師銘咸，李 琳，范宏剛

(東北農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江哈爾濱 150030)

隨著社會的發(fā)展和工作節(jié)奏的不斷加快，越來越多的人處于長期壓力之下，由此導致的慢性應激相關疾病正逐漸引起科學家的廣泛關注[1]。此外，在動物的轉運和飼養(yǎng)中，也存在大量慢性應激現象，其中，運輸應激和熱應激比較常見。長途運輸應激使得畜禽長時間處于應激狀態(tài)，導致應激畜禽生長發(fā)育遲緩，免疫功能及生產性能下降，嚴重的可導致組織器官損傷，甚至個體死亡[2]；而長期高溫環(huán)境下飼養(yǎng)，會使畜禽體溫異常，引起熱應激，表現為精神萎靡、食欲不振等[3]，嚴重影響?zhàn)B殖業(yè)經濟效益。

本文簡述了慢性應激和脾臟及其相互作用，慢性應激狀態(tài)下動物脾臟的免疫機制研究，并討論了目前研究面臨的問題和不足，以及對未來研究方向進行了合理分析和展望，以期能對慢性應激模型中脾臟的相關研究提供理論支持。

1 慢性應激和脾臟及其相互作用

研究表明，應激能夠顯著影響機體免疫能力，影響人和動物的生活質量，以及諸多疾病的發(fā)展進程；脾臟是重要的免疫器官，能夠調節(jié)機體對應激的抵抗能力。目前，兩者的相互作用研究已逐漸成為比較醫(yī)學和動物生產的熱點研究問題。因此，本部分從慢性應激及相關實驗模型、脾臟的組成和功能、慢性應激和脾臟的相互作用三部分，進行簡要概述。

1.1 慢性應激及相關實驗模型

應激(stress)指機體在各種內外環(huán)境因素及社會心理因素刺激下，產生的非特異性全身性反應，主要分為急性應激和慢性應激。其中，刺激持續(xù)時間較長，且引起機體反應持續(xù)時間也較長的應激類型稱為慢性應激(Chronic stress)。慢性應激通過持續(xù)釋放神經內分泌激素，引起機體病理性改變，涉及心血管疾病[1]、肥胖[4]、癌癥[5]、免疫紊亂[6]，以及精神類疾病，如重度抑郁癥、雙相情感障礙和焦慮癥等[7]。目前，慢性應激模型主要分為4類，即習得性無助慢性應激模型、行為絕望慢性應激模型、社交失敗慢性應激模型以及慢性不可預知應激模型[8]。

習得性無助慢性應激模型，是將動物暴露在不可避免但又不可控的應激環(huán)境下，動物表現出無助、消極、類似抑郁的狀態(tài)。近年來，科研人員通過將動物長時間置于單一應激源下,如足部電擊[9]、寒冷環(huán)境[10]、束縛固定[11-12]、噪聲[13]等，使動物出現無助的狀態(tài)。應激動物常表現為體重減輕，性行為減少，促腎上腺皮質激素釋放激素和皮質酮水平升高[14]。

行為絕望慢性應激動物模型，包括強迫游泳試驗[15]和懸尾試驗[16]。強迫游泳試驗，是將實驗動物置于一個局限的環(huán)境中，動物在該環(huán)境中拼命掙扎試圖逃跑又無法逃脫，從而提供了一個無可回避的壓迫環(huán)境，一段時間后，動物表現出典型的絕望狀態(tài)。懸尾試驗，利用小鼠懸尾后企圖逃脫但又無法逃脫，從而放棄掙扎，進入特有的不動狀態(tài)，試驗過程中記錄動物不動時間來反映無助、絕望狀態(tài)。

社交失敗慢性應激模型，這種“居住者-闖入者”模式是嚙齒動物特有的，它利用同一物種成員之間的社會沖突來產生心理情感壓力，能夠非常有效地模擬人類在社會活動中所表現的社交困難。將1只老鼠(稱為闖入者)引入1只常駐雄性老鼠(稱為居住者)的家庭籠子中，持續(xù)數天,記錄居住者與闖入老鼠對抗的相關行為[17]，但是這種模型具有性別局限性，只發(fā)生在雄性大鼠中，因為雌性大鼠不會發(fā)生此類爭斗。這種應激模型中的大鼠常表現為社會交往減少和快感缺乏[18]。

慢性不可預知應激模型，每天隨機將嚙齒動物置于不同的應激源下，包括足部電擊、束縛、晝夜節(jié)律變化、噪聲等，制造慢性不可預知應激模型[19]，這種造模方式能夠更好地模擬人類長期處于復雜的生活環(huán)境中所表現出的壓力現象，與人們實際生活中的壓力狀況更接近[20]。應激動物血漿皮質醇水平升高、糖水偏好降低[21]，運動能力及社會交往能力下降、探索行為能力下降、侵犯攻擊能力缺陷、性行為能力下降[22]。

4類模型僅限于造模方式不同，造模成功的判定標準是一致的，應激動物通常表現為快感缺乏、對獎賞反應能力下降、體重減輕、攝食攝水減少、自主活動減少、興趣減退等狀態(tài)。行為學上，一般通過曠場試驗和糖水偏好試驗來判定造模是否成功[23]。同時，慢性應激造模成功的動物，HPA軸異常激活，生理指標上可見多巴胺、五羥色胺水平下降，皮質醇水平升高。其中，曠場試驗，是評價實驗動物在新奇環(huán)境中自主行為、探究行為與緊張度的一種方法，以實驗動物在新奇環(huán)境之中某些行為的發(fā)生頻率和持續(xù)時間等，反映實驗動物在陌生環(huán)境中的自主行為與探究行為，以尿便次數反應其緊張度，慢性應激動物在曠場實驗中，表現為運動能力減弱、探索行為減少、緊張度增加。糖水偏好試驗，是通過測量一定時間內飲水瓶中水量的消耗，計算每只大鼠的糖水偏好百分比，用來評價動物快感缺失的程度，快感缺失是慢性應激動物模型造模成功的標志，慢性應激動物在糖水偏好試驗中，常表現為糖水偏好百分比降低[24]。

1.2 脾臟的組成及功能

脾臟含有大量的淋巴細胞和巨噬細胞，其免疫細胞總數約占全身總量的25%，是機體行使細胞免疫和體液免疫的最大免疫器官。脾臟實質由邊緣區(qū)、紅髓和白髓組成。當血液中出現病菌和原蟲等異物時，邊緣區(qū)首先接觸抗原并引起免疫應答，紅髓中的吞噬細胞和淋巴細胞將異體抗原吞噬，白髓發(fā)揮特異性免疫應答功能[25]。脾臟還可以通過產生免疫球蛋白和補體等物質，增強免疫作用效果。

此外，脾臟還發(fā)揮機體重要的儲血和輸血功能，當機體安靜時，血液回流脾臟，脾臟行使儲血功能；當機體處于運動、失血、缺氧等應激狀態(tài)時，血液流出脾臟，血容量增加，脾臟行使輸血功能。同時，脾臟也可過濾血液中的異物、病菌及衰老死亡的細胞。

1.3 慢性應激與脾臟

研究表明，動物發(fā)生慢性應激后，免疫功能被抑制，機體抵抗力減弱，從而引發(fā)涉及炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡和臟器指數等病理性異常和動物行為學變化。

在慢性冷應激中，Balb/c小鼠脾臟內巨噬細胞表型發(fā)生變化，吞噬能力減弱，并刺激脾臟細胞產生調節(jié)細胞因子誘發(fā)免疫抑制，證實慢性冷應激通過調節(jié)巨噬細胞功能，使小鼠處于免疫抑制狀態(tài)[10]。慢性應激除影響脾臟內巨噬細胞形態(tài)功能外，對其他免疫器官及其內免疫細胞同樣具有顯著作用。據報道，慢性應激大鼠胸腺、腋窩淋巴結重量減輕，胸腺、腋窩淋巴結內淋巴細胞計數和脾臟白髓島數減少，脾臟細胞、胸腺細胞和淋巴細胞凋亡指數升高，且應激對淋巴器官的影響程度隨暴露時間的延長而加重[26]。

在不同的慢性應激模型中，表現出相似的機體免疫抑制現象。長期噪音環(huán)境可引起人生理、心理和行為上的變化。為此，Zheng K C等[13]通過將Balb/c小鼠持續(xù)4周暴露于90分貝(dB)環(huán)境中，模擬慢性噪聲應激，發(fā)現小鼠脾臟淋巴細胞計數降低，脾臟CD4+T細胞和血清IgG減少，說明慢性噪聲應激可抑制機體細胞免疫和體液免疫。

在慢性冷應激中，鵪鶉脾臟內環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、前列腺素E合成酶(prostaglandin E synthase,PTGES)、核轉錄因子kappa B(nuclear factor-kappa B,NF-κB)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的基因表達量增加，谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和一氧化氮(nitric oxide,NO)含量顯著降低，丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量顯著增加，表明慢性冷應激可引起鵪鶉脾臟組織炎癥損傷和氧化應激[27]。

Van der Staay等[11]通過對比長期拴系和散養(yǎng)母豬體內相關激素水平和動物行為學結果，發(fā)現不同組間母豬脾臟重量無明顯變化，拴系組血漿皮質醇水平升高，并表現出抑郁樣癥狀，表明長期束縛應激可紊亂體內激素水平，并導致精神行為異常。

2 慢性應激模型中脾臟的免疫機制研究

當前，研究者主要通過在蛋白水平上篩選核心信號通路及靶點，以及在細胞水平上探究淋巴細胞及其亞群的生物學特性等角度，闡述慢性應激對動物脾臟的免疫學作用機制，這將為日后的精準作用、持續(xù)監(jiān)測和治療方案的制定，提供一定的理論和實踐依據。

Hu D等[28]通過檢測慢性束縛應激小鼠脾臟內白細胞介素-10(interleukin-10,IL-10)和信號傳導與轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)含量，以及血清內IL-10水平，發(fā)現IL-10/STAT3信號通路被顯著激活；阻斷IL-10/STAT3通路后，可顯著改善淋巴細胞凋亡，恢復T細胞輔助因子1和T細胞輔助因子2(Th1和Th2)的失衡水平，并促進白細胞介素-12(IL-12)的生成。說明IL-10/STAT3信號通路為慢性應激誘導免疫抑制的重要靶點。其中，Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)和p38絲裂原活化蛋白酶(p38 mitogen activated protease,p38 MAPK)被證實在此通路的激活中起關鍵作用。除IL-10/STAT3信號通路外，Zhang H J等[29]發(fā)現慢性束縛應激小鼠脾臟內轉化生長因子β1/白細胞抑制因子2/3/叉頭框蛋白p3(Foxp3)(TGF-β1/Smad2/3/Foxp3)軸被顯著激活。通過抑制TGF-β1/Smad2/3/Foxp3軸或p38蛋白后，可降低淋巴細胞凋亡，下調凋亡相關蛋白的表達和減輕T調節(jié)細胞的分化紊亂。說明TGF-β1/Smad2/3/Foxp3通路涉及慢性應激誘導的免疫抑制過程。同時，Toll樣受體9(TLR9)和p38 MAPK為激活此通路的核心功能蛋白。此外，Li H等[30]對比研究了慢性束縛應激對TLR9基因敲除型和野生型小鼠的作用，發(fā)現與野生型相比，TLR9缺失型血漿皮質酮水平顯著降低，未表現Th1和Th2的水平失衡結果。說明TLR9的缺失抑制了慢性應激誘導的免疫抑制過程。以上研究表明，IL-10/STAT3通路和TGF-β1/Smad2/3/Foxp3軸可能在慢性應激狀態(tài)下脾臟的免疫應答中扮演重要角色，其中細胞表面受體TLR4和TLR9以及p38 MAPK蛋白在相應信號通路的激活中起到核心作用。

研究表明，在慢性應激刺激下，B細胞上的2型受體(CRHR2)可與過量釋放的促腎上腺皮質激素釋放激素(CRH)結合，從而激活諸多信號傳導途徑(如p38 MAPK等)，并調節(jié)B細胞活力，發(fā)揮相應的免疫調節(jié)功能[31]。脾臟除含有大量B淋巴細胞外，還含有眾多的T淋巴細胞，不僅B淋巴細胞在慢性應激的動物體內發(fā)揮免疫調節(jié)功能，T淋巴細胞及其亞群也同樣扮演著重要角色。據報道，研究人員利用流式細胞術，研究慢性束縛應激小鼠脾臟內CD4+CD25+的調節(jié)性T細胞(Tregs)、CD4+CD25-的效應性T細胞(Teffs)和CD4-抗原遞呈細胞(antigen presenting cells,APCs)的生物特性，發(fā)現慢性束縛應激可顯著增加Tregs比例，增強Tregs抑制活性，減弱Teffs增殖活性，降低APCs飼養(yǎng)活性，推測Tregs比例和活性的增加，協(xié)同Teffs和APCs的活性降低，可能是造成慢性束縛應激動物免疫功能障礙的主要原因[32]。在相關研究中，專家通過建立小鼠慢性應激模型，監(jiān)測小鼠行為學和脾臟內T淋巴細胞及其亞群的變化，發(fā)現Tregs的比例與蔗糖偏好程度呈負相關，Th17細胞的增殖與蔗糖偏好程度呈正相關，血清TGF-β水平出現升高，據此，研究人員推測慢性不可預知應激小鼠的行為改變，可能與Tregs和Th17細胞的失衡密切相關，其中TGF-β可能是其中關鍵細胞調節(jié)因子[33]。

3 展望

除前面已概述的慢性應激與脾臟的相關作用機制外，在人和動物體中，慢性應激很多時候會作為其他疾病的誘發(fā)因素、聯合因素、甚至進展因素，于是，在動物實驗模型中出現了很多復合疾病模型，如肺挫傷/失血性休克(LCHS)合并慢性應激模型[34]，慢性不可預知環(huán)境壓力與糖尿病模型[35]等，這使得研究模型更貼近臨床實際。

脾臟是機體重要的免疫器官，慢性應激可引起機體免疫抑制，但慢性應激與脾臟相關研究較少，致病機理尚未明確，因此，機制的研究仍是目前研究的主要方向。與此同時，可以從其他實質性臟器慢性應激模型研究中汲取思路以及優(yōu)化疾病模型等角度同時開展試驗，擴展對慢性應激與脾臟研究的廣度和深度，為疾病治療提供更多的理論依據。