何成山，姚曉陽，蔣秀娣，陸志成

（上海中醫(yī)藥大學附屬第七人民醫(yī)院檢驗科，上海 200137）

心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）是在心肌細胞損傷時被釋放入血循環(huán)中的，是診斷心肌損傷的重要血清學標志物。cTnI在生理狀態(tài)下為免疫系統(tǒng)的隱蔽抗原，當心肌細胞損傷時cTnI被釋放出來，觸發(fā)機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生心肌肌鈣蛋白I自身抗體（cardiac troponin I autoantibody，cTnIAAb）。1996年，BOHNER等[1]首次在急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患者血清中發(fā)現(xiàn)cTnIAAb。隨后的多個研究均證實cTnIAAb可與cTnI檢測試劑盒中的檢測抗體或捕獲抗體競爭結(jié)合cTnI的抗原表位，對檢測結(jié)果造成負干擾[2]。近年來的研究結(jié)果顯示，除AMI患者外，還有部分擴張性心肌病、心肌炎等患者血清中也存在cTnIAAb，并與患者心肌的慢性炎癥、心臟功能受損、心肌損傷后的左室病理性重構(gòu)和心力衰竭的發(fā)生等密切相關[3-4]。因此，檢測血清cTnIAAb有重要的臨床意義。目前，國內(nèi)外尚無商品化的cTnIAAb檢測試劑盒。文獻報道的cTnIAAb檢測主要使用cTnI-肌鈣蛋白T（troponin T，TnT）-肌鈣蛋白C（troponin C，TnC）融合蛋白或cTnITnC融合蛋白作為檢測抗原，進行間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），并進行定性檢測[3，5-7]。由于ELISA的敏感性和重復性欠佳，且有較多的人為因素可影響檢測結(jié)果。因此，本研究擬建立一種基于微陣列蛋白芯片技術(shù)的定量檢測cTnIAAb的化學發(fā)光免疫分析法。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年5月—2019年5月上海中醫(yī)藥大學附屬第七人民醫(yī)院門急診或住院急性冠狀動脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）患者500例（ACS組），其中男320例、女180例，年齡（58.8±10.8）歲。所有患者均依據(jù)《急性冠脈綜合征急診快速診療指南》[8]確診。入院時采用ARCHITECT i2000全自動化學發(fā)光免疫分析儀（美國雅培公司）及配套試劑檢測血漿或血清cTnI，結(jié)果均＞0.1 ng/mL。排除自身免疫性疾病、肝臟疾病、腎臟疾病、血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤患者及近期有手術(shù)、外傷和感染史的患者。隨機選取同期上海中醫(yī)藥大學附屬第七人民醫(yī)院體檢健康者100名作為正常對照組，其中男60名、女40名，年齡（53.5±11.2）歲。收集所有對象檢測后的剩余血清樣本，置于無菌無酶離心管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩１狙芯拷?jīng)上海中醫(yī)藥大學附屬第七人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有對象均知情同意。

1.2 檢測血清cTnIAAb的微陣列化學發(fā)光免疫分析法的建立

1.2.1 抗原包被芯片的制備 將硬基質(zhì)芯片（江蘇三聯(lián)生物工程有限公司）置于含2% NaOH的預處理液中浸泡24 h，用純水清洗2～8次，再將芯片置于0.5%硅烷水溶液中浸泡30 min。將浸泡好的硬基質(zhì)芯片置于烤箱中，140 ℃烘烤0.5 h。處理完成的芯片密閉保存。將重組人cTnI-C融合蛋白（上海博陽生物診斷公司饋贈）用穩(wěn)定劑（江蘇三聯(lián)生物工程有限公司）梯度稀釋，采用Nano-Plotter 2.1全自動點樣儀（德國GeSim公司）將各種濃度的抗原分別點樣于已預處理的芯片上，點樣量為20 nL/點。將點樣好的芯片分別浸入封閉液中封閉，然后取出芯片，150×g離心1 min，去除殘余封閉液，4 ℃保存待用。

1.2.2 微陣列化學發(fā)光免疫分析法的建立 采用微陣列化學發(fā)光免疫分析法（間接法）檢測血清cTnIAAb，檢測儀器為SLXP-001全自動生物芯片閱讀儀（江蘇三聯(lián)生物工程有限公司）。具體步驟：（1）在芯片杯中加入1∶100稀釋的待檢血清，孵育30 min；（2）洗滌芯片，將芯片置于辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的抗人IgG溶液中，37 ℃孵育40 min；（3）沖洗芯片，將芯片置于發(fā)光底物溶液中，由電荷耦合器件（charge coupled device，CCD）相機讀取灰度值。在玻片上抗原點樣為1行4個點，以4個點灰度值的平均值作為最終結(jié)果，由儀器自動分析圖片并給出結(jié)果。

1.2.3 實驗條件的優(yōu)化 隨機選取cTnI＞0.1 ng/mL的ACS患者血清100份，采用稀釋液（江蘇三聯(lián)生物工程有限公司配制）1∶100稀釋，采用SLXP-001全自動生物芯片閱讀儀篩選出1份信噪比最高的血清樣本，作為后續(xù)實驗條件優(yōu)化的樣本。優(yōu)化條件以檢測結(jié)果反應信號高，本底信號低，信噪比最大為最優(yōu)實驗條件。（1）抗原（cTnI-C融合蛋白）濃度的選擇。從50.0、25.0、12.5、6.0 μg/mL 4個濃度中選取最優(yōu)抗原濃度。（2）點樣芯片封閉所用封閉液及封閉時間的選擇。觀察2%人乳、2%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、2%羊乳、2%乳清蛋白的封閉效果；將芯片在不同的封閉液中分別封閉12、24、48和72 h，取出后離心待檢。（3）抗體的選擇。對不同的抗體（HRP-兔抗人IgG、HRP-山羊抗人IgG、HRP-驢抗人IgG和HRP-鼠抗人IgG，均購自深圳菲鵬公司）進行篩選。（4）自制芯片穩(wěn)定性的驗證。采用加速穩(wěn)定性試驗驗證自制芯片的穩(wěn)定性，取1份高濃度cTnIAAb陽性血清（412.6 AU/mL）；另取20片已制備好的芯片，其中4片即刻點樣檢測，剩余16片在37 ℃溫箱中保存，于第5天、第10天、第20天各取4片點樣檢測，觀察反應灰度值與即刻檢測的反應灰度值的差異。

1.2.4 血清cTnIAAb參考區(qū)間及標準曲線的建立 采用建立的微陣列化學發(fā)光免疫分析法檢測100名健康體檢者的血清cTnIAAb濃度，以樣本反應灰度值的第95百分位數(shù)為臨界值，并賦值為20 AU/mL，健康人群的參考區(qū)間＜20 AU/mL。選擇cTnIAAb檢測結(jié)果信噪比最高的血清，使用血清稀釋液從1∶50開始倍比稀釋至1∶12 800，采用微陣列化學發(fā)光免疫分析法檢測cTnIAAb，獲得樣本各稀釋度的灰度值，找出與健康體檢者樣本臨界值對應的發(fā)光信號灰度值，并賦值為20 AU/mL，以此計算不同稀釋倍數(shù)樣本中cTnIAAb反應的發(fā)光灰度值，繪制cTnIAAb濃度與發(fā)光灰度值對應的標準曲線。血清cTnIAAb濃度的單位為AU/mL。

1.3 微陣列化學發(fā)光免疫分析法的性能評價

1.3.1 精密度 （1）重復性。取cTnIAAb高值（152 AU/mL）和低值（38 AU/mL）血清樣本各1份，1 d內(nèi)連續(xù)檢測20次，計算變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）。（2）中間精密度。取上述高值、低值血清樣本連續(xù)檢測3 d，每天連續(xù)檢測 5 次，計算CV。

1.3.2 空白限（limit of blank，LoB）和檢測限（limit of detection，LoD） 以血清稀釋液為樣本，每天連續(xù)檢測5次，共檢測4 d，獲得20個檢測數(shù)據(jù)，取第95百分位數(shù)所在濃度為LoB。根據(jù)公式 LoD=LoB+1.645s計算LoD。

1.3.3 線性范圍 用血清稀釋液將1份高濃度cTnIAAb血清樣本從1∶50開始倍比稀釋至1∶12 800，采用微陣列化學發(fā)光免疫分析法檢測，獲得各稀釋度的發(fā)光灰度值，以各稀釋度的理論發(fā)光灰度值為參比，計算實測值與理論值之間的相關性。以r≥0.99時的最高樣本濃度為線性范圍上限，LoD為線性范圍下限。

1.4 免疫印跡法鑒定cTnI自身抗體的特異性

將15 μg cTnI-TnC融合蛋白或心肌肌鈣蛋白C（cardiac troponin C，cTnC）（批號8T57，芬蘭Hytest公司）與上樣緩沖液混合，95 ℃金屬浴加熱5 min，恢復至室溫后待用。采用100 g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳，110 V電泳60 min[Biorad PowerPac基礎電泳儀（美國Bio-Rad公司）]，將硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜先用甲醇浸泡1 min激活，再將NC膜、濾紙、電泳凝膠在轉(zhuǎn)膜液中充分浸泡20 min，制成三明治結(jié)構(gòu)，20 V電壓35 min，將電泳條帶轉(zhuǎn)移至NC膜上。NC膜置于5%脫脂奶粉中4 ℃封閉過夜。將cTnIAAb高濃度血清樣本（1∶50稀釋）、抗cTnI單克隆抗體[批號4T21（820），芬蘭Hytest公司]或抗cTnC單克隆抗體[批號4T27（1A2），芬蘭Hytest公司]與NC膜室溫孵育2 h；用磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate-buffered saline Tween-20，PBST）洗滌3次，加HRP-羊抗人IgG（1∶500稀釋）或HRP-羊抗鼠IgG（深圳菲鵬公司），室溫孵育1 h，用PBST洗滌3次。在NC膜表面滴上發(fā)光液混合物（上海翊圣生物科技有限公司），曝光后采用Image Guant LAS4000化學發(fā)光成像分析儀（美國GE公司）成像。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。采用Spearman相關性分析評估cTnIAAb與cTnI的相關性。計數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 微陣列化學發(fā)光免疫分析法實驗條件的優(yōu)化

2.1.1 包被抗原 cTnI-TnC融合蛋白濃度的選擇 50 μg/mL cTnI-TnC融合蛋白點樣獲得的信噪比最高，故以此濃度作為芯片點樣濃度。

2.1.2 最佳封閉液和封閉時間的選擇 2% BSA和2%羊乳本底較高，信噪比降低；2%乳清蛋白本底較低，特異性反應信號值也較低；2%人乳封閉液反應信號強，信噪比最高，且“陰性”樣本信號最低。因此，最佳封閉液為2%人乳。以2%人乳為封閉液，封閉12 h，陽性信號的信噪比最高；封閉24 h，反應信號值稍有下降；封閉48 h，芯片反應信號明顯降低。因此，最佳封閉時間為12 h。見圖1。

圖1 最佳封閉液和封閉時間的選擇

2.1.3 HRP標記抗體的選擇 采用4種HRP-抗人IgG抗體與篩選出的4例cTnIAAb陽性樣本和2例cTnIAAb陰性樣本反應。HRP-驢抗人IgG抗體、HRP-兔抗人IgG抗體的反應信號較弱，本底信號也較低；HRP-鼠抗人IgG抗體和HRP-羊抗人IgG抗體獲得的反應信號強，本底信號尚可，但HRP-羊抗人IgG抗體的信噪比更大。因此，選擇HRP-羊抗人IgG抗體為作二抗。 見圖2。

圖2 酶標記抗人IgG的選擇

2.1.4 自制芯片的穩(wěn)定性 加速穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示，7 d內(nèi)cTnIAAb的反應信號值幾乎無明顯改變，7～14 d反應信號值逐步下降。與即刻檢測相比，第14天反應信號值下降約30%，第21天的反應信號值僅為即刻檢測的40%。見圖3。

圖3 自制芯片穩(wěn)定性評價的結(jié)果

2.2 血清cTnIAAb定量檢測標準曲線和參考區(qū)間的建立

以健康人群血清樣本反應灰度值的第95百分位數(shù)作為臨界值，其相對應的賦值濃度為20 AU/mL，以≥20 AU/mL為cTnIAAb陽性。系列稀釋樣本的反應灰度值與理論反應灰度值有很好的相關性（r2＞0.99）。標準曲線見圖4。

圖4 血清cTnIAAb定量檢測標準曲線

2.3 微陣列化學發(fā)光免疫分析法檢測血清cTnIAAb的性能評價

2.3.1 性能評價 （1）重復性。高值和低值樣本的CV分別為5.02%和11.26%。（2）中間精密度。高值和低值樣本的CV分別為14.13%和7.83%。（3）LoB和LoD。LoB為0.12 AU/mL，LoD為0.23 AU/mL。（4）線性范圍。線性范圍為0.23～815.00 AU/mL。（5）參考區(qū)間。參考區(qū)間為＜20 AU/mL。

2.3.2 免疫印跡法鑒定血清cTnIAAb的特異性 （1）cTnIAAb的特異性。采用免疫印跡法檢測6例經(jīng)微陣列化學發(fā)光免疫分析法測定cTnIAAb為強陽性的血清樣本（標記為1～6號，cTnIAAb濃度分別為103.6、153.9、273.6、368.7、356.8、406.5 AU/mL）和1例cTnIAAb陰性血清樣本（cTnIAAb為12.5 AU/mL）。結(jié)果顯示，cTnI-TnC融合蛋白的相對分子質(zhì)量為46 000，6例cTnIAAb陽性樣本在相對分子質(zhì)量40 000～55 000處出現(xiàn)明顯的反應條帶，cTnIAAb陰性血清未見該反應條帶，陽性對照條帶清晰（圖5）。（2）排除抗cTnC抗體對cTnIAAb檢測的干擾。因本研究采用的包被抗原為cTnI-TnC融合蛋白，故需先排除cTnIAAb陽性血清中可能存在的抗cTnC抗體與cTnI-TnC融合蛋白中的cTnC抗原反應而出現(xiàn)的假陽性。采用免疫印跡法檢測4例cTnIAAb強陽性血清和1例cTnIAAb陰性血清。結(jié)果顯示，僅抗cTnC單克隆抗體陽性對照（相對分子質(zhì)量為18 000）在相對分子質(zhì)量15 000～25 000處出現(xiàn)明顯的反應條帶，4例cTnIAAb陽性血清和1例cTnIAAb陰性血清在此處均未出現(xiàn)明顯的反應條帶（圖6）。

圖5 免疫印跡法驗證cTnIAAb的特異性

圖6 免疫印跡法檢測cTnIAAb陽性血清對抗cTnC單克隆抗體的反應性

2.4 臨床標本的檢測

以cTnIAAb≥20 AU/mL為陽性。ACS組血清cTnIAAb陽性率為8.4%（42/500），明顯高于正常對照組[2%（2/100）]（χ2=5.023，P＜0.05）。在cTnIAAb陽性樣本中，有7例樣本（ACS患者6例、正常對照者1例）cTnIAAb水平為20～30 AU/mL，有23例樣本（ACS患者22例、正常對照者1例）為31～50 AU/mL，有30例樣本（均為ACS患者）cTnIAAb水平＞50 AU/mL。

ACS組血清cTnIAAb水平為5.43（3.21～8.35）AU/mL，正常對照組為5.86（3.49～7.82）AU/mL，2個組之間血清cTnIAAb水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。有76.2%（32/42）的cTnIAAb陽性患者血清cTnI＜0.5 ng/mL，僅有2例cTnI＞10 ng/mL；所有cTnI＞50 ng/mL的樣本均未檢出cTnIAAb。Spearman相關性分析結(jié)果顯示，ACS組血清cTnIAAb與cTnI無相關性（r2=0.1，P＞0.05）。

3 討論

cTnIAAb常在缺血性心肌病、擴張性心肌病、圍產(chǎn)期心肌病等各種心肌病患者的血循環(huán)中被檢出。有研究結(jié)果顯示，缺血性心肌病患者血清cTnIAAb的檢出率為9.2%[9]～21.3%[10]，cTnIAAb水平較高的患者左心室射血分數(shù)明顯低于cTnIAAb陰性者[11]。在圍產(chǎn)期心肌病[12]、長期血液透析[13]、缺血性心臟病[14]等患者中均發(fā)現(xiàn)血清cTnIAAb陽性，提示心功能受損。周桑等[3]的研究結(jié)果顯示，在入院時，cTnIAAb陽性AMI患者的超聲心動圖結(jié)果與cTnIAAb陰性AMI患者并無差異；隨訪1.4年后，cTnIAAb陽性AMI患者左心室舒張末期容積和左心室收縮末期容積均顯著升高。提示cTnIAAb陽性與AMI后左心室病理性重構(gòu)密切相關。WU等[15]的研究結(jié)果顯示，cTnIAAb可上調(diào)心肌細胞凋亡基因的表達，使心肌細胞凋亡增加。鑒于cTnIAAb具有重要的臨床意義，且目前無商品化試劑盒，因此本研究自建了定量檢測血清cTnIAAb的微陣列化學發(fā)光免疫分析法，并對該方法的檢測性能、特異性和臨床應用進行了初步評價。

心肌細胞損傷后被釋放到血循環(huán)中的cTnI可以游離形式或復合形式存在，但游離形式的cTnI非常不穩(wěn)定，半衰期僅5 min，因此血循環(huán)中90%的cTnI以cTnI-TnC的穩(wěn)定形式存在[2]。因此，本研究選擇cTnI-TnC融合蛋白作為檢測抗原，建立定量檢測cTnIAAb的微陣列化學發(fā)光免疫分析法，除有較好的穩(wěn)定性外，更與病理狀態(tài)下血循環(huán)中存在的cTnI形式相似。本研究對自建檢測方法的實驗條件進行優(yōu)化，精密度良好（CV＜15%），標準曲線r2＞0.99，線性范圍為0.23～815.00 AU/mL，敏感性高（LoB為0.12 AU/mL，LoD為0.23 AU/mL）。加速穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示，制備好的芯片在37 ℃條件下可穩(wěn)定7 d，這提示芯片可在4 ℃條件下穩(wěn)定60～100 d，基本滿足了大批量實驗或臨床研究的需求。

為了明確自建微陣列化學發(fā)光免疫分析法檢測cTnIAAb的特異性，本研究采用免疫印跡法進行了驗證。結(jié)果顯示，6例cTnIAAb陽性樣本在相對分子質(zhì)量40 000～55 000處均出現(xiàn)明顯的反應條帶，而cTnIAAb陰性樣本在此位置無反應條帶。cTnI-TnC融合蛋白的相對分子質(zhì)量為46 000，因此該位置出現(xiàn)的反應條帶應是血清中的cTnIAAb與電泳膜上的cTnI-TnC特異性結(jié)合產(chǎn)生的。由于本研究所用的檢測抗原為cTnI-TnC融合蛋白，因此有可能會與血清中的抗cTnI-TnC抗體或抗肌鈣蛋白自身抗體結(jié)合，導致出現(xiàn)假陽性。為了排除這種可能性，本研究采用免疫印跡法進行驗證。結(jié)果顯示，無論是cTnIAAb陽性血清樣本，還是陰性血清樣本，與轉(zhuǎn)膜的cTnITnC融合蛋白均無結(jié)合反應，在相對分子質(zhì)量15 000～25 000處均未出現(xiàn)反應條帶；只有抗cTnC單克隆抗體出現(xiàn)明顯的反應條帶。這提示血清中的cTnIAAb僅與cTnI-TnC融合蛋白中的cTnI產(chǎn)生結(jié)合反應，具有很好的特異性。

HAGHIKIA等[12]的研究結(jié)果顯示，表觀健康人的cTnIAAb檢出率約為6%。TANG等[5]報道的正常人的cTnIAAb檢出率僅為0.5%。本研究結(jié)果顯示，正常對照組cTnIAAb的陽性率為2%。不同研究中cTnIAAb陽性率的差異可能與檢測方法、使用的檢測抗原等不同等有關。本研究結(jié)果顯示，cTnI均陽性的500例ACS患者中，血清cTnIAAb的陽性率為8.4%，顯著高于正常對照組[2%（2/100）]（P＜0.05）；但2個組之間血清cTnIAAb水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），可能與ACS組cTnIAAb陽性率不高，陰性樣本較多，導致ACS患者的cTnIAAb平均水平較低有關。為了研究血清cTnI水平與cTnIAAb之間的關系，本研究進一步分析了cTnIAAb陽性患者的臨床資料，結(jié)果顯示，有76.2%（32/42）的cTnIAAb陽性患者血清cTnI＜0.5 ng/mL，所有cTnI＞50 ng/mL的樣本均未檢出cTnIAAb。由此可見，cTnIAAb主要在cTnI水平較低的患者中檢出，在cTnI水平較高的患者中少見。這是否由cTnIAAb對cTnI的檢測造成負干擾，導致cTnI檢測結(jié)果假性降低所致，尚需進一步研究加以明確。

綜上所述，本研究建立的微陣列化學發(fā)光免疫分析法可用于定量檢測血清cTnIAAb，檢測性能基本達到臨床應用要求，為cTnIAAb的臨床應用提供了較好的方法學基礎。