李玉琴 汪 悅 蔣林樹* 熊本海

(1.北京農(nóng)學院動物科學技術(shù)學院，奶牛營養(yǎng)學北京市重點實驗室，北京 102206；2.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193)

圍產(chǎn)期是奶牛養(yǎng)殖過程中最關(guān)鍵的飼養(yǎng)階段。這一時期由于營養(yǎng)、生理和代謝上的應(yīng)激，使動物機體抗氧化功能降低，導致自由基產(chǎn)生和清除失衡，產(chǎn)生氧化應(yīng)激[1]。持續(xù)的氧化應(yīng)激可通過產(chǎn)生大量的氧自由基來攻擊細胞，誘導脂質(zhì)過氧化，并引起細胞膜結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，造成生產(chǎn)性能、機體免疫功能和炎癥應(yīng)答能力下降，對病原微生物的易感性增強，進而引起乳腺疾病，如奶牛乳房炎[2]，給生產(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失[3]，而且影響奶牛的健康狀況。金銀花作為一種藥用價值極高的植物而被廣泛用作食品、保健飲料添加劑[4]，其富含黃酮類、揮發(fā)油類、有機酸、三萜皂類化合物等60多種活性成分[5]，具有抗癌、抗菌、抗氧化、抗炎、保肝等功效[6]。研究表明，金銀花提取物能夠通過調(diào)控奶牛瘤胃微生物的發(fā)酵模式[7]，緩解奶牛熱應(yīng)激[8]，調(diào)節(jié)圍產(chǎn)期奶牛炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激[9]，一定程度上促進乳腺上皮細胞(mammary epithelial cells，MEC)增殖并提高泌乳能力[10]，且不產(chǎn)生耐藥性、無殘留，在預防圍產(chǎn)期奶牛乳房炎發(fā)生和促進奶牛健康養(yǎng)殖上有廣闊的應(yīng)用前景。

1 圍產(chǎn)期奶牛乳房炎的致病機制

1.1 奶牛體內(nèi)自由基穩(wěn)態(tài)失衡引起的氧化應(yīng)激-免疫失衡-炎癥反應(yīng)聯(lián)動效應(yīng)

圍產(chǎn)期奶牛經(jīng)歷了從乳腺萎縮到發(fā)育、從胎兒的成長到分娩以及從干奶到乳汁的合成和分泌的生理變化[11]，期間奶牛體內(nèi)自由基穩(wěn)態(tài)失衡引起的氧化應(yīng)激-免疫失衡-炎癥反應(yīng)聯(lián)動效應(yīng)發(fā)生動態(tài)變化是導致奶牛發(fā)生炎癥性疾病乳房炎的主要因素[12]。在圍產(chǎn)后期，為了滿足胎兒生長和哺乳所需的能量和其他營養(yǎng)物質(zhì)，奶牛的代謝需求和氧氣需求顯著增加，機體在進行營養(yǎng)物分配的協(xié)調(diào)轉(zhuǎn)換時導致奶牛能量負平衡及過量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)富集[13]，過量的ROS蓄積于細胞內(nèi)，和機體抗氧化防御能力之間的不平衡使奶牛處于氧化應(yīng)激[14]。長時間氧化應(yīng)激導致機體免疫功能失衡[15]，激活炎癥信號通路，進而增加促炎細胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)，白細胞介素-1β(IL-1β)的表達，導致奶牛乳腺產(chǎn)生炎癥反應(yīng)和疾病，最終導致奶牛免疫功能下降，引發(fā)奶牛乳房炎[16]。此外，圍產(chǎn)期產(chǎn)生的過量ROS會引起奶牛MEC氧化應(yīng)激，嚴重損害MEC的結(jié)構(gòu)，破壞生物膜系統(tǒng)及其功能，使得MEC大量凋亡，導致奶牛健康狀況下降，從而提高了奶牛乳房炎的發(fā)病率[17]。

1.2 局部免疫缺失導致致病菌入侵

局部免疫的第一道防線是乳頭。乳頭的末端括約肌閉合，乳頭管的內(nèi)襯角蛋白積聚以及角蛋白含有的具有殺菌活性的抗菌脂肪酸成分阻止致病菌滲透[18]。但是圍產(chǎn)期奶牛乳頭管內(nèi)襯角蛋白形成還不完全，當乳汁大量分泌使得乳房內(nèi)壓增加，乳頭管內(nèi)的平滑肌變得更加松弛，增加了致病菌進入乳頭感染乳腺的機率[19]。最常見的致病菌主要有金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)和鏈球菌(Streptococcu)。據(jù)報道，Staphylococcusaureus入侵MEC后在MEC內(nèi)定植并產(chǎn)生大量毒力因子，迅速在細胞表面表達后與宿主細胞外基質(zhì)成分黏附，損害宿主細胞的同時破壞了機體的免疫系統(tǒng)[20]。Escherichiacoli通過乳頭管道侵入乳房，迅速引發(fā)炎癥反應(yīng)，局部臨床癥狀較明顯，有時甚至出現(xiàn)全身性臨床癥狀[21]。與Staphylococcusaureus感染相比，Escherichiacoli引發(fā)的急性乳房炎的奶牛更容易出現(xiàn)彌散性血管內(nèi)凝血的臨床表現(xiàn)[22]。Streptococcus通過產(chǎn)生生物膜入侵MEC，吞噬并破壞機體的免疫細胞[23]。這增加了病原微生物感染奶牛乳腺組織的風險，病原微生物的刺激對奶牛乳腺組織造成不可逆的損傷，MEC數(shù)量減少、活性降低[24]，導致產(chǎn)奶量下降[25]。

致病菌入侵乳腺組織后大量繁殖并在乳腺內(nèi)產(chǎn)生大量內(nèi)毒素，包括脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)和脂磷壁酸(lipteichoic acid，LTA)等。內(nèi)毒素抑制奶牛MEC的增殖，促進MEC合成并分泌促炎因子[IL-1β、IL-6、白細胞介素-8(IL-8)等]和細胞因子(TNF-α等)[26]，并刺激MEC或巨噬細胞(macrophages)的免疫反應(yīng)[27-28]。免疫反應(yīng)啟動后核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)途徑被激活，該途徑產(chǎn)生和調(diào)節(jié)參與宿主防御的促炎細胞因子。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是識別LPS的主要受體[29]，LPS的刺激使TLR4被激活，隨后激活髓樣分化因子88(MyD88)的依賴途徑，而MyD88依賴途徑激活了核因子-κB抑制蛋白激酶(inhibitor of nuclear factor-κB kinase，IκBk)和NF-κB，NF-κB的核轉(zhuǎn)位促進了炎性細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達[30]，進一步增加細胞因子IL-8的產(chǎn)生和趨化因子配體3和5的釋放，破壞奶牛MEC，導致乳房炎[31]。此外，機體會產(chǎn)生大量的白細胞和巨噬細胞來消除病原體，導致乳體細胞數(shù)(SCC)升高[32]，進而堵塞乳腺導管，使乳汁無法排出[33]，同時乳蛋白、乳糖和乳脂的合成受到抑制[34]，牛奶中維生素和鈣(Ca+)含量也會下降[35]，從而進一步損害乳腺組織并降低乳品質(zhì)。

2 金銀花提取物預防圍產(chǎn)期奶牛乳房炎的潛在作用機制

2.1 抗氧化作用

圍產(chǎn)期奶牛由于營養(yǎng)物質(zhì)攝入不足、能量代謝加快、內(nèi)分泌激素急劇變化等原因，導致能量需求和耗氧量需求增大，ROS生成增多，ROS的生成與機體抗氧化防御系統(tǒng)之間的不平衡導致機體產(chǎn)生氧化應(yīng)激[36]。氧化應(yīng)激是圍產(chǎn)后期奶牛發(fā)生免疫抑制和炎癥反應(yīng)的一個重要原因，會導致乳房炎癥等[13]。提高圍產(chǎn)期奶牛的總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)能有效對抗圍產(chǎn)期氧化應(yīng)激引起的奶牛乳房炎[37]。反映機體T-AOC的指標主要包括過氧化氫(H2O2)、羥自由基、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、α-生育酚、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶等[38]。唐志文[39]研究表明，在飼糧中添加1～2 g/kg含有10%綠原酸的金銀花提取物顯著降低了奶牛血液中ROS水平，顯著提高奶牛血液中T-AOC和SOD活性，使體內(nèi)抗氧化酶的活性增強，有效緩解了圍產(chǎn)期奶牛的氧化應(yīng)激。Ma等[40]研究表明，飼糧中添加28 g/d的金銀花提取物可以提高奶牛血清中GSH-Px活性和T-AOC，顯著降低了血清中MDA含量。符運斌等[41]研究發(fā)現(xiàn)，在精料中添加0.2%的金銀花提取物可以提高肉牛血清中T-AOC以及GSH-Px和SOD活性，并降低了血清中MDA含量。宋小珍等[42]研究發(fā)現(xiàn)，精料中添加0.2%的金銀花提取物可顯著提高肉牛血清中T-AOC和GSH-Px活性，并降低了血清中MDA含量。金銀花中的綠原酸可以有效清除機體內(nèi)的過氧化物自由基，如α-生育酚、超氧陰離子自由基、羥自由基等，除此之外，金銀花提取物在脂溶性體系中有更強的抗氧化能力[43]。金銀花提取物能夠有效提高抗氧化水平的機制可能在于：發(fā)揮作用的主效因子是多酚類化合物，含有1～2個與芳香環(huán)相連的羥基，與自由基反應(yīng)形成單電子氧化產(chǎn)物被迅速分解為非自由基產(chǎn)物；多酚類化合物中和自由基，促進核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroidderived 2-like 2，NRF2)驅(qū)動細胞保護酶表達，激活了抗氧化酶血紅素加氧酶-1(heme oxygenase 1，HO-1)的表達，抑制了細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，改善了細胞氧化損傷的程度[44-45]。以上研究表明，金銀花提取物能夠提高機體抗氧化水平，具有很強的抗氧化和清除自由基的能力，對促進奶牛健康養(yǎng)殖有重要意義。

2.2 抗炎作用

圍產(chǎn)期奶牛由于代謝異常和生理狀態(tài)的改變以及妊娠晚期產(chǎn)生的分娩應(yīng)激，不僅會使奶牛體內(nèi)出現(xiàn)大量的ROS，而且會導致機體釋放皮質(zhì)甾類激素，破壞奶牛的免疫系統(tǒng)且免疫能力急劇下降，從而引發(fā)乳房炎等炎癥性疾病[46]，圍產(chǎn)期奶牛炎癥反應(yīng)的直接表現(xiàn)是炎癥細胞因子濃度發(fā)生改變。唐志文[39]研究表明，在飼糧中添加1～2 g/kg含有10%綠原酸的金銀花提取物可以顯著降低圍產(chǎn)期奶牛血液中能夠引起局部炎癥反應(yīng)的炎癥指標(IL-1β、IL-6、觸珠蛋白)含量，有效地改善了圍產(chǎn)期奶牛的抗炎能力。金銀花提取物顯著降低了血清促炎標志物TNF-α、IL-1β和C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)含量，還明顯抑制NF-κB炎癥反應(yīng)信號通路的表達[47]。Wang等[48]使用由金銀花等中藥組成的中藥配方能顯著降低乳房炎血清和乳腺組織中炎癥指標TNF-α和IL-6含量，有效抑制炎癥反應(yīng)，減少乳房炎的發(fā)生。此外，金銀花花蕾乙醇提取物HS-23可抑制TLR4蛋白和mRNA的表達，抑制MyD88含量的增加，通過抑制TLR4信號通路減輕炎癥反應(yīng)[49]。金銀花提取物新綠原酸顯著降低LPS刺激而激活的IκBk磷酸化，抑制NF-κB的活化，降低TNF-α、IL-1β和IL-6含量[50]。

此外，金銀花提取物可抑制炎癥反應(yīng)的多種信號傳導途徑[50]。Han等[51]發(fā)現(xiàn)，從凍干金銀花中提取的多酚類化合物通過下調(diào)誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)表達，顯著抑制了LPS誘導的IL-1β和TNF-α的含量以及一氧化氮(nitric oxide，NO)和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)的表達，通過抑制炎癥細胞因子和介質(zhì)抑制小膠質(zhì)細胞BV-2產(chǎn)生的炎癥。金銀花提取物能夠抑制小膠質(zhì)細胞BV-2炎癥是由于金銀花提取物抑制了NF-κB激活下游的TNF-α、IL-1β、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)基因表達，以及ROS的產(chǎn)生[52]。上述研究表明，金銀花提取物抗炎活性物質(zhì)通過抑制NF-κB信號通路，進而下調(diào)下游的促炎細胞因子和趨化因子的表達發(fā)揮抗炎作用。因此，金銀花提取物通過抑制促炎細胞因子來發(fā)揮抑制炎證反應(yīng)的作用，可能是一種有效預防圍產(chǎn)期奶牛乳房炎的新途徑。

2.3 抗菌作用

圍產(chǎn)期奶牛局部免疫防線的缺失使大量致病菌進入乳頭感染MEC，引起MEC炎癥反應(yīng)，導致奶牛發(fā)生乳房炎[18]。Staphylococcusaureus、Escherichiacoli和Streptococcu是最常見的奶牛乳房炎致病菌。研究表明，金銀花提取物可通過抑制甚至殺死致病菌，達到預防奶牛乳房炎的作用，其抑菌機制主要有2個方面：第一，抑制細菌生物膜的成熟。細菌的生物被膜依附在由多糖、蛋白質(zhì)和胞外DNA組成的高度水合基質(zhì)中，這種環(huán)境為細菌繁殖提供了許多益處，包括保護細菌免受外部威脅，提高細菌對抗菌劑的抗藥性等[53]。金銀花提取物以劑量和時間依賴的方式顯著抑制了乳導管中的細菌生物膜的形成，導致細菌生物被膜發(fā)育不成熟[54]。第二，抑制細菌蛋白質(zhì)的合成和表達。任妮[55]研究表明，1 000 μg/mL金銀花水提取物能有效修復Staphylococcusaureus所引起的奶牛MEC損傷。谷靜娟[56]研究發(fā)現(xiàn)，金銀花水煎液有預防Staphylococcusaureus感染乳腺作用和抑制乳腺組織的細菌生長作用，可減輕乳腺病變和炎癥損傷，使乳腺功能恢復正常。此外，還有研究表明，金銀花提取物對致病菌有抑制作用。崔一喆等[57]也發(fā)現(xiàn)，灌注0.2 mL/d金銀花提取物可顯著降低Staphylococcusaureus和Escherichiacoli對小鼠的致病率。張忠斌等[58]利用改良石硫法制得的金銀花提取物，對Staphylococcusaureus和Escherichiacoli有較強的抗菌效果，抑菌圈直徑在2.41～3.47 mm。許欽坤等[59]也采用牛津杯法對Escherichiacoli和Staphylococcusaureus進行體外抑菌試驗，研究證實金銀花提取物對這2種菌有很強的抑菌效果，最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)均為31.20 mg/mL。高海成[60]通過電泳試驗分析金銀花提取物對細菌蛋白質(zhì)的DNA的影響，證實金銀花提取物能夠?qū)е耂taphylococcusaureus和Escherichiacoli蛋白質(zhì)條帶的嚴重缺失，同時DNA含量明顯下降。上述研究表明，金銀花提取物抑制Staphylococcusaureus和Escherichiacoli的作用機制可能是金銀花提取物的活性成分抑制了細菌細胞內(nèi)的核酸的產(chǎn)生，導致細菌無法進行DNA的復制和RNA的合成，抑制了蛋白質(zhì)的合成和表達，抑制了細菌外多糖基質(zhì)和細胞內(nèi)大分子物質(zhì)的合成來抵抗致病菌，在預防圍產(chǎn)期奶牛乳房炎方面具有一定的參考價值。

3 小結(jié)與展望

金銀花提取物不僅能為預防奶牛乳房炎提供新的防治策略，更為通過營養(yǎng)調(diào)控手段為奶牛健康養(yǎng)殖提供技術(shù)途徑。但是，目前金銀花提取物預防圍產(chǎn)期奶牛乳房炎的作用機制研究存在許多不足之處：1)金銀花提取物對機體氧化應(yīng)激-免疫失衡-炎癥反應(yīng)聯(lián)動效應(yīng)的作用機制及作用靶點有待進一步解析；2)金銀花提取物中活性物質(zhì)與奶牛機體免疫互作網(wǎng)絡(luò)模型有待構(gòu)建。另外，今后研究課題還需對金銀花提取物營養(yǎng)活性物質(zhì)主效因子和指紋圖譜技術(shù)進行更深入的研究。