王天琦，王天方，賈宇晴，曹志鵬，朱寶利

1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng)110122；2.天津市公安局河西分局物證鑒定所，天津300061

過敏性休克死亡是法醫(yī)學(xué)鑒定的重要內(nèi)容之一，由于缺乏特異性的病理形態(tài)學(xué)改變，導(dǎo)致此類案件的法醫(yī)學(xué)鑒定具有一定難度[1]。過敏性休克主要由Ⅰ型超敏反應(yīng)介導(dǎo)，免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）是介導(dǎo)Ⅰ型超敏反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)[2]。在既往研究報(bào)道[3]中已證實(shí)，死后血清IgE 的檢測(cè)對(duì)過敏性休克的死因診斷具有輔助作用并已在實(shí)際工作中得到一定的應(yīng)用。

在實(shí)際工作中，由于樣本的送檢、移交或檢測(cè)不及時(shí)等因素造成樣本需暫時(shí)保存，一般為冷凍保存，有時(shí)還需長(zhǎng)期保存以備檢。臨床研究[4-5]結(jié)果表明，IgE 在正確采集下可以保存數(shù)周，在有抗凝劑的作用下可以室溫保存11 周且維持其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定不被降解，在-20 ℃條件下可穩(wěn)定保存6 個(gè)月。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[6]結(jié)果顯示，大鼠死后血清IgE 在冷凍、室溫及4 ℃條件下可穩(wěn)定保存25 d。但在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，尸體冷凍保存及死后變化常導(dǎo)致嚴(yán)重溶血，因此，探究IgE 在死后樣本中的穩(wěn)定性用于指導(dǎo)實(shí)際工作是很有必要的。

本研究擬收集死亡案例的血漿及溶血樣本，對(duì)IgE 經(jīng)-20 ℃、4 ℃、25 ℃3 種條件下保存、5 次反復(fù)凍融后及-80℃長(zhǎng)期超低溫冷凍保存后的穩(wěn)定性進(jìn)行初步探究。

1 材料與方法

1.1 樣本來(lái)源及選取標(biāo)準(zhǔn)

本研究共選取39 例中國(guó)醫(yī)科大學(xué)司法鑒定中心在2017—2018 年受理的非冷凍且死后48 h 內(nèi)進(jìn)行尸體解剖案例的心血樣本，其中20 例在獲取血液后立即以3 000×g離心20 min 獲得血漿，血漿性狀為無(wú)肉眼可見溶血，另外19 例血液在獲取后用超聲破碎法（500 W，20 kHz，5 min）致其溶血，制備成溶血樣本。

由于大多數(shù)尸體在解剖前經(jīng)過冷凍保存，較難收集到非冷凍且死后經(jīng)過時(shí)間＜48 h 的過敏性休克死亡案例，故本研究收集的39 例為一般常見案例，死因?yàn)榻煌ㄊ鹿?8 例、心臟性猝死17 例、縊死2 例、高墜2 例，其中男性28 例，女性11 例，年齡為21～67 歲。

本研究通過了中國(guó)醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 IgE在不同保存條件下的穩(wěn)定性

取5 例血漿樣本及5 例溶血樣本，分為3 組，分別保存在-20 ℃、4 ℃、25 ℃，每組分裝成6 份，每份200 μL，分別在第0、3、7、14、21、28 天檢測(cè)樣本IgE。

1.3 血漿和溶血樣本長(zhǎng)時(shí)間冷凍處理過程

取20 例血漿樣本和19 例溶血樣本，每例分為2份，每份200 μL。第1份于獲取后立即檢測(cè)，獲得IgE初始濃度，第2 份經(jīng)-80 ℃冷凍保存1 年（365 d）后檢測(cè)IgE。

1.4 血漿和溶血樣本反復(fù)凍融處理過程

取10 例血漿樣本及10 例溶血樣本，每例分為4 份，每份200 μL。第1 份于獲取后立即檢測(cè)，獲得IgE 初始濃度；第2 份經(jīng)-20 ℃冷凍40 min 后樣本完全凍結(jié)，立即取出室溫解凍，連續(xù)反復(fù)5 次后檢測(cè)IgE；第3 份經(jīng)-80 ℃冷凍30 min 后樣本完全凍結(jié)，立即取出室溫解凍，連續(xù)反復(fù)5 次后檢測(cè)IgE；第4 份經(jīng)-80 ℃冷凍再室溫解凍，每次冷凍時(shí)間＞24 h，反復(fù)5 次后檢測(cè)IgE。

1.5 IgE的檢測(cè)方法

血漿和溶血樣本的IgE 應(yīng)用cobas e411 型電化學(xué)發(fā)光全自動(dòng)免疫分析儀及配套人免疫球蛋白E 檢測(cè)試劑盒（瑞士Roche 公司）進(jìn)行檢測(cè)。血漿樣本使用儀器直接檢測(cè)；溶血樣本應(yīng)用配套樣本稀釋液Diluent Universal（瑞士Roche公司），使用儀器自動(dòng)稀釋100倍后再進(jìn)行檢測(cè)IgE 濃度，以去除溶血對(duì)檢測(cè)造成的干擾。

1.6 降解率的計(jì)算

在-20 ℃、4 ℃、25 ℃保存穩(wěn)定性研究中，以初始濃度（0 d 時(shí)）為基礎(chǔ)濃度，用經(jīng)不同條件下保存處理后的濃度與之對(duì)比，計(jì)算降解率（degradation rate，DR），計(jì)算公式如下：

式中，C0為樣本中IgE 的初始濃度（IU/mL）；Cx為保存3、7、14、21、28 d 后IgE 的濃度（IU/mL）。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié) 果

2.1 血漿及溶血樣本中IgE在不同保存條件下的穩(wěn)定性

血漿及溶血樣本中IgE 隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，濃度總體呈下降趨勢(shì)，降解率呈升高趨勢(shì)。3 種保存條件下28 d 后血漿中IgE 的降解情況大致相同，均值在15%左右。溶血樣本保存28 d 后，相同條件下較血漿樣本降解速度加快（P＜0.05），并且在25 ℃保存條件下降解速度快于-20 ℃和4 ℃保存條件（P＜0.05）。血漿及溶血樣本中IgE 在不同保存條件下的穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果見表1～2。

表1 血漿樣本中IgE在不同保存條件下的穩(wěn)定性Tab. 1 Stability of IgE in plasma samples under different storage conditions （n=5）

表2 溶血樣本中IgE在不同保存條件下的穩(wěn)定性Tab. 2 Stability of IgE in hemolyzed blood samples under different storage conditions （n=5）

2.2 血漿和溶血樣本長(zhǎng)時(shí)間冷凍后IgE濃度的比較

分別將血漿與溶血樣本在-80 ℃冷凍保存1 年后的IgE 濃度與初始濃度進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)血漿樣本在-80 ℃冷凍保存1 年后，其濃度與初始濃度相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。而溶血樣本在-80 ℃冷凍保存1 年后，其濃度與初始濃度相比有所降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。血漿與溶血樣本中IgE 濃度在-80 ℃冷凍保存1 年后的檢測(cè)結(jié)果見表3。

2.3 血漿及溶血樣本反復(fù)凍融后IgE濃度的比較

分別將血漿與溶血樣本于-20 ℃保存40 min 凍融5 次、-80 ℃保 存30 min 凍 融5 次 及-80 ℃保 存24 h 以上凍融5 次后的檢測(cè)結(jié)果與初始濃度進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)血漿和溶血樣本經(jīng)上述冷凍處理后，IgE 濃度與初始濃度相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。血漿及溶血樣本中IgE 濃度在反復(fù)凍融后的檢測(cè)結(jié)果見表4。

表3 血漿及溶血樣本中IgE在-80 ℃冷凍保存1年后的檢測(cè)結(jié)果Tab. 3 Detection result of IgE in plasma and hemolyzed blood samples frozen at -80 ℃for 1 year（IU/mL）

表4 血漿及溶血樣本中IgE在反復(fù)5次凍融后的檢測(cè)結(jié)果Tab. 4 Detection result of IgE in plasma and hemolyzed blood samples after repeated freezing-thawing 5 cycles（n=10，IU/mL）

3 討 論

死后IgE 的檢測(cè)對(duì)過敏性休克死亡案例的鑒定具有一定的輔助作用，但對(duì)不同保存條件下的樣本穩(wěn)定性研究也僅見于針對(duì)臨床樣本的相關(guān)研究[5]。在死后生物化學(xué)檢測(cè)中，對(duì)于溶血樣本的保存和檢測(cè)也是重要的工作內(nèi)容之一。因此，本研究參照文獻(xiàn)[7]中針對(duì)死后樣本氨基末端腦鈉肽前體（N-terminal probrain natriuretic peptide，NT-proBNP）的穩(wěn)定性研究，對(duì)死后血漿及溶血樣本在不同保存條件下IgE 的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。由于樣本量的限制，本研究?jī)H納入5 例血漿和5 例溶血樣本，該樣本量雖不足以精確反映各時(shí)間點(diǎn)的降解情況，但是可以反映常見3 種保存條件下降解的總體趨勢(shì)，以期對(duì)實(shí)際工作的樣本保存起到一定的指導(dǎo)作用。本研究結(jié)果表明，死后血漿樣本中IgE 可保持相對(duì)穩(wěn)定，在3 種保存條件下穩(wěn)定性接近，28 d 時(shí)降解率均值在15%左右；而溶血樣本中IgE 較血漿樣本穩(wěn)定性差，降解率高于血漿樣本（P＜0.05），并且在25 ℃保存條件下最不穩(wěn)定，降解率高于4 ℃及-20 ℃保存條件（P＜0.05）。因此，對(duì)于溶血樣本，建議及時(shí)檢測(cè)，若需保存應(yīng)及時(shí)分離出血漿。

在實(shí)際工作中，當(dāng)樣本需要長(zhǎng)期保存時(shí)，一般會(huì)首選冷凍保存以減少樣本的降解，且一般認(rèn)為溫度越低降解越緩慢。本研究選擇-80 ℃的保存條件進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間冷凍保存。結(jié)果表明：死后血漿樣本在-80 ℃經(jīng)過1 年冷凍保存后IgE 濃度保持穩(wěn)定，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而溶血樣本在-80 ℃經(jīng)過1 年冷凍保存后則發(fā)生一定程度的降解，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。推測(cè)其原因，可能是在溶血后血細(xì)胞內(nèi)大量蛋白酶釋放[8]，雖然-80 ℃的低溫可在很大程度上降低其活性，但長(zhǎng)時(shí)間保存還是會(huì)造成IgE 的緩慢降解。

對(duì)IgE 的凍融穩(wěn)定性研究中，有學(xué)者[9]將狗血清反復(fù)凍融25 次并進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)狗血清中IgE 濃度保持穩(wěn)定；另有研究[10]將羊血清反復(fù)凍融15 次，也得到了相同的結(jié)論。上述研究初步證實(shí)了血清中IgE 的凍融穩(wěn)定性，本研究參照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)及臨床文獻(xiàn)中NT-proBNP 凍融穩(wěn)定性的處理方法[10-12]，對(duì)血漿和溶血樣本進(jìn)行3 種凍融處理以探究IgE 的凍融穩(wěn)定性。結(jié)果表明，無(wú)論是血漿樣本還是溶血樣本，經(jīng)-20 ℃保存40min凍融5次、-80℃保存30min凍融5次及-80℃保存24 h 以上凍融5 次這3 種凍融處理后，IgE 濃度保持穩(wěn)定，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），證明在死后樣本中，IgE 依舊具有良好的凍融穩(wěn)定性。由于條件所限，本研究未收集到符合條件的過敏性休克死亡案例，僅能依據(jù)一般死亡案例探討血液中IgE 的穩(wěn)定性，有待在今后的研究中擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。

綜上，死后血液樣本中IgE 具有良好的凍融穩(wěn)定性，可耐受5 次凍融循環(huán)。IgE 在死后血漿中可保持相對(duì)穩(wěn)定，并可在-80 ℃條件下長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定保存，但溶血樣本中IgE 穩(wěn)定性較差，建議及時(shí)檢測(cè)或分離血漿進(jìn)行保存。