劉奇燕 丁顯萍 張萍

摘 要：該研究?jī)?yōu)化了SDS的DNA提取方法，采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)建立了一種準(zhǔn)確、穩(wěn)定、快捷、規(guī)?；碾s交水稻種子純度檢測(cè)流程，為大規(guī)模雜交水稻種子純度檢測(cè)提供了高效簡(jiǎn)便的方法。

關(guān)鍵詞：純度鑒定;水稻品種;SSR分子標(biāo)記

中圖分類號(hào) S511? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2021）05-0009-02

種子質(zhì)量不僅是決定農(nóng)作物收成的關(guān)鍵，也是種業(yè)企業(yè)在競(jìng)爭(zhēng)中處于不敗之地的重要因素，是種業(yè)企業(yè)生存的根本。雜交種子純度是種子質(zhì)量檢測(cè)的重要指標(biāo)之一，加強(qiáng)種子純度檢測(cè)對(duì)于水稻生產(chǎn)銷售至關(guān)重要。種子純度檢測(cè)主要有海南鑒定、正季種植鑒定以及SSR分子標(biāo)記鑒定方法。海南鑒定具有相對(duì)準(zhǔn)確、時(shí)間相對(duì)提前的優(yōu)點(diǎn)，但海南冬季屬短日照低溫條件，感光類型及兩系不育系均表現(xiàn)為正常結(jié)實(shí)，對(duì)雜交水稻尤其是兩系雜交水稻種子純度的鑒定結(jié)果往往失真。正季鑒定結(jié)果與大田生產(chǎn)實(shí)際吻合度高的優(yōu)點(diǎn)，但時(shí)間明顯滯后。從歷年發(fā)生的重大種子純度事故來看，絕大多數(shù)是在得知種子純度不合格之前，種子已經(jīng)銷售到千家萬戶無法召回，從而釀成了無法挽回的損失。SSR分子標(biāo)記是從DNA水平上檢測(cè)生物個(gè)體差異，具有多態(tài)性高、譜帶擴(kuò)增穩(wěn)定、技術(shù)成熟、檢測(cè)時(shí)間短、不受環(huán)境影響等特點(diǎn)，在雜交水稻種子純度鑒定中得到了越來越廣泛的應(yīng)用。為此，本研究建立了一種準(zhǔn)確、穩(wěn)定、快捷、規(guī)?；瘷z測(cè)的流程，為大量檢測(cè)雜交水稻種子純度提供高效簡(jiǎn)便的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 48對(duì)引物，Taq DNA聚合酶，DNTP，十二烷基磺酸鈉，10%SDS，2MTris-HCI，250mMEDTA，乙酸銨，40%聚丙烯酰胺凝膠，5*TBE，過硫酸銨，四甲基乙二胺，甲醛，冰醋酸，無水乙醇，氫氧化鈉，硝酸銀，瓊脂糖，溴酚藍(lán)等化學(xué)試劑。

1.1.2 主要儀器 研磨儀，高速冷凍離心機(jī)，水浴鍋，PCR擴(kuò)增儀，電泳儀，電泳槽，搖床，膠片觀察燈，通風(fēng)櫥，超低溫冰箱，微波爐，電子天平等儀器。

1.2 方法

1.2.1 種子發(fā)芽 每個(gè)樣品隨機(jī)取300粒種子，均勻置于發(fā)芽床上，放在30℃的發(fā)芽箱6d左右。

1.2.2 DNA提取（一種優(yōu)化的SDS提取法） 隨機(jī)選取水稻幼苗用鑷子放入96孔深孔板中，每個(gè)單株在1～5cm，將磁珠放入每個(gè)孔中，蓋上軟蓋，做好標(biāo)記，放入超低溫冰箱冷凍1h左右。冷凍結(jié)束放在研磨儀研磨1min30s，用高速冷凍離心機(jī)離心2min。每個(gè)孔中加入280μL的65℃提取液，再用研磨儀研磨30s，離心機(jī)離心2min。加入150μL的乙酸銨溶液，充分搖勻，4000r、4℃冷凍離心機(jī)離心15min。將上清液200μL轉(zhuǎn)入另一深孔板中，加入400μL的無水乙醇。4000r、4℃冷凍離心機(jī)離心15min，棄上清，自然條件下干燥或用吹風(fēng)機(jī)吹干，加入100μL的雙蒸水，放置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物篩選 采用中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1433—2014《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程SSR標(biāo)記法》附錄C中推薦的48對(duì)SSR引物，對(duì)雜交種進(jìn)行多態(tài)性篩選。選用在雜交種中具有較好多態(tài)性的SSR引物。

1.2.4 PCR擴(kuò)增檢測(cè) 從篩選得到的引物中隨機(jī)挑選2對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用11μL的PCR反應(yīng)體系，即在PCR反應(yīng)管中分別加入樣品DNA提取液（2.0μL）、10×Buffer（1.0μL）、2.5mMNTP（0.8μL）、25mMMgcl2（0.6μL）正向引物（1μL），反向引物（1μL）、ddH2O（4.35μL）和TaqDNA聚合酶（0.25μL）。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋合?4℃預(yù)變性2min;再94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán);72℃延伸8min。反應(yīng)完成后，加入溴酚藍(lán)，置4°C環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 PCR產(chǎn)物檢測(cè) 擴(kuò)增產(chǎn)物采用3%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，使用104孔密型點(diǎn)樣梳一次性點(diǎn)樣96孔PCR板上的96個(gè)樣品;在350V、400mA條件下，電泳40min，染色、顯影。

2 結(jié)果與分析

2.1 判別方法 每個(gè)品種用2對(duì)引物擴(kuò)增，分別做96粒，點(diǎn)樣時(shí)一一對(duì)應(yīng)。如果2對(duì)引物都在同一個(gè)位置上檢測(cè)到雜株，則判斷為1個(gè)雜株;如果2對(duì)引物分別在不同位置檢測(cè)到雜株，檢測(cè)到幾個(gè)雜株則判斷為幾個(gè)個(gè)雜株。如果其中1對(duì)引物在某個(gè)位置上檢測(cè)到親本帶，而另一對(duì)引物在這個(gè)位置上沒有檢測(cè)到親本帶，則判斷為雜株;如果2對(duì)引物都在這個(gè)位置上檢測(cè)到親本帶且都是母本帶或者都是父本帶，則判斷為雜母本或者父本。

2.2 純度判定 圖1為品種A在標(biāo)記RM336和標(biāo)記RM208第6位置上是都是母本帶，則判斷品種A雜1粒母本帶，純度為99.0%。2為品種B在標(biāo)記RM71上第21位置上是母本帶;在標(biāo)記RM339上12位置上是母本帶，27位置上是母本帶，43位置上是雜株，則判斷品種B有4個(gè)雜株，純度為95.8%。

3 討論

在常規(guī)的SSR分子標(biāo)記檢測(cè)程序中，DNA提取通常采用的是CTAB法、沒有優(yōu)化的SDS法、快提法和磁珠法。CTAB法和普通的SDS法需要加氯仿和異戊醇，氣味很難聞，對(duì)人體有害、不安全，快提法DNA的質(zhì)量不高，且保存時(shí)間很短，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)電泳有限制，如毛細(xì)管電泳、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的檢測(cè)效果不好。磁珠法提取成本高，試劑盒比較貴。本研究?jī)?yōu)化的SDS法，無需加氯仿和異戊醇，比較安全，提取的DNA質(zhì)量高，保存時(shí)間很長，適合任何電泳，成本低，經(jīng)濟(jì)適用。并且用深孔板提取，能夠高通量提取，特別是需要大量提取水稻DNA時(shí)，優(yōu)勢(shì)明顯。

引物選擇上原則是選擇雜合率高，在其雙親中具有共顯性的多態(tài)性，區(qū)分異品種能力強(qiáng)，多態(tài)性好，擴(kuò)增效果好，即可用于雜交種子的純度檢測(cè)。但不同SSR引物的雜株辨別率的差距較大，單對(duì)SSR引物檢測(cè)雜株類型構(gòu)成復(fù)雜的樣品時(shí)可靠性較低。所以應(yīng)盡可能了解受檢樣品的生產(chǎn)背景和雜株類型，最好與田間鑒定相結(jié)合，選出具有針對(duì)性的2對(duì)或多對(duì)引物供檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)

[1]周桂林，劉奇燕，范家萌，等.SSR分子標(biāo)記高效選擇抗稻瘟病雙基因Pi-1、Pi-2的技術(shù)體系[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017（7）：123-125.

[2]李婧婧，付求來，戴繼俠，等.一種快速鑒定雜交水稻種子純度的方法[J].種子，2018（4）：125-126，131.

（責(zé)編：張宏民）