曹丹 湯小芳 李敏慧

南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州市第二人民醫(yī)院產(chǎn)科（江蘇常州213000）

子癇前期是一種妊娠中晚期潛在的多系統(tǒng)性疾病，它是引起圍產(chǎn)期孕婦早產(chǎn)、死產(chǎn)、死胎的重要病因，嚴重的威脅了5% ～14%孕婦的健康［1］。子癇前期特征是妊娠20 周后出現(xiàn)高血壓并伴有蛋白尿和其他系統(tǒng)性疾病，如腎衰竭，肝功能異常，子宮內(nèi)生長受限，子宮胎盤功能不全等［2-3］。臨床治療過程中常伴有不良的妊娠結(jié)局，并且該病造成的嚴重并發(fā)癥對母嬰具有深遠的影響［4］。目前，子癇前期的發(fā)病機制尚未明確，研究［5］表明絨毛外滋養(yǎng)層細胞侵襲失調(diào)與子癇前期的發(fā)生密切相關(guān)。因此，深入探究子癇前期的發(fā)病機制，從而尋求新的治療手段具有重要意義。

MicroRNA（miRNA）是一類長度為22～25 個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA，在生長發(fā)育、增殖、凋亡和炎癥、腫瘤及多種系統(tǒng)性疾病等生理病理過程起到調(diào)節(jié)作用。多種miRNAs 在子癇前期患者的妊娠胎盤組織中差異表達，其可能通過調(diào)控多種基因表達介導(dǎo)滋養(yǎng)細胞功能發(fā)生變化，從而在子癇前期的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用［6］。有研究者通過miRNA 表達譜分析發(fā)現(xiàn)miR-155-5p 在子癇前期患者胎盤組織中顯著失調(diào)，表明miR-155-5p可能在子癇前期中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，有望成為子癇前期診斷和治療的標(biāo)志物［7］。LEE 等［8］研究證實Sirt1 可能通過調(diào)節(jié)Akt/p38MAPK 信號通路參與絨毛外滋養(yǎng)層細胞侵襲和螺旋動脈重構(gòu)，從而與胎盤發(fā)育有關(guān)。然而，目前關(guān)于miR-155-5p 與Sirt1 對子癇前期發(fā)病的影響和致病機制尚未明確。

因此，本研究通過檢測子癇前期患者胎盤組織中miR-155-5p 和Sirt1 的表達水平，首次探究miR-155-5p 和Sirt1 在子癇前期發(fā)病過程中的調(diào)控機制，旨在為子癇前期的發(fā)病機制研究和臨床治療提供新的思路和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本來源2018年1-12月期間，選擇本院婦產(chǎn)科收治的子癇前期患者和正常孕婦樣本各25 例。排除了患有雙胎妊娠、慢性高血壓、腎臟疾病、糖尿病、胎兒畸形和急性或慢性肝炎的患者。子癇前期診斷標(biāo)準(zhǔn)參考第九版《婦產(chǎn)科學(xué)》［9］，正常妊娠者和子癇前期患者的臨床資料為：對照組妊娠者年齡（27.2 ± 3.6）歲，BMI（25.9 ± 1.3）kg/m2，終止妊娠孕周（38.9±0.7）周，收縮壓（112.8±3.5）mmHg，舒張壓（73.8 ± 2.8）mmHg；子癇前期妊娠者年齡（28.9 ± 3.9）歲，BMI（26.2 ± 1.5）kg/m2，終止妊娠孕周（36.2 ± 0.4）周，收縮壓（158 ± 4.1）mmHg，舒張壓（105 ± 3.2）mmHg。兩組年齡、BMI 和妊娠孕周方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。兩組收縮壓和舒張壓比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。所有的患者都采用剖腹產(chǎn)的方式。子癇前期胎盤組織取自25 例患者，正常妊娠者的胎盤組織取自25 例孕周正常的妊娠者。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)同意，所有納入研究的個體均簽署書面知情同意書，本研究遵循《赫爾辛基宣言》。

1.2 主要試劑和儀器滋養(yǎng)層細胞系HTR-8/SVeno細胞（中國科學(xué)院細胞庫）；RPMI 1640 培養(yǎng)基和胎牛血清（美國Hyclone 公司）；總RNA 抽提Trizol 試劑（美國Life 科技公司）；LipofectamineTM2000（美國Invitrogen 公司）；miRNA-155-5p mimics 和miRNA-155-5p negative control（吉瑪生物技術(shù)有限公司）；SYBR qRT-PCR Super Mix（上海翌圣生物科技有限公司）；BCA 試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Sirt1、GAPDH 和山羊抗兔二抗（中國賽默飛世爾科技有限公司）；細胞培養(yǎng)箱（蘇州凈化設(shè)備制造廠）；實時熒光定量PCR 儀（瑞士Roche公司）。

1.3 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染滋養(yǎng)層細胞系HTR-8/SVeno培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、100 μg/mL 鏈霉素和100 U/mL 青霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基中。置于37 ℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。miR-155-5p mimics、Sirt1 siRNA 以及它們各自的陰性對照購自Gene Pharma（中國上海）。按照說明書，使用Lipofectamine 2000 試劑進行滋養(yǎng)層細胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后不同分組細胞在37 ℃5% CO2條件下培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)RNA 和蛋白相關(guān)檢測實驗。

1.4 RT-qPCR 分析用TRIzol 試劑提取胎盤組織和HTR-8/SVeno 細胞的總RNA。用Q5000（Quawell Technology，美國）測量提取的RNA 的濃度和純度。然后通過逆轉(zhuǎn)錄酶試劑獲得cDNA。 使用Light Cycler 96 儀器（Roche，巴塞爾，瑞士）進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）檢測miR-155-5p 和Sirt1 mRNA水平。取PCR上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板cDNA 1 μL，2×Taq Master Mix 10 μL，RNase free water 7 μL 配置成總體積為20 μL 的反應(yīng)體系。使用實時熒光定量PCR 儀進行PCR 擴增，兩步法程序為：94 ℃2 min（預(yù)變性），94 ℃10 s（變性）、60 ℃30 s（退火）、72 ℃30 s（延伸），共35個循環(huán)。qPCR 中使用的引物見表1。 通過2-ΔΔCt比較方法檢測的miR-155-5p 和Sirt1 mRNA 相對表達水平。

表1 RT-qPCR 中使用的引物序列Tab.1 Primer sequences used in RT-qPCR

1.5 傷口愈合實驗將轉(zhuǎn)染后的HTR-8/SVeno 細胞用胰蛋白酶消化后重懸，稀釋至細胞濃度為5×105個/mL，吸取1 mL接種于6孔板中，放置在37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞長滿后，用無菌的10 μL槍頭在6 孔板中央輕輕劃過，接著用滅菌的PBS 清洗細胞，加入2 mL 無血清培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在0、24 h 時分別用光學(xué)顯微鏡下進行觀察并拍照。

1.6 Transwell檢測細胞侵襲將轉(zhuǎn)染后的HTR-8/SVeno 細胞用胰酶消化，加入無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基制備成濃度為3×105個/mL 的細胞懸液，吸取200 μL 細胞懸液加入Transwell 上室，下室每孔加入600 μL 含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基，放入37 ℃5% CO2細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取出Transwell 小室，用棉簽擦去上層未遷移的細胞，滅菌的PBS 清洗三次，4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色15 min。顯微鏡下觀察，每孔隨機選取5 個視野拍照并計數(shù)，這些視野中細胞的平均值為Transwell 小室細胞遷徙的細胞數(shù)目。

1.7 Western blot 檢測用RIPA 裂解液提取胎盤組織和HTR-8/SVeno 細胞的總蛋白，BCA 試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品與6×SDS 蛋白上樣緩沖液混勻后煮沸10 min。取變性蛋白40 μg/每孔上樣至10%SDS-PAGE 凝膠中進行電泳分離蛋白，將分離的蛋白樣品200 mA 恒流電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。轉(zhuǎn)膜后，將PVDF 膜放入含5%脫脂奶粉的封閉液中封閉2 h，接著加入稀釋好的Sirt1、MMP-2、MMP-9、GAPDH（1∶1 000）一抗，4 ℃孵育過夜。用TBST 洗膜3 次，每次10 min。隨后，加入稀釋的山羊抗兔二抗（1∶2 000）室溫下孵育1 h。再次用TBST 洗膜3次，按照ECL試劑盒說明書配制發(fā)光液，加ECL 發(fā)光液將PVDF 膜均勻覆蓋，用Bio-Rad 成像儀顯影，Image J 軟件分析條帶的灰度值，以GADPH 為內(nèi)參進行定量的分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，所有實驗均重復(fù)3 次，所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異采用單因素方差分析并進行t檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子癇前期患者胎盤組織中miR-155-5p及Sirt1的表達通過RT-qPCR 檢測胎盤組織中miR-155-5p 和Sirt1 mRNA 水平，結(jié)果表明與正常患者相比，子癇前期患者的胎盤中miR-155-5p 的表達水平顯著增加（圖1A），而Sirt1 mRNA 水平明顯降低（圖1B），見表2 。子癇前期患者中miR-155-5p 和Sirt1 mRNA呈負相關(guān)（r=-0.636 6，P=0.016 9），見圖1C。進一步進行蛋白質(zhì)免疫印跡實驗，結(jié)果顯示，與正常組相比，子癇前期組中Sirt1 蛋白水平降低（P＜0.01），見圖1D。

圖1 miR-155-5p 和Sirt1 在子癇前期患者胎盤組織中的變化Fig.1 Changes of miR-155-5p and Sirt1 in placenta tissue of patients with pre-eclampsia

表2 樣本miR-155-5p 和Sirt1 mRNA 表達比較Tab.2 Comparison of miR-155-5p and Sirt1 mRNA expression in samples ±s

表2 樣本miR-155-5p 和Sirt1 mRNA 表達比較Tab.2 Comparison of miR-155-5p and Sirt1 mRNA expression in samples ±s

組別對照子癇前期t 值P 值miR-155-5p 0.88±0.09 3.14±0.19 10.49＜0.000 1 Sirt1mRNA 0.69±0.04 0.36±0.03 6.89＜0.000 1

2.2 miR-155-5p 抑制Sirt1 的表達通過miR-155-5p 轉(zhuǎn)染HTR-8/SVneo 細胞，然后采用RT-qPCR 檢測miR-155-5p 的表達水平。miR-155-5p mimics 組中miR-155-5p表達水平比miR-155-5p mimics NC組中顯著升高（圖2A）。見表3。另外，通過RT-qPCR和Western blot 檢測Sirt1 的mRNA 和蛋白在miR-155-5p 過表達模型中的表達情況。結(jié)果顯示，Sirt1 mRNA 水平在miR-155-5p mimics 組中明顯低于mimics NC 組（圖2B），見表3，并且Sirt1 的Western blot 結(jié)果與它的mRNA 變化趨勢一致。另外，相對于mimics NC 組，MMP-2 和MMP-9 的表達 在miR-155-5p mimics 組中顯著增加（圖2C、D）。見表4。

圖2 在HTR-8/SVneo 細胞中過表達miR-155-5p 對Sirt1 的影響Fig.2 Effects of over-expression of miR-155-5p on Sirt1 in HTR-8/SVneo cells

表3 miR-155-5p mimics 轉(zhuǎn)染效率檢測Tab.3 Detection of miR-155-5p mimics transfection efficiency±s

表3 miR-155-5p mimics 轉(zhuǎn)染效率檢測Tab.3 Detection of miR-155-5p mimics transfection efficiency±s

組別miR-155-5pSirt1 mRNA mimics NC1.06±0.091.02±0.05 mimics t 值P 值3.25±0.14 12.83＜0.001 0.51±0.05 7.16 0.002

表4 蛋白免疫印跡分析Sirt、MMP-2和MMP-9蛋白的表達Tab.4 Western blot analysis of Sirt，MMP-2 and MMP-9 protein expression ±s

表4 蛋白免疫印跡分析Sirt、MMP-2和MMP-9蛋白的表達Tab.4 Western blot analysis of Sirt，MMP-2 and MMP-9 protein expression ±s

組別Sirt1MMP-2MMP-9 mimics NC0.62±0.090.28±0.020.22±0.03 mimics t 值P 值0.42±0.0.05 3.57 0.020 0.38±0.02 2.83 0.047 0.31±0.05 2.82 0.048

2.3 miR-155-5p 抑制滋養(yǎng)層細胞侵襲和遷移為了進一步闡明miR-155-5p 在滋養(yǎng)細胞中的功能，通過Transwell 侵襲試驗確定miR-155-5p 對滋養(yǎng)層細胞侵襲的影響，mimics NC 組單位面積滋養(yǎng)細胞的侵襲數(shù)量（41.85 ± 5.41）個，而miR-155-5p mimics 組的侵襲細胞數(shù)目為（18.84 ± 1.54）個，顯著高于mimics NC 組（P＜0.01），見圖3A。通過傷口愈合試驗測定miR-155-5p 對滋養(yǎng)層細胞遷移的影響，24 h 后mimics NC 組細胞劃痕閉合率為0 h 的（80.64 ± 6.68）%，mimics 組為（20.08 ± 1.25）%，顯著低于mimics NC 組（P＜0.01），見圖3B。以上結(jié)果說明miR-155-5p 的過表達顯著抑制滋養(yǎng)層細胞的侵襲和遷移能力。

圖3 miR-155-5p 抑制滋養(yǎng)層細胞侵襲和遷移Fig.3 miR-155-5p inhibits trophoblast cell invasion and migration

2.4 敲除Sirt1抑制滋養(yǎng)層細胞侵襲和遷移為了進一步驗證Sirt1對滋養(yǎng)層細胞侵襲和遷移的影響，使用Sirt1 siRNA 敲除Sirt1 的表達。通過RT-qPCR和Western blot 檢測Sirt1 敲除效率表明siRNA NC組中Sirt1 mRNA 的相對水平為（1.12 ± 0.14），siRNA Sirt1 組為（0.32 ± 0.08），遠低于siRNA NC 組（P＜0.01，圖4A）；siRNA Sirt1 同樣地抑制Sirt1 蛋白的表達（圖4B）。通過Transwell 侵襲實驗和傷口愈合實驗發(fā)現(xiàn)，siRNA NC 組單位面積內(nèi)侵襲細胞數(shù)目為（52.82 ± 4.16）個，siRNA Sirt1 組為（24.65±2.24）個，顯著低于siRNA NC 組（P＜0.01，圖4C）；siRNA NC組傷口閉合率為（78.82±6.16）%，siRNA sirt1 組傷口閉合率為（30.92±2.56）%，遠低于siRNA NC 組（P＜0.01，圖4D）。上述結(jié)果表明敲除Sirt1 顯著降低滋養(yǎng)細胞的侵襲和遷移能力。

3 討論

子癇前期屬于妊娠期高血壓疾病的一種，是妊娠期特有的疾病，嚴重影響母嬰安全［10］，其發(fā)病機制尚未明確，但近幾十年來其發(fā)病機制研究已經(jīng)取得了很大進展。目前，多數(shù)研究結(jié)果表明子癇前期的發(fā)生與滋養(yǎng)細胞侵襲異常、內(nèi)皮細胞功能障礙、血管生成失衡等過程密切相關(guān)［11］。其中，絨毛外滋養(yǎng)層細胞侵襲失調(diào)會導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生［8］。正常情況下，子宮胎盤動脈被血管內(nèi)滋養(yǎng)細胞侵襲，并重塑成擴張的，無彈性的管，而不受母體的血管舒縮控制。但是滋養(yǎng)細胞侵襲失調(diào)時會出現(xiàn)重構(gòu)障礙與維持高子宮胎盤血管阻力和宮內(nèi)生長受限，這些與子癇前期有關(guān)［12-13］。本研究站在滋養(yǎng)細胞異常侵襲的角度，闡述失調(diào)的miR-155-5p 調(diào)控滋養(yǎng)細胞侵襲、遷移的潛在機制。

圖4 敲除Sirt1 抑制滋養(yǎng)層細胞侵襲和遷移Fig.4 Knockdown Sirt1 inhibits trophoblast cell invasion and migration

有研究對子癇前期患者的胎盤和血清的miRNA 進行高通量測序分析，鑒定出多種差異化表達的miRNA（miR-155、miR-210、miR-1233、miR-520），推測這些異常表達的miRNA 可能通過調(diào)控多種靶基因的表達，破壞胎盤的正常發(fā)育及其功能，參與子癇前期的發(fā)病［7，14-15］。miR-155 在子癇前期患者的胎盤和血清中均表達下降［7］，其有望作為子癇前期的預(yù)后和診斷的潛在標(biāo)志物。本研究通過RT-qPCR 檢測子癇前期患者胎盤組織，發(fā)現(xiàn)子癇前期患者中miR-155-5p 表達顯著升高。有研究［16-17］證實，在B 細胞發(fā)育過程中，miR-155 靶向Sirt1 參與B 細胞惡性腫瘤的發(fā)生。而且，miR-155 參與調(diào)控多種癌癥的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲和轉(zhuǎn)移［18-19］。然而，在子癇前期中miR-155-5p 與Sirt1 的聯(lián)系少有報道。本研究通過RT-qPCR 證實，子癇前期患者胎盤中miR-155-5p 表達顯著升高而Sirt1 降低，表明miR-155-5p 與Sirt1 可能參與子癇前期的發(fā)病過程。而且本研究結(jié)果顯示miR-155-5p 的表達與Sirt1 表達呈負相關(guān)，提示子癇前期患者體內(nèi)較高水平的miR-155-5p 可能調(diào)控Sirt1 的表達參與子癇前期的發(fā)生。

滋養(yǎng)層細胞侵襲受到多樣途徑和多種因子調(diào)節(jié)，其中沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Sirt1）參與調(diào)控過程。Sirt1 是NAD+依賴的蛋白質(zhì)脫乙酰酶家族和營養(yǎng)傳感器的成員。 Sirt1 最初在萌芽的釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)，是一種能夠調(diào)節(jié)壽命的基因，首先被鑒定為組蛋白脫乙?；?，促進染色質(zhì)緊實并因此在營養(yǎng)缺乏時沉默基因組［20］。到目前為止，已經(jīng)研究證實了該組蛋白脫乙?；傅脑S多非組蛋白靶標(biāo)，包括p53、FOXO1 和PPARγ［21］。值得注意的是，Sirt1 被報道參與調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡、自噬和炎癥等生理活動［22-23］。有研究［24］發(fā)現(xiàn)Sirt1 缺乏都會導(dǎo)致Epcam +滋養(yǎng)層祖細胞的積累。本研究發(fā)現(xiàn)過表達miR-155-5p 可以降低Sirt1、MMP2 和MMP9 蛋白表達，抑制滋養(yǎng)層細胞遷移和侵襲。當(dāng)敲除Sirt1 時，滋養(yǎng)層細胞遷移和侵襲的能力同樣地被抑制。這表明Sirt1 與滋養(yǎng)層細胞侵襲密切相關(guān)。

本研究僅初步探討了miR-155-5p 對滋養(yǎng)層細胞遷移和侵襲的作用機制，不足之處在于研究局限于細胞水平，而未進行體內(nèi)實驗。本課題組在下一步的研究中會探究miR-155-5p 在小鼠子癇前期模型上的調(diào)控作用，為miR-155-5p 參與調(diào)控子癇前期的發(fā)病機制提供更有力的證據(jù)。綜上所述，在子癇前期患者胎盤組織中miR-155-5p 表達升高和Sirt1 表達降低可能與子癇前期發(fā)病相關(guān)，miR-155-5p 可能通過抑制Sirt1 表達調(diào)節(jié)滋養(yǎng)層細胞的遷移和侵襲從而影響子癇前期的發(fā)病進程。另外，子癇前期患者胎盤組織中高表達的miR-155-5p 可作為子癇前期的預(yù)后和診斷的潛在標(biāo)志物，而Sirt1 可能成為子癇前期的治療靶點。