突觸后膜胞質(zhì)一側(cè)的蛋白，包含PDZ-95/DLG-A/ZO-1（PDZ）結(jié)構(gòu)域、膜結(jié)合島苷酸激酶（GK）結(jié)構(gòu)域和Src（SH）同源結(jié)構(gòu)域［14］，其中PDZ 結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)的蛋白與蛋白的相互作用在調(diào)節(jié)AMPA 受體轉(zhuǎn)運(yùn)以及突觸可塑性中有重要作用［15］。PSD-95 對(duì)突觸可塑性的影響主要表現(xiàn)在調(diào)節(jié)樹(shù)突的發(fā)育過(guò)程和樹(shù)突棘的穩(wěn)定性，此外其還參與突觸內(nèi)部以及突觸之間的信號(hào)傳導(dǎo)［16］。本實(shí)驗(yàn)中中藥組小鼠海馬細(xì)胞的SYN-1、PSD-95 相對(duì)表達(dá)水平均升高，說(shuō)明加減薯蕷丸能夠改善APP/PS1小鼠海馬區(qū)突觸的可塑性。

AMPK 的異常磷酸化導(dǎo)致eEF2K/eEF2 信號(hào)激活，參與破壞突觸可塑性以及認(rèn)知功能的病理過(guò)程，與中醫(yī)脾腎虧虛、髓海失養(yǎng)的病機(jī)認(rèn)識(shí)相符。另有研究［17］表明，加減薯蕷丸方中制首烏、熟地黃、枸杞、黨參、茯苓、白術(shù)等健脾補(bǔ)腎藥物均可參與人體的能量代謝調(diào)節(jié)。

綜上所述，加減薯蕷丸可通過(guò)抑制AMPK 的過(guò)度磷酸化，影響下游eEF2K/eEF2 信號(hào)，增加突觸蛋白質(zhì)合成，調(diào)節(jié)突觸可塑性而發(fā)揮抗AD作用。