馮長(zhǎng)海

（上海皓信生物科技有限公司，上海 201109）

曲霉屬是臨床常見的一類條件致病性真菌，可根據(jù)其形態(tài)、生理和系統(tǒng)發(fā)育特征進(jìn)行鑒定與分類，形態(tài)學(xué)由真菌的菌落特征及其鏡下結(jié)構(gòu)特征組成，其中分生孢子頭的形狀，小梗單層還是雙層，梗莖、頂囊、小梗及孢子的顏色、大小、形狀、質(zhì)地，是否存在殼細(xì)胞、閉囊殼、子囊和子囊孢子是曲霉的重要鏡下結(jié)構(gòu)特征，也是鑒定曲霉的重要依據(jù)。黃柄曲霉是少數(shù)可產(chǎn)粉孢子的曲霉[1-2]，可導(dǎo)致免疫功能不全兒童感染引發(fā)皮膚曲霉病，還可引起骨髓炎、耳真菌病、甲真菌病和椎間盤炎等[2-3]。本研究采用自制玻片進(jìn)行黃柄曲霉的小培養(yǎng)試驗(yàn)，探討改良小培養(yǎng)技術(shù)在黃柄曲霉微觀形態(tài)學(xué)觀察中的價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 材料

乳酸酚棉蘭、PDA培養(yǎng)基（英國(guó)Oxoid公司），離心管（50 mL規(guī)格）、無(wú)菌水、小培養(yǎng)玻片和一次性無(wú)菌加樣槍頭（上海皓信生物科技有限公司），實(shí)驗(yàn)用黃柄曲霉（上海市公共衛(wèi)生臨床中心贈(zèng)送），黃柄曲霉標(biāo)準(zhǔn)菌株KP281443株序列相似度100%（北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測(cè)序）。

1.2 方法

將實(shí)驗(yàn)用黃柄曲霉菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，室溫培養(yǎng)，待菌株成熟后備用。將小培養(yǎng)玻片凹面朝上，放置于生物安全柜內(nèi)臺(tái)面上，紫外線照射30 min后備用。用加樣槍吸取已融化的PDA培養(yǎng)基25 μL注入在玻片中央凹槽，待瓊脂凝固后，在中央凹槽紅點(diǎn)處接種黃柄曲霉，蓋上蓋玻片，在蓋玻片藍(lán)點(diǎn)處用固封劑固定蓋玻片。將接種了菌株的玻片平放于內(nèi)含1滴蒸餾水的50 mL離心管中，25 ℃條件下培養(yǎng)。每日鏡檢觀察黃柄曲霉的形態(tài)生長(zhǎng)變化，待菌株生長(zhǎng)成熟（曲霉特征結(jié)構(gòu)大量出現(xiàn)）后，用乳酸酚棉蘭染液沿玻片與蓋玻片間縫隙緩慢加入，顯微鏡觀察、拍照。見圖1。

圖1 改良小培養(yǎng)技術(shù)操作示意圖

2 結(jié)果

黃柄曲霉25 ℃培養(yǎng)4 d后觀察可見：菌絲透明、有隔；分生孢子頭呈松散放射狀或放射狀；頂囊匙形或梨形，基部收縮；小梗單層或雙層，覆蓋頂囊1/2至1/3；分生孢子球形或近球形，壁光滑；分生孢子梗透明至淺棕色，梗壁光滑、無(wú)隔或偶見有隔；粉孢子球形或近球形、偶見橢圓形或倒棒狀，無(wú)柄或1～4個(gè)著生于孢子梗上；可見不完全產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)。見圖2。

圖2 黃柄曲霉25 ℃培養(yǎng)4 d鏡下圖（ ×1000）

3 討論

小培養(yǎng)法是Emile Rivalier和S.Seydel于1932年報(bào)道的一種研究絲狀真菌生命活動(dòng)的培養(yǎng)方法，可有效地觀察絲狀真菌的產(chǎn)孢過程。通過真菌孢子、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及菌絲的形態(tài)特征，三者相互間的位置排列關(guān)系，結(jié)合絲狀真菌常規(guī)培養(yǎng)的特征，或結(jié)合真菌的生理生化特征，可進(jìn)行絲狀真菌的形態(tài)學(xué)鑒定。傳統(tǒng)小培養(yǎng)方法或小培養(yǎng)改良方法多是將真菌培養(yǎng)基置于觀察載體平面（載玻片或類似物）上，接種真菌后覆蓋蓋玻片或類似物，送入孵箱進(jìn)行培養(yǎng)[4-7]。采用此類方法時(shí)，如果直接鏡檢，因蓋玻片和載玻片間距離較大，就會(huì)出現(xiàn)菌體重疊，不易獲得較好的真菌圖片；如果揭離蓋玻片后制片鏡檢，因在揭片過程中真菌孢子的自然生長(zhǎng)狀態(tài)遭到人為破壞，會(huì)導(dǎo)致菌體結(jié)構(gòu)不完整，背景雜亂，成像效果不佳。即使技術(shù)嫻熟的操作人員，要獲得清晰、典型、完整的真菌圖片，往往也需要大量制片。本法是在觀察載體平面（載玻片）內(nèi)部進(jìn)行真菌培養(yǎng)，較易獲得清晰、典型、完整的真菌圖片。

《美國(guó)臨床微生物手冊(cè)（第11版）》[8]提供了16個(gè)臨床相關(guān)曲霉種的重要形態(tài)結(jié)構(gòu)特征圖解，可作為臨床相關(guān)曲霉種的形態(tài)學(xué)鑒定方法，該手冊(cè)將黃柄曲霉歸類為雙層小梗的曲霉，通過松散柱狀的分生孢子頭、白色至淺棕色的分生孢子和棕黃色至黃色至無(wú)色的分生孢子梗的表型特征，可快速鑒定黃柄曲霉。但黃柄曲霉并非只有雙層小梗，還有單層小梗，應(yīng)屬單層和雙層小梗均有的曲霉分類。當(dāng)黃柄曲霉單層和雙層小梗均出現(xiàn)時(shí)，采用該手冊(cè)提供的方法就會(huì)無(wú)法進(jìn)行鑒定。黃柄曲霉是除土曲霉外少數(shù)具有粉孢子的曲霉[1-2]，利用此特性，結(jié)合其分生孢子梗顏色等其他鏡下或菌落特征，可進(jìn)行黃柄曲霉的輔助鑒定。同樣，黃柄曲霉不完全產(chǎn)孢現(xiàn)象和單層小梗的發(fā)現(xiàn)，深化了黃柄曲霉的形態(tài)學(xué)認(rèn)識(shí)，表明改良小培養(yǎng)技術(shù)在黃柄曲霉形態(tài)學(xué)鑒定中具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，黃柄曲霉的鏡下結(jié)構(gòu)特征是其形態(tài)學(xué)鑒定的重要依據(jù)，改良小培養(yǎng)方法可清晰地觀察到黃柄曲霉的結(jié)構(gòu)特征，是較好的一種真菌形態(tài)學(xué)研究技術(shù)。