孫利娜 李進(jìn)華 甘四明 唐慶 李冰 劉雁玲 馬堅(jiān)煒 廖美蘭 黃欣 林茂

摘要：為分析品種遺傳多樣性和遺傳距離并構(gòu)建品種聚類圖和指紋圖譜，該研究從DNA模板濃度、引物濃度、退火溫度和循環(huán)次數(shù)等方面優(yōu)化了葉子花ISSRPCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序，利用11個(gè)ISSR引物對(duì)131個(gè)葉子花品種進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果表明：優(yōu)化的ISSRPCR反應(yīng)體系中DNA模板濃度為0.5 ng·μL1，引物濃度為0.5 μmol·L1，引物UBC813、UBC814、UBC815、UBC823、UBC824、UBC835、UBC840、UBC841、UBC843、UBC844和UBC876的最佳退火溫度分別為52.3、55.9、54.3、54.3、53.6、56.2、56.2、51.9、54.4、54、50 ℃，循環(huán)次數(shù)為32。用11個(gè)ISSR引物對(duì)131個(gè)葉子花品種擴(kuò)增出161條帶，其中多態(tài)性條帶156條，多態(tài)性比率為96.89%。單個(gè)引物的等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Neis基因多樣性指數(shù)和Shannons信息指數(shù)分別為1.86～2.00、1.33～1.68、0.21～0.39和0.34～0.57，平均值分別為1.969、1.478、0.294和0.447。引物UBC841的鑒別率最高（80.92%），可有效鑒別106個(gè)品種，與引物UBC876結(jié)合可將131個(gè)葉子花品種完全鑒別開，建立了各品種的指紋圖譜。葉子花品種的遺傳距離范圍為0.00～0.60，平均值為0.365，遺傳多樣性較低，在遺傳距離0.58處，131個(gè)品種分為6大類群，聚類分析顯示同一個(gè)種的品種大多聚在一類，但同一個(gè)種仍有品種未聚在一類或亞類、也有多個(gè)種的品種聚在一類。該研究較為準(zhǔn)確地揭示了葉子花種質(zhì)資源的遺傳多樣性，建立的指紋圖譜為葉子花品種登記、知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)以及品種鑒定提供了可靠技術(shù)和有效手段。

關(guān)鍵詞： 葉子花， ISSR標(biāo)記， 遺傳多樣性， 親緣關(guān)系， 指紋圖譜

中圖分類號(hào)：Q943

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：10003142（2021）02025115

Abstract：In this study， ISSRPCR reaction system was optimized from DNA template concentration， primer concentration， annealing temperature and cycle times， a total of 11 ISSR markers were used to amplify DNA samples of the 131 Bougainvillea cultivars， and the ISSR amplicons were detected based on a agarose gel electrophoresis method. Cultivars genetic diversity was analysed， their genetic distances were calculated， and the clustering analysis and fingerprint construction were performed for all the cultivars. The results were as follows： DNA template concentration was 0.5 ng·μL1， primer concentration was 0.5 μmol·L1， and the optimal annealing temperature of primers UBC813， UBC814， UBC815， UBC823， UBC824， UBC835， UBC840， UBC841， UBC843， UBC844 and UBC876 were 52.3， 55.9， 54.3， 54.3， 53.6， 56.2， 51.9， 54.4， 54， 50 ℃， respectively， the number of rings was 32. A total of161 bands were generated collectively by the 11 ISSR primers， and the 156 bands were polymorphic， and the polymorphic ratio was 96.89%. Allele number， effective allele number， Neis gene diversity index and Shannons information index ranged from 1.86 to 2.00， 1.33 to 1.68， 0.21 to 0.39 and 0.34 to 0.57， with an average of 1.969， 1.478， 0.294 and 0.447 per primer， respectively. Primer UBC841 had the highest identification rate（80.92%）， by which 106 cultivars were identified. A total of 131 cultivars were completely identified and their molecular fingerprints were constructed based on combination of UBC841 and UBC876. The genetic distance between 131 cultivars ranged from 0.00 to 0.60， with an average value of 0.365， and genetic diversity of 131 Bougainvillea cultivars was low， which were divided into six groups at 0.58 genetic distance. Clustering analysis indicates that majority of the cultivars within a species tend to fall in the same cluster， but some cultivars of the same species were grouped in different clusters or subclusters and certain cultivars from different species grouped in the same cluster. Genetic diversity of Bougainvillea germplasm resources was revealed accurately， the ISSRbased fingerprints of Bougainvillea cultivar provide reliable technique for cultivar registration and intellectual property protection as well as cultivar clarification in production practices.

Key words： Bougainvillea， ISSR marker， genitic diversity， genetic relationship， fingerprints

葉子花（Bougainvillea spectabilis）屬于瑞香目（Thymelaeceae）紫茉莉科（Nyctaginaceae）葉子花屬（Bougainvillea）植物，在熱帶和亞熱帶地區(qū)常用于園林綠化，在我國(guó)的栽培歷史有100多年。葉子花品種繁多，芽變類型豐富，我國(guó)引種選育的大約有200個(gè)品種，但它們的遺傳關(guān)系不明確，并且存在同物異名和同名異物現(xiàn)象。目前，關(guān)于葉子花的研究多集中在繁殖栽培（周群，2008;Moneruzzaman et al.，2010;孫利娜等，2017a）和理化研究方面（趙家昱等，2014;Figueroa et al.，2014;Marana et al.，2015;Chauhan et al.，2016），關(guān)于遺傳多樣性方面的研究不多，尤其是基于內(nèi)部簡(jiǎn)單重復(fù)序列（InterSimple Sequence Repeats， ISSR）分子標(biāo)記技術(shù)分析葉子花種質(zhì)資源親緣關(guān)系的研究，目前研究較少，并且分析的品種數(shù)量較少（李房英等，2011）。利用ISSR分子標(biāo)記鑒定大批量葉子花品種、構(gòu)建葉子花品種指紋圖譜的研究還未見報(bào)道。

ISSR分子標(biāo)記技術(shù)是在簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats， SSR）標(biāo)記基礎(chǔ)上建立起來的，在簡(jiǎn)單重復(fù)序列的一端加1～4個(gè)堿基設(shè)計(jì)引物，檢測(cè)兩個(gè)距離較近、方向相反的SSR之間的DNA序列多態(tài)性，原理與SSR相似（周蘭英，2014;邵珠田，2017）。ISSR標(biāo)記引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，多態(tài)性高于隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（random amplified polymorphic DNA， RAPD）和限制性內(nèi)切酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism， RFLP），易操作，所需DNA少，穩(wěn)定性強(qiáng)，重復(fù)性好，成本低且安全性高（譚華強(qiáng)，2014）。目前，ISSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用到親緣關(guān)系分析（李國(guó)帥，2014）、遺傳多樣性分析（王琳，2015;梁穎，2018）、指紋圖譜構(gòu)建（王璐靜，2016）、品種鑒別（Ali，2015;孫利娜等，2017b;Jedrzejczyk et al.，2018）、純度鑒定（管潔等，2013）、遺傳穩(wěn)定性分析（Reza et al.，2018）等領(lǐng)域。本研究以131個(gè)葉子花品種為研究對(duì)象，利用ISSR標(biāo)記分析它們的遺傳多樣性，確定它們的親緣關(guān)系，并進(jìn)行品種鑒定和指紋圖譜構(gòu)建，從而為葉子花種質(zhì)資源保存、知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)以及品種鑒定提供了可靠技術(shù)和有效手段。

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料參試的131個(gè)葉子花品種見表1，其中18個(gè)品種（序號(hào)1-18）保存于廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院園林花卉所，113個(gè)品種（序號(hào)19-131）采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品質(zhì)資源研究所。從生長(zhǎng)健壯、無病蟲害的植株上采集幼嫩葉片，迅速提取DNA，冷凍于-80 ℃冰箱備用。

1.1.2 引物的合成與篩選引物序列來自加拿大哥倫比亞大學(xué)公布的100個(gè)ISSR引物，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，從中篩選出多態(tài)性高，穩(wěn)定性強(qiáng)，重復(fù)性好的引物用于葉子花品種的親緣關(guān)系分析和指紋圖譜構(gòu)建。

1.2 方法

1.2.1 葉子花基因組DNA提取與檢測(cè)采用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）提取幼嫩葉片的DNA，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳與紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度。

1.2.2 葉子花ISSRPCR反應(yīng)體系的優(yōu)化參考李房英等（2010），將該實(shí)驗(yàn)的原初擴(kuò)增反應(yīng)體系定為20 μL，包括：2× Drem Taq mix 10 μL、ISSR Primer（10 umol·L1）1 μL、RNasefree water 8 μL、20～30 ng Template g DNA 1 μL。然后，對(duì)影響DNA擴(kuò)增的重要因素如模板DNA濃度（模板DNA為橙紅品種（Bougainvillea spectabilis ‘Auratus）和所用引物濃度設(shè)置梯度，模板DNA設(shè)400、200、50、20、10、5、0.2 ng·μL1共7個(gè)濃度，引物設(shè)40、20、15、10、4、2 pmol·μL1 共6個(gè)濃度，利用初篩獲得的擴(kuò)增效果較好的引物UBC815進(jìn)行最優(yōu)條件的篩選，以期獲得最佳反應(yīng)體系。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)在深圳珠海黑馬公司生產(chǎn)的HeMa9600基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行，PCR最初擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，38個(gè)循環(huán)后4 ℃保存。在此基礎(chǔ)上，對(duì)篩選出的11個(gè)引物設(shè)置退火溫度試驗(yàn)、對(duì)循環(huán)數(shù)進(jìn)行梯度設(shè)置（20個(gè)循環(huán)、23個(gè)循環(huán)、26個(gè)循環(huán)、29個(gè)循環(huán)、32個(gè)循環(huán)、35個(gè)循環(huán)、38個(gè)循環(huán)、42個(gè)循環(huán)）。

PCR產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖膠檢測(cè)，Goldview 染色，在電壓不超過5 V·cm1 的電場(chǎng)強(qiáng)度下，1×TAE 緩沖液中電泳90 min，JS1075凝膠成像系統(tǒng)上觀察成像。

1.2.3 ISSRPCR反應(yīng)體系驗(yàn)證以供試的其中任意18個(gè)葉子花品種的DNA為模版，用篩選出的多態(tài)性好的ISSR引物在最佳反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢驗(yàn)反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。

1.2.4 葉子花種質(zhì)資源ISSR擴(kuò)增數(shù)據(jù)處理與分析對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行人工讀帶，以片段大小為5 000 bp的Marker為標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)重復(fù)性好、清晰明亮的條帶，有條帶出現(xiàn)的位點(diǎn)記為 “1”，無條帶出現(xiàn)或模糊不清的位點(diǎn)記為“0”。將讀取的條帶信息轉(zhuǎn)化為0、1數(shù)據(jù)矩陣，利用PopGene32軟件對(duì)供試材料的多態(tài)性位點(diǎn)百分率（percentage of polymorphic loci， PPL）、觀測(cè)等位基因數(shù)（observation of allele number， Na）、有效等位基因數(shù)（number of effective alleles， Ne）、Neis基因多樣性指數(shù)（gene diversity index， H）、Shannons信息指數(shù)（Shannons information index， I）、遺傳距離（genetic distance， GD）及遺傳相似系數(shù)（coefficient of genetic similarity， GS）等遺傳參數(shù)進(jìn)行分析，并基于遺傳距離和遺傳相似系數(shù)在軟件NTSYSpc 2.1（Rohlf et al.， 2000）中采用非加權(quán)分組算術(shù)平均（unweighted pair group method with Arithmetic Mean，UPGMA）法對(duì)品種聚類分析，建立葉子花品種的DNA數(shù)字指紋圖譜。

2結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取與檢測(cè)

利用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒提取的葉子花基因組DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶清晰、明亮、無拖尾、樣孔內(nèi)無雜質(zhì)。圖1顯示了20個(gè)樣品DNA的電泳檢測(cè)結(jié)果。利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定所提DNA樣品的OD260/OD280值，結(jié)果OD260/OD280值都在1.8～2.0之間，濃度在200～400 ng·μL1。以上結(jié)果說明本研究采用的DNA提取法提取的葉子花DNA效果好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 葉子花ISSRPCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.2.1 DNA模板對(duì)PCR反應(yīng)的影響DNA模板濃度和質(zhì)量是影響ISSRPCR擴(kuò)增效果的重要因素，本實(shí)驗(yàn)利用引物UBC815擴(kuò)增DNA模板，擴(kuò)增產(chǎn)物（圖2）表明：模板濃度在0.01～50 ng· μL1 范圍內(nèi)均能擴(kuò)增出條帶，但在0.01 ng· μL1、0.05 ng· μL1、10 ng· μL1、50 ng·μL1濃度下擴(kuò)增的效果較差，0.1～2 ng·μL1濃度范圍內(nèi)差異不明顯。經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，在0.5 ng·μL1濃度時(shí)條帶較清晰、穩(wěn)定。

2.2.2 引物濃度對(duì)PCR反應(yīng)的影響引物濃度在0.1～2.0 μmol·L1范圍內(nèi)均能擴(kuò)增出條帶，但在0.1 μmol·L1、0.2 μmol·L1和2.0 μmol·L1濃度下擴(kuò)增的條帶較少、亮度低，濃度在0.5～1.0 μmol·L1時(shí)擴(kuò)增效果較好，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，最終確定后續(xù)試驗(yàn)所用引物濃度為0.5 μmol·L1，如圖3所示。

2.2.3 退火溫度對(duì)PCR反應(yīng)的影響本研究在最佳反應(yīng)體系基礎(chǔ)上對(duì)篩選出的11個(gè)引物進(jìn)行退火試驗(yàn)，確定了每個(gè)引物的最佳退火溫度，引物UBC813、UBC814、UBC815、UBC823、UBC824、UBC835、UBC840、UBC841、UBC843、UBC844和UBC876的最佳退火溫度分別為52.3、55.9、54.3、54.3、53.6、56.2、56.2、51.9、54.4、54、50 ℃。部分引物篩選退火溫度電泳圖如圖4、圖5和圖6所示。

2.2.4 循環(huán)次數(shù)對(duì)PCR反應(yīng)的影響增加循環(huán)數(shù)在一定程度上能夠提高產(chǎn)物量，但反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)使非特異擴(kuò)增產(chǎn)物增加，而且會(huì)受到各反應(yīng)成分的用量限制，如：隨著酶的擴(kuò)增能力下降，合成目標(biāo)片段的能力也隨之下降，因此，適宜的循環(huán)次數(shù)對(duì)于擴(kuò)增效果至關(guān)重要。

不同循環(huán)次數(shù)下的 ISSRPCR擴(kuò)增結(jié)果如圖7所示，模板在20～26個(gè)循環(huán)時(shí)均未擴(kuò)增出條帶，29～41個(gè)循環(huán)時(shí)均能擴(kuò)增出條帶，但在32個(gè)循環(huán)時(shí)可獲得明亮清晰的條帶，效果最好，如果再增加循環(huán)次數(shù)，條帶變化不大，但從節(jié)約時(shí)間和成本考慮，以32個(gè)循環(huán)為宜。

2.3 ISSRPCR體系穩(wěn)定性檢測(cè)

從毛葉葉子花（Bougainvillea spectabilis）品種、光葉葉子花（B. glabra）品種、巴特葉子花（Bougainvillea × buttiana）品種、秘魯葉子花（B. peruviana）品種和拉丁名不詳?shù)钠贩N（Bougainvillea sp.）中選出18個(gè)樣品用于檢測(cè)優(yōu)化的ISSRPCR反應(yīng)體系，用引物UBC824對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增（圖8），擴(kuò)增結(jié)果顯示本研究?jī)?yōu)化的葉子花ISSRPCR反應(yīng)體系穩(wěn)定性好，條帶清晰、重復(fù)性和多態(tài)性高，有豐富的特異性，可用于后續(xù)研究。

2.4 ISSR引物篩選

本文對(duì)100個(gè)ISSR引物進(jìn)行初篩、復(fù)篩，并確定最終篩選出的引物最佳退火溫度，共篩選出11個(gè)擴(kuò)增條帶多、條帶清晰、重復(fù)性好的ISSR引物，部分引物篩選結(jié)果如圖9、圖10所示。

2.5 葉子花種質(zhì)資源ISSR分析

2.5.1 ISSR引物多態(tài)性分析從100個(gè)ISSR引物中篩選出11個(gè)擴(kuò)增條帶多、條帶清晰、多態(tài)性高和重復(fù)性好的引物，對(duì)131個(gè)葉子花品種進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。11個(gè)引物共擴(kuò)增161條帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增14.6條，其中有156條帶具有多態(tài)性，多態(tài)性比率為96.89%。11個(gè)引物的擴(kuò)增條帶數(shù)在12～20之間，擴(kuò)增條帶數(shù)最多的是UBC841（20條），UBC814、UBC815和UBC843擴(kuò)增的條帶最少，均為12條。除引物UBC823、UBC835和UBC840之外，其余引物產(chǎn)生的多態(tài)性比例都達(dá)到100%，說明這11條引物在供試材料中的多態(tài)性較好。引物UBC815對(duì)部分樣品擴(kuò)增的電泳圖如圖11所示。

2.5.2 葉子花種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析將讀取的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為0、1矩陣，利用Popgene32軟件分析相關(guān)遺傳參數(shù)，分析結(jié)果見表4。單個(gè)引物的等位基因數(shù)為1.86～2.00，平均等位基因數(shù)1.969;有效等位基因數(shù)為1.33（UBC840）～1.68（UBC876），平均有效等位基因數(shù)為1.478;Neis基因多樣性指數(shù)為0.21（UBC840）～0.39（UBC841），平均值為0.294;Shannons信息指數(shù)為0.34（UBC823、UBC840）～0.57（UBC841），平均值為0.447。從4個(gè)遺傳參數(shù)看，引物UBC841和UBC876的各項(xiàng)值均較其他引物高，引物UBC840的有效等位基因數(shù)、Neis基因多樣性指數(shù)和Shannons信息指數(shù)均為最低。由以上結(jié)果可知，葉子花的遺傳多樣性不夠豐富。

2.5.3 葉子花種質(zhì)資源的UPGMA聚類分析基于11個(gè)ISSR引物計(jì)算的葉子花131個(gè)品種間的遺傳距離范圍為0.00～0.60，平均值為0.365，利用UPGMA法對(duì)131個(gè)葉子花品種聚類分析，建立聚類分析樹狀圖（圖12），從聚類圖可以看出，在遺傳距離0.58處，131個(gè)品種分為6大類群，即類群1、類群2、類群3、類群4、類群5和類群6。

類群1包含4個(gè)種的25個(gè)品種，其中13個(gè)光葉葉子花、4個(gè)毛葉葉子花、1個(gè)巴特葉子花、1個(gè)秘魯葉子花、6個(gè)拉丁名不詳?shù)钠贩N。在遺傳距離0.54處，類群1可再分為3個(gè)亞群，分別為亞群1-Ⅰ、亞群1-Ⅱ和亞群1-Ⅲ。亞群1-Ⅰ包括8個(gè)光葉葉子花品種（1號(hào)、3號(hào)、7號(hào)、19號(hào)、20號(hào)、21號(hào)、38號(hào)和39號(hào)）、2個(gè)毛葉葉子花品種（9號(hào)和11號(hào)）、3個(gè)拉丁名不詳?shù)钠贩N（126號(hào)、101號(hào)和127號(hào)）;亞群1-Ⅱ包括3個(gè)光葉葉子花品種（37號(hào)、40號(hào)和41號(hào)）、2個(gè)毛葉葉子花品種（40號(hào)和84號(hào)）、1個(gè)巴特葉子花品種（51號(hào)）、1個(gè)秘魯葉子花品種（76號(hào)）、3個(gè)拉丁名不詳?shù)钠贩N（92號(hào)、130號(hào)和131號(hào)）;亞群1-Ⅲ僅包括2個(gè)光葉葉子花品種（2號(hào)和4號(hào)）。

類群2共包含9個(gè)品種，其中5個(gè)光葉葉子花品種（25號(hào)、26號(hào)、27號(hào)、29號(hào)和28號(hào)）、1個(gè)巴特葉子花品種（45號(hào)）、3個(gè)拉丁名不詳?shù)钠贩N（110號(hào)、112號(hào)和111號(hào)）。類群3共包含86個(gè)品種，其中6個(gè)光葉葉子花品種、29個(gè)巴特葉子花品種、6個(gè)毛葉葉子花品種、9個(gè)秘魯葉子花品種、2個(gè)光葉×毛葉雜交種（B. × spectoglabra）和33個(gè)拉丁名不詳?shù)钠贩N。在遺傳距離0.56處，類群3可再分為4個(gè)亞群，分別為亞群3Ⅰ、亞群3Ⅱ、亞群3Ⅲ和亞群3Ⅳ。亞群3Ⅰ包括2個(gè)光葉葉子花品種（5號(hào)和6號(hào)）、5個(gè)巴特葉子花品種（18號(hào)、17號(hào)、14號(hào)、15號(hào)和16號(hào)）、2個(gè)毛葉葉子花品種（8號(hào)和10號(hào)）、2個(gè)光葉×毛葉雜交種（13號(hào)和12號(hào)）。亞群3Ⅱ僅有1個(gè)拉丁名不詳?shù)钠贩N（86號(hào)）。在遺傳距離0.53處，亞群3Ⅲ又可分為3ⅢA、3ⅢB、3ⅢC、3ⅢD、3ⅢE、3ⅢF和3ⅢG七個(gè)小類，其中：3ⅢA小類包括1個(gè)光葉葉子花品種（31號(hào)）、2個(gè)毛葉葉子花品種（81號(hào)和80號(hào)）、1個(gè)巴特葉子花品種（56號(hào)）、8個(gè)拉丁名不詳?shù)钠贩N（97號(hào)、118號(hào)、119號(hào)、120號(hào)、116號(hào)、96號(hào)、95號(hào)和115號(hào)）;3ⅢB小類包括1個(gè)光葉葉子花品種（36號(hào)）、1個(gè)毛葉葉子花品種（82號(hào)）、4個(gè)巴特葉子花品種（58號(hào)、59號(hào)、60號(hào)和53號(hào)）、3個(gè)秘魯葉子花品種（71號(hào)、72號(hào)和75號(hào)）、5個(gè)拉丁名不詳?shù)钠贩N（98號(hào)、99號(hào)、125號(hào)、113號(hào)和122號(hào)）;3ⅢC小類包括1個(gè)光葉葉子花品種（23號(hào)）、10個(gè)巴特葉子花品種（47號(hào)、49號(hào)、50號(hào)、42號(hào)、43號(hào)、48號(hào)、55號(hào)、57號(hào)、44號(hào)和46號(hào)）、3個(gè)秘魯葉子花品種（74號(hào)、69號(hào)和70號(hào)）、10個(gè)拉丁名不詳?shù)钠贩N（104號(hào)、102號(hào)、106號(hào)、85號(hào)、88號(hào)、114號(hào)、121號(hào)、91號(hào)、108號(hào)和107號(hào)）;3ⅢD小類包括7個(gè)巴特葉子花品種（61號(hào)、62號(hào)、63號(hào)、67號(hào)、64號(hào)、65號(hào)和66號(hào)）、1個(gè)秘魯葉子花品種（77號(hào)）、3個(gè)拉丁名不詳?shù)钠贩N（128號(hào)、129號(hào)和109號(hào)）;3ⅢE小類包括1個(gè)秘魯葉子花品種（73號(hào)）和1個(gè)毛葉葉子花品種（78號(hào)）;3ⅢF小類包括2個(gè)拉丁名不詳?shù)钠贩N（89號(hào)和90號(hào)）;3ⅢG小類包括1個(gè)巴特葉子花品種（54號(hào)）和3個(gè)拉丁2個(gè)拉丁名不詳?shù)钠贩N（87號(hào)和105號(hào)）。

根據(jù)聚類分析結(jié)果，131個(gè)品種均被聚類分開，說明供試品種之間具有一定的遺傳差異，ISSR標(biāo)記在葉子花種質(zhì)資源分析和品種鑒定研究方面具有較好的效果。

2.5.4 葉子花種質(zhì)資源的指紋圖譜構(gòu)建利用篩選出的11個(gè)ISSR引物對(duì)131個(gè)葉子花品種擴(kuò)增，可將131個(gè)樣品完全區(qū)分開，對(duì)電泳條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，在同一位點(diǎn)處，有條帶出現(xiàn)的標(biāo)記為“1”，無條帶出現(xiàn)的標(biāo)記為“0”，用0/1數(shù)據(jù)矩陣構(gòu)建131個(gè)葉子花品種的指紋圖譜（表5），11個(gè)引物中引物UBC841的鑒別率最高（80.92%），可有效鑒別106個(gè)品種，再與引物UBC876結(jié)合可將131個(gè)葉子花品種完全鑒別開。引物UBC841共擴(kuò)增出20個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，分別是2 500、2 200、2 000、1 600、1 500、1 450、1 100、1 000、950、850、750、700、650、550、450、400、350、150、250、2 900 bp。引物UBC876共擴(kuò)增出15個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，分別是2 800、2 500、2 000、1 800、1 500、1 350、1 150、1 050、900、850、750、650、550、3 100、500 bp。

3討論與結(jié)論

3.1 ISSR體系優(yōu)化

DNA模板量對(duì)PCR擴(kuò)增起著關(guān)鍵作用，本研究DNA模板濃度在0.01～50 ng·μL1范圍內(nèi)均能擴(kuò)增出條帶，但濃度過高或過低擴(kuò)增的條帶不清晰、彌散（王渭霞等，2010），經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，確定0.5 ng·μL1為最佳濃度，此濃度下擴(kuò)增的條帶最清晰、穩(wěn)定。引物濃度直接影響PCR擴(kuò)增結(jié)果，過高會(huì)增加錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增的幾率，且易使引物之間形成二聚體，濃度過低易導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物不足，影響擴(kuò)增效果（劉昕，2014）。PCR特異性亦受退火溫度的影響，而堿基組成及其濃度、引物長(zhǎng)度和靶基序列長(zhǎng)度都影響退火溫度，因此不同的引物其退火溫度不一樣（張茹，2014），本研究通過梯度試驗(yàn)，篩選出每個(gè)引物的最適退火溫度。循環(huán)次數(shù)對(duì)PCR擴(kuò)增具有決定性的影響，循環(huán)次數(shù)越多，產(chǎn)生非特異性產(chǎn)物的量也越多，一般控制在30～40次之間（馮富娟等，2004），本研究在32個(gè)循環(huán)時(shí)可獲得明亮清晰的條帶，效果最好。

3.2 ISSR標(biāo)記分析葉子花種質(zhì)資源遺傳多樣性與親緣關(guān)系

本研究在優(yōu)化的ISSRPCR反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上，基于11個(gè)多態(tài)性高、重復(fù)性好和穩(wěn)定性強(qiáng)的ISSR引物對(duì)131個(gè)葉子花品種進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出161條帶，其中有156條譜帶具有多態(tài)性，多態(tài)性比率為96.7%，較RAPD（多態(tài)性比率67.4%）（Richa et al.，2009）和同工酶（多態(tài)性比率75.5%）具有更為豐富的多態(tài)性（尹俊梅等，2001）。供試的葉子花Neis基因多樣性指數(shù)（均值0.29）和Shannons信息指數(shù)（均值0.45）都較低，并且遺傳相似系數(shù)高（0.64～0.95），這些數(shù)據(jù)均表明供試品種的遺傳多樣性不高，這一結(jié)果同黃彥晶（2010）（68份葉子花的遺傳相似系數(shù)為0.50～0.97）和Richa et al.（2009）（30份葉子花的遺傳相似系數(shù)為0.51～0.94）的研究結(jié)果相一致。葉子花遺傳多樣性不高的原因可能是葉子花特殊的花器官構(gòu)造以及花粉活力低使其雜交育種受到限制，導(dǎo)致無性繁殖成其主要繁殖方式，而長(zhǎng)期的無性繁殖使得葉子花的基因池變窄，遺傳相似性較高，親緣關(guān)系較近（黃彥晶，2010）。

供試葉子花品種間的遺傳距離為0.00～0.60，平均0.365，聚類分析中131個(gè)葉子花品種均可有效鑒定，表明ISSR對(duì)葉子花品種鑒定具有較高的可靠性。通過聚類，在遺傳距離0.58處，將所有葉子花品種聚為6大類，說明供試品種間存在差異，并且聚類呈現(xiàn)一定規(guī)律，如：每個(gè)種的大部分品種聚在一類，如光葉葉子花30個(gè)品種中18個(gè)（60.0%）聚在類群1和類群2（類群1和類群2屬于一大類，二者在遺傳距離0.56處被分成兩個(gè)類群），巴特葉子花31個(gè)品種中29個(gè)（93.5%）聚在類群3，秘魯葉子花11個(gè)品種中9個(gè)（81.8%）聚在類群3，2個(gè)雜交種12號(hào)和13號(hào)聚在亞群3Ⅰ。但是，同一個(gè)種仍有品種未聚在一類或亞類，如光葉葉子花品種綠葉淺紫和雪紫分別聚在類群4和類群5，白雪公主、小葉紫、新加坡白和新加坡粉聚在類群6，與其主要聚類的類群1和類群2分開聚類;1個(gè)巴特葉子花品種（金邊葉重粉）聚在了類群1，而巴特葉子花是光葉葉子花和秘魯葉子花的雜交種，該品種在擴(kuò)增中表現(xiàn)出光葉葉子花品種的特征，所以和光葉葉子花品種聚在一起。此外，也有多個(gè)種的品種聚在一類，如類群3包含了所有的種和雜種，可能原因是這些品種長(zhǎng)期生活在相似的環(huán)境下使其很多習(xí)性、性狀乃至控制表型的基因逐漸趨于一致。

與李房英等（2011）基于ISSR的68個(gè)品種的聚類結(jié)果比較，品種名相同的16個(gè)品種聚類關(guān)系相似，如光葉斑葉紫花、大花深紫、黃金葉和胭脂紅聚在亞群1Ⅰ（李房英等的品種依次為光葉斑葉紫花、黃金葉、小葉紫花和青葉白，聚為A類），皺葉深紅、櫻花、水紅、塔紫、金心和斑葉塔紫聚在亞群3Ⅰ（李房英等的品種依次為皺葉深紅、塔橙、重瓣白里透紅、塔紫、金心寶巾和斑葉塔紫，聚為B類）。但是，基于ISSR分子標(biāo)記的聚類結(jié)果與傳統(tǒng)的依據(jù)形態(tài)分類的結(jié)果并不嚴(yán)格一致，如30號(hào)綠葉淺紫屬于光葉葉子花，79號(hào)毛葉屬于毛葉葉子花，二者形態(tài)差異明顯，并且分別屬于不同的種，而在此聚類中二者卻被聚為一類，表明分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的表型分類仍存在一定差別。

通過本研究，一方面確定了葉子花品種間的親緣關(guān)系，另一方面成功地建立了葉子花的分子指紋，為今后葉子花種質(zhì)資源保存和品種鑒定提供了有用的信息。

參考文獻(xiàn)：

ALI QS， 2015. Identification and diversity analysis of Wintersweet （Chimonanthus praecox） crossing progenies using SSR molecular markers [D]. Wuhan： Huazhong Agricultural University.[ALI QS， 2015. 蠟梅的雜交F1代真實(shí)性鑒定及遺傳多樣性分析 [D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué).]

FENG FJ， WANG FY， LIU T， 2004. The influence factors of the ISSRPCR experiment system on Pinus koraiensis Sieb. et Zucc [J]. Chin Bull Bot， 21（3）： 326-331.[馮富娟， 王鳳友， 劉彤， 2004. 紅松ISSRPCR實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)影響因素 [J]. 植物學(xué)通報(bào)， 21（3）： 326-331.]

GUAN J， JIAO XH， WU JX， et al.， 2013. Identification of Asian lily hybrid F1 by using ISSR [J]. Mol Plant Breed， 11（3）： 415-420.[管潔， 焦雪輝， 吳錦娣， 等， 2013. 用ISSR分子標(biāo)記鑒定亞洲百合雜種F1代 [J]. 分子植物育種， 11（3）： 415-420.]

HUANG YJ， 2010. ISSR analysis of germplasm resources of Bougainvillea brasiliensis Raeusch [D]. Fuzhou： Fujian Agriculture & Forestry University.[黃彥晶， 2010. 三角梅（Bougainvillea brasiliensis Raeusch.）種質(zhì)資源的ISSR分析 [D]. 福州： 福建農(nóng)林大學(xué).]

JEDRZEJCZYK I， REWERS M， 2018. Genome size and ISSR markers for Mentha L. （Lamiaceae） genetic diversity assessment and species identification [J]. Ind Crop Prod， 120： 171-179.

LI FY， HUANG YJ， WU SH， et al.， 2011.ISSR analysis of germplasm resources of Bougainvillea spectabilis Willd [J]. Chin J Trop Crops， 32（9）： 1692-1696. [李房英， 黃彥晶， 吳少華， 等， 2011. 三角梅種質(zhì)資源的ISSR分析 [J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 32（9）： 1692-1696.]

LI GS， 2014. The research of ISSR on relationship of 5 species of wild Camellia of genus Camellia and fingerprint construction [D]. Changsha： Central South University of Forestry & Tecthology.[李國(guó)帥， 2014. 5種山茶屬野生油茶ISSR親緣關(guān)系研究及指紋圖譜的構(gòu)建 [D]. 長(zhǎng)沙： 中南林業(yè)科技大學(xué).]

LIANG Y， 2018. Genetic diversity analysis of Caragana Fabr. in Inner Mongolia desert area [D]. Huhehaote： Inner Mongolia University.[梁穎， 2018. 內(nèi)蒙古荒漠區(qū)錦雞兒遺傳多樣性分析 [D]. 呼和浩特： 內(nèi)蒙古大學(xué).]

LIU X， 2014. Genetic diversity analysis of ISSR and fingerprint preliminary construction of the genus Hemerocallis [D]. Changchun：Jilin Agricultural University. [劉昕，2014. 萱草屬植物遺傳多樣性的ISSR分析及指紋圖譜的初步構(gòu)建 [D]. 長(zhǎng)春： 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué).]

MONERUZZAMAN KM， HOSSAIN ABMS， NORMANIZA O， et al.， 2010. Effects of removal of young leaves and kinetin on inflorescence development and bract enlargement of Bougainvillea glabra var. “Elizabeth Angus” [J].Aust J Crop Sci， 4（7）： 467-473.

REZA RAJIMR， LOTFI M， TOHIDFAR M， et al.， 2018. Somatic embryogenesis of muskmelon （Cucumis melo L.） and genetic stability assessment of regenerants using flow cytometry and ISSR markers [J]. Protoplasma， 255（3）： 873-883.

RICHA S， SUDHIR S， ARVIND S， et al.， 2009. RAPDbased genetic relationships in different Bougainvillea cultivars [J]. Crop Breed Appl Biot， 9： 154-163.

ROHLF FJ， 2000. NTSYSPc： numerical taxonomy and multivariate analysis system version 2.1 [M]. New York： Applied Biostatistics Inc.

SHAO ZT， 2017.Studies on genetic relationship of culinary Rhubarb and official Rheum based on ISSR and SRAP markers [D]. Xinxiang： Henan Institute of Science and Technology.[邵珠田， 2017. 利用ISSR及SRAP分子標(biāo)記研究菜用大黃與藥用大黃的親緣關(guān)系 [D]. 新鄉(xiāng)： 河南科技學(xué)院.]

SUN LN， LIN M， LI JH， et al.， 2017a. Callus induction of Bougainvillea spectabilis cultivars [J]. J W Chin For Sci， 46（2）： 157-160.[孫利娜， 林茂， 李進(jìn)華， 等， 2017a. 不同品種葉子花愈傷組織的誘導(dǎo) [J]. 西部林業(yè)科學(xué)， 46（2）： 157-160.]

SUN LN， LIN M， WANG HX， et al.， 2017b. Identification of Bougainvillea spectabilis radiation mutant based on ISSR markers [J]. Guangxi For Sci， 46（3）： 276-279. [孫利娜， 林茂， 王華新， 等， 2017b. 運(yùn)用ISSR標(biāo)記鑒定葉子花輻射突變體 [J]. 廣西林業(yè)科學(xué)， 46（3）： 276-279.]

SUN LN， WANG HX， GONG JY， et al.， 2013.Cutting propagation of Bougainvillea glabra and its effecting factors [J]. Guangxi For Sci， 42（2）： 183-185. [孫利娜， 王華新， 龔建英， 等， 2013. 葉子花扦插育苗影響因素分析 [J]. 廣西林業(yè)科學(xué)， 42（2）： 183-185.]

TAN HQ， 2014. Genetic diversity analysis and varietal idengtification among 68 Chinese asparagus bean （Vigna unguiculata ssp. sesquipedialis） cultivars based on RAPD， ISSR and morphological markers [D]. Yaan： Sichuan Agricultural University.[譚華強(qiáng)， 2014. 利用形態(tài)學(xué)和RAPD、ISSR分子標(biāo)記分析68個(gè)豇豆品種的親緣關(guān)系 [D]. 雅安： 四川農(nóng)業(yè)大學(xué).]

WANG L， 2015. Analysis on genetic diversity of? Forsythia suspensa by ISSR marker [D]. Taiyuan： Shanxi Agricultural University.[王琳， 2015. 基于ISSR的連翹遺傳多樣性研究 [D]. 太原： 山西農(nóng)業(yè)大學(xué).]

WANG LJ， 2016. A study on the genetic diversity and the identification of DNA barcoding of medicinal plants Rosa L.[D]. Zhengzhou： Henan Agricultural University.[王璐靜， 2016. 薔薇屬（Rosa L.）藥用植物的遺傳多樣性及DNA條形碼鑒定研究 [D]. 鄭州： 河南農(nóng)業(yè)大學(xué).]

WANG WX， LAI FX， HONG LY， et al.， 2010.Effects of DNA concentrations and storage conditions on PCR detection of transgenic rice[J]. J Agric Biotechnol， 18（5）： 846-852.[王渭霞， 賴?guó)P香， 洪利英， 等， 2010. 轉(zhuǎn)基因水稻DNA樣品濃度以及存放條件對(duì)PCR定性檢測(cè)的影響 [J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)， 18（5）： 846-852.]

YIN JM， OU WJ， ZHANG X， 2001.Protein analysis of genetic relationship of Bougainvillea cultivars [J]. Chin J Trop Crops， 22（4）： 61-66.[尹俊梅， 歐文軍， 張欣， 2001. 三角梅品種間親緣關(guān)系的蛋白質(zhì)分析 [J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 22（4）： 61-66.]

ZHANG R， 2014. Analysis on genetic diversity of Radix Astragali by ISSR marker[D]. Taiyuan： Shanxi Agricultural University.[張茹， 2014. 藥用黃芪ISSR遺傳多樣性分析 [D]. 太原： 山西農(nóng)業(yè)大學(xué).]

ZHOU LY， 2014. ISSR analysis on the diversityof oiltea Camellia germplasm [D]. Changsha： Hunan Normal University.[周蘭英， 2014. 油茶種質(zhì)資源多樣性的分析 [D]. 長(zhǎng)沙： 湖南師范大學(xué).]

ZHOU Q， 2008.Research on germplasm resource and propagational technique of Bougainvillea L. in China[J].Chin Agric Sci Bull， 24（12）： 321-324.[周群， 2008. 中國(guó)葉子花屬植物種質(zhì)資源及其繁殖技術(shù)研究 [J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 24（12）： 321-324.]

（責(zé)任編輯李莉）