林萍萍，安鵬天，史云鵬

（黃驊港海關(guān)，河北 滄州 061600）

近年來，隨著我國畜牧業(yè)的快速發(fā)展，改良品種，優(yōu)化牛類種群遺傳性能的需求日益增加，境外引種就成了重要途徑，其促進(jìn)我國養(yǎng)殖業(yè)和經(jīng)濟(jì)貿(mào)易發(fā)展的同時(shí)，也增加了疫病傳入的風(fēng)險(xiǎn)。加強(qiáng)進(jìn)境種牛檢驗(yàn)檢疫和監(jiān)管已成口岸動物檢疫面臨的重要課題，實(shí)驗(yàn)室疫病檢疫發(fā)揮著重要的作用。酶聯(lián)免疫（Enzyme-linked immunosorbnet assay，ELISA）是把抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性和酶的高效催化作用有機(jī)結(jié)合起來的一種檢測技術(shù)，原理是抗原或抗體吸附于固相載體進(jìn)行免疫酶反應(yīng)，經(jīng)底物顯色后用酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，由于待測譜物的含量與呈色物質(zhì)的顏色具有相關(guān)性，因此可以通過顏色的不同來達(dá)到定性定量分析待測樣品的目的。由于ELISA方法具有操作簡單、靈敏度高和特異性高等特點(diǎn)，并且適合批量樣品檢測，因此廣泛應(yīng)用于口岸進(jìn)境種牛疫病檢測。但實(shí)驗(yàn)室在實(shí)驗(yàn)操作過程中因諸多因素影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，即會出現(xiàn)一些假陽性或假陰性，因此，有必要深入分析其影響因素，并優(yōu)化方法規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確有效，把好國門生物安全，也為動物疫病檢測工作的開展提供依據(jù)，本文就種牛疫病ELISA 檢測的影響因素從“人員、設(shè)備、材料、方法和標(biāo)準(zhǔn)、環(huán)境”等多個(gè)方面進(jìn)行分析。

1 人為因素

實(shí)驗(yàn)室專業(yè)技術(shù)人員是開展動物疫病檢測的中心人員，是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素，因此要求從事相關(guān)工作的實(shí)驗(yàn)室人員要求必須具備較強(qiáng)的專業(yè)知識和熟練的操作技能。在種牛疫病ELISA 檢測實(shí)驗(yàn)中，血清樣品處理、移液器使用不當(dāng)、酶標(biāo)洗板的徹底程度等都會對結(jié)果造成直接的影響。為此，應(yīng)對實(shí)驗(yàn)人員定期組織開展業(yè)務(wù)培訓(xùn)考核、能力驗(yàn)證和人員比對等，持續(xù)保證實(shí)驗(yàn)人員熟悉實(shí)驗(yàn)操作流程和儀器設(shè)備的操作能力，以便保質(zhì)保量的完成動物疫病檢測工作。

2 設(shè)備因素

儀器設(shè)備的準(zhǔn)確度是進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢測最基本的要求，是影響檢測結(jié)果的直接因素之一。不同廠家儀器設(shè)備存在檢測性能的差異如洗板機(jī)，進(jìn)口的性能要高于國產(chǎn)，在洗板時(shí)洗出的徹底。為了確保檢測結(jié)果真實(shí)有效，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期對檢測儀器進(jìn)行計(jì)量檢定、維護(hù)，使用前進(jìn)行校準(zhǔn)，確保儀器可以正常運(yùn)行。

3 材料因素

3.1 樣品因素

待檢樣品的質(zhì)量是確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素，因此樣品要求新鮮和純凈。種牛疫病ELISA 實(shí)驗(yàn)一般采用種牛血清進(jìn)行檢測。

3.1.1 樣品采集及送檢 在采集樣品時(shí)，應(yīng)使用無菌采集針管，盡量避免反復(fù)顛倒，嚴(yán)防樣品溶血的產(chǎn)生，因樣品的溶血血紅蛋白中含有類過氧化物酶活性的亞鐵血紅素，在以辣根過氧化物酶（HRP）為標(biāo)記的ELISA 實(shí)驗(yàn)中，會增加非特異性顯色造成假陽性結(jié)果的產(chǎn)生，因此，應(yīng)盡量避免溶血，對嚴(yán)重溶血樣品需重新采樣。工作人員需要對采集的樣本進(jìn)行檢查，包括樣品質(zhì)量、數(shù)量、標(biāo)識、記錄等，避免出現(xiàn)樣品采集錯(cuò)誤。及時(shí)將樣品送往實(shí)驗(yàn)室檢測，血清樣品放置時(shí)間過長，易受細(xì)菌污染，而細(xì)菌體內(nèi)可能有內(nèi)源性HRP，出現(xiàn)非特異性顯色，造成假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。

3.1.2 樣品處理 分離血清需要注意幾點(diǎn)問題：分離血清時(shí)核對好樣品編號，樣品一式兩份，一份待檢樣品，一份留樣保存，血清可冷藏自然析出，也可離心析出，但需控制離心的速度和時(shí)間，過度離心會造成紅細(xì)胞破裂，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3.1.3 樣品保存 如不能及時(shí)檢測，應(yīng)將樣品冷藏或冷凍保存，盡量避免反復(fù)凍融，反復(fù)凍融會破壞樣品中的蛋白分子如抗體，造成假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。一般來說，一周之內(nèi)進(jìn)行檢測，將樣品存放在2～8℃即可，如因特殊原因需延時(shí)檢測，可將樣品及時(shí)分裝后放置于-20℃或-80℃冷凍保存。

3.2 試劑因素

3.2.1 試劑盒的選擇 選擇合適的試劑盒是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素。目前口岸種牛疫病檢測常用進(jìn)口試劑盒如IDVET、BIOVET、kernel 等，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明不同廠家的試劑盒由于采用的方法不同（競爭ELISA、阻斷ELISA、夾心ELISA等）檢測結(jié)果存在差異性。因此選購試劑盒時(shí)，需全面了解其技術(shù)參數(shù)、性能指標(biāo)，使用時(shí)注意試劑盒的有效期及保存溫度，如果保存不當(dāng)或使用過期試劑盒均會影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另外，同一廠家試劑盒不同批次之間不能混用，在其制作過程很難保證質(zhì)量完全一致，容易造成結(jié)果差異現(xiàn)象。

3.2.2 試劑盒的回溫 在實(shí)驗(yàn)過程中對試劑的準(zhǔn)備不太注意，經(jīng)常會出現(xiàn)試劑盒從冰箱剛拿出來就開始實(shí)驗(yàn)，會出現(xiàn)陽性對照、洗滌液等試劑沒有化開的現(xiàn)象，從而影響實(shí)驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間，其直接后果會導(dǎo)致對一些弱陽性樣品的檢測出現(xiàn)假陰性。因此在ELISA 實(shí)驗(yàn)開始前，最為關(guān)鍵的是將試劑盒提前從冰箱里拿出來，按說明書要求在室溫放置30min 至與室溫平衡，并避免陽光直射，其目的是使微孔內(nèi)的溫度能較快的達(dá)到后面測定的需求溫度。

4 方法和標(biāo)準(zhǔn)的因素

檢測方法、標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范和質(zhì)量控制程序及其相關(guān)計(jì)劃是也是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直接因素之一。檢測方法嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)技術(shù)規(guī)范進(jìn)行選擇，種牛疫病ELISA 檢測時(shí)應(yīng)遵循標(biāo)準(zhǔn)選擇相適宜的試劑盒，并定期對檢測流程和標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行修訂，避免在檢測過程中使用已作廢的方法進(jìn)行檢測，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制及其相關(guān)計(jì)劃是監(jiān)控檢測過程最有效的手段，按計(jì)劃進(jìn)行實(shí)驗(yàn)人員比對、留樣再測、測量審核等質(zhì)量控制，確保檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，在此過程中如出現(xiàn)異常，及時(shí)找出原因，并提出改進(jìn)的相關(guān)措施。適宜的檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)為實(shí)驗(yàn)人員能夠提供較好的理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)。

5 環(huán)境因素

實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的先決條件，即檢測過程所在的環(huán)境溫度、濕度及純潔度等，必須滿足國家相關(guān)的法律法規(guī)、技術(shù)規(guī)范或標(biāo)準(zhǔn)的要求。室溫對ELISA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響，室溫偏低會對樣品和試劑產(chǎn)生影響，導(dǎo)致反應(yīng)速度慢，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)過程中所用的物品及周邊環(huán)境受到污染，也會對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。對此，應(yīng)每周對實(shí)驗(yàn)室的溫濕度等相關(guān)記錄進(jìn)行查巡并實(shí)時(shí)記錄，定期對實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行清潔消毒，保證實(shí)驗(yàn)室環(huán)境滿足實(shí)驗(yàn)要求，消除其對實(shí)驗(yàn)室結(jié)果帶來的影響。

6 實(shí)驗(yàn)關(guān)鍵環(huán)節(jié)因素

6.1 加 樣

加樣是影響ELISA 結(jié)果的最常見的因素，樣品稀釋，嚴(yán)格按照不同試劑盒對樣品稀釋倍數(shù)規(guī)定進(jìn)行操作，其目的是減少非特異性反應(yīng)，所以在檢測過程中一定是先加稀釋液再加樣品，需要引起注意的是加樣后要在微量振蕩器上震蕩混勻30s，防止溢出。

在種牛疫病ELISA 初篩實(shí)驗(yàn)中，由于檢測量比較大，一般采用多通道微量移液器，使用多通道微量移液器需要注意幾點(diǎn)：正確使用，使用前調(diào)整移液器的加樣量；加樣速度不可過快，否則無法保證微量加樣的準(zhǔn)確度和均一性；避免將樣品加到反應(yīng)孔壁上，因?yàn)榭妆谏喜渴欠前粎^(qū)，易導(dǎo)致非特異性吸附，造成假陽性結(jié)果的出現(xiàn)；避免產(chǎn)生氣泡和濺出，氣泡會引起反應(yīng)界面差異，濺出會造成相鄰孔污染；避免槍頭碰觸到孔底部，并保持孔外底部潔凈，有利于酶標(biāo)儀檢測。移液器長時(shí)間使用會出現(xiàn)磨損或內(nèi)部附著血痂等原因造成加樣不準(zhǔn)確，因此有必要定期對移液器進(jìn)行維護(hù)和計(jì)量校準(zhǔn)。此外，樣品較多時(shí)應(yīng)分批檢測，避免加樣后溫育前等待時(shí)間超時(shí)。

6.2 溫 育

溫育是ELISA 檢測中最關(guān)鍵、也是最容易出現(xiàn)問題的環(huán)節(jié)。ELISA 實(shí)驗(yàn)中抗原抗體反應(yīng)必須保證一定的時(shí)間的溫育，且溫育所需要的時(shí)間一般與溫度成反比。種牛疫病檢測中最常用的溫度是37℃和室溫，溫度過高或溫育時(shí)間不夠，易造成弱陽性樣品漏檢情況。因此，在日常檢測過程中，要嚴(yán)格按試劑盒說明書控制溫育的時(shí)間和溫度，不能人為延長或縮短溫育時(shí)間，應(yīng)根據(jù)不同的室溫條件下及時(shí)調(diào)整溫箱的溫度，在溫箱放置溫濕度計(jì)來測量觀察即可。溫育時(shí)，需在酶標(biāo)板表面貼粘膜，防止孔內(nèi)液體蒸發(fā)或水珠等異物掉入孔內(nèi)引起污染。切記封板膜不能重復(fù)使用，以免引起交叉污染。

6.3 洗 板

洗板是ELISA 實(shí)驗(yàn)中操作次數(shù)最多的，是重要環(huán)節(jié)，應(yīng)引起實(shí)驗(yàn)人員的重視。洗板次數(shù)減少，洗板不徹底造成殘留，可能引起假陽性結(jié)果的產(chǎn)生，洗板次數(shù)過多，可能會洗脫掉抗原抗體結(jié)合物，引起看假陰性結(jié)果。無論是手工洗板還是洗板機(jī)洗板，要嚴(yán)格按照試劑盒說明書規(guī)定的洗滌次數(shù)、洗滌體積、洗滌時(shí)間進(jìn)行操作，不能人為改變洗板要求。在洗板的過程中，盡量保證操作標(biāo)準(zhǔn)，如避免洗板液過多溢出孔外，甩板要快速干凈，使用干凈的濾紙不在同一地方重復(fù)拍板等，操作的準(zhǔn)確與非直接影響檢測結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。

7 結(jié)語

口岸進(jìn)境動物檢驗(yàn)檢疫的核心任務(wù)就是防止危險(xiǎn)性疫病疫情傳入國內(nèi)，控制動物疫病跨境傳播和擴(kuò)散，保障我國養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)安全、動物生命和人民的身體健康，做好口岸動物疫病檢驗(yàn)檢疫工作尤為重要。ELISA 自建立以來，由于其自身的優(yōu)勢被廣泛應(yīng)用于海關(guān)、獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室、科研單位等，但實(shí)驗(yàn)過程中有諸多因素影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，應(yīng)對其原因進(jìn)行深入分析，及時(shí)進(jìn)行整改。首先要保證實(shí)驗(yàn)室環(huán)境設(shè)施和儀器設(shè)備處于良好狀態(tài)，其次，實(shí)驗(yàn)涉及的試劑及檢測方法必須標(biāo)準(zhǔn)化，及時(shí)更新檢測標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)規(guī)范，另外實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員須定期培訓(xùn)，加強(qiáng)業(yè)務(wù)學(xué)習(xí)，提高專業(yè)技能，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)室規(guī)章要求進(jìn)行樣品的檢測，在一次又一次的實(shí)踐中對這些關(guān)鍵環(huán)節(jié)進(jìn)行探索和優(yōu)化，認(rèn)真避免或減少影響因素，盡量避免假陽性和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，提升口岸動物疫病的檢驗(yàn)檢疫技術(shù)水平，確保數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，從而保障國內(nèi)養(yǎng)殖業(yè)健康和可持續(xù)發(fā)展。