鄭銳哲 毛旻韜 楊西濤 劉玉梅

1上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院（上海200336）；2上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院（上海201999）

創(chuàng)傷性顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問題，TBI 的發(fā)生率約為5000 萬人次/年［1-2］。由于世界上大約一半的人口在其一生中可能經(jīng)歷一次或多次TBI，TBI 成為當(dāng)今社會(huì)最主要的致殘及致死性疾病之一，帶來嚴(yán)重的家庭及社會(huì)負(fù)擔(dān)。TBI 發(fā)生后，腦組織發(fā)生一系列變化，包括線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎癥損傷反應(yīng)，而這些病理變化會(huì)進(jìn)一步加重腦組織損傷［3-9］。而炎癥損傷、細(xì)胞凋亡等已成為TBI 發(fā)生進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)。如何有效阻止TBI后的炎癥損傷、細(xì)胞凋亡等二次損傷對(duì)TBI 后神經(jīng)保護(hù)及功能恢復(fù)具有重要意義。

輔酶Q10（CoQ10）是有氧氧化呼吸鏈中不可或缺的電子傳遞體，其作為細(xì)胞內(nèi)不可或缺的內(nèi)源性親脂抗氧化劑，調(diào)控著線粒體的功能發(fā)揮［10-12］。有研究表明：CoQ10 對(duì)腦缺血再灌注損傷、阿爾茨海默?。ˋD）、帕金森病（PD）及亨廷頓?。℉D）等神經(jīng)退行性疾病起到一定的治療作用，這得益于其對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而增強(qiáng)線粒體的能量代謝的治療效果［12-15］。然而，針對(duì)于CoQ10 對(duì)TBI 后腦組織的保護(hù)作用的研究甚少。因此，本研究擬采用TBI 小鼠作為研究對(duì)象，通過給予不同劑量的CoQ10 干預(yù)，評(píng)估其神經(jīng)行為學(xué)得分，檢測(cè)腦組織中TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥因子的水平、凋亡蛋白Bcl-2、Bax 和c-Caspase3 蛋白以及軸突再生蛋白GAP43 的表達(dá)情況，來探討CoQ10 對(duì)TBI 小鼠潛在的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑雄性C57 小鼠均為8 ～10 周，體質(zhì)量20 ～25 g，購(gòu)買自上海南方模式生物研究中心。CoQ10 購(gòu)自衛(wèi)材（中國(guó)）藥業(yè)有限公司；反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR 試劑盒購(gòu)于TaKaRa 公司。實(shí)驗(yàn)所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 分組及給藥小鼠隨機(jī)分為4 組：假手術(shù)組（sham）、創(chuàng)傷性顱腦損傷組（TBI）、CoQ10 低劑量組（LDG）和高劑量組（LHQ）。LDG 和HDG 組于造模后予以灌胃給藥，劑量分別為10 mg/（kg·d）和30 mg/（kg·d），連續(xù)給予1 周。

1.3 模型建立本實(shí)驗(yàn)選用經(jīng)典的控制性腦皮質(zhì)損傷（CCI）小鼠模型［16］，具體步驟如下：腹腔注射5%水合氯醛（0.01 mL/g）對(duì)入組小鼠進(jìn)行麻醉，隨后將其固定于立體定向儀上，于無菌條件下作正中切口切開小鼠頭皮，無菌鑷分離頭皮后采用骨膜剝離子剝離骨膜；采用電鉆在人字縫與右側(cè)冠狀縫之間、中線旁開2 mm 處進(jìn)行顱骨鉆孔，骨窗大小約為徑3 mm，暴露出完整的硬腦膜；采用精細(xì)顱骨撞擊儀設(shè)定打擊參數(shù)（打擊時(shí)間均為100 ms；打擊深度1.5 mm；打擊速度均為1.5 m/s）。打擊后對(duì)小鼠進(jìn)行骨瓣還納入，最后縫合小鼠頭皮。本研究中的假手術(shù)組小鼠在去除骨瓣后不進(jìn)行打擊，其余處理同手術(shù)組。為減少操作差異性帶來的誤差，腹腔內(nèi)藥物注射及TBI 建模均由同一操作者進(jìn)行。

1.4 Western blot 實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射水合氯醛麻醉藥后，即斷頭取腦，顯微鏡下分離出損傷側(cè)皮層組織，加入預(yù)冷的含有蛋白酶抑制劑PMSF 的細(xì)胞裂解液RIPA，冰上超聲時(shí)間為2 min，隨后12 000× g 離心后取上清液，采用分光光度計(jì)進(jìn)行蛋白濃度定量。取8 μg 的蛋白樣品進(jìn)行10% SDS-PAGE 電泳，之后濕轉(zhuǎn)至PVDF 膜，采用5%脫脂奶粉封閉此PVDF 膜1 h。加入一抗4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜3 次后，加入相應(yīng)二抗，隨后進(jìn)行孵育1 h；在TBST 洗膜3 次后，采用ECL 化學(xué)發(fā)光法顯色，同時(shí)采用Tanon 4500 自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)掃描并分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)中所用一抗如下：兔Bax 抗體（1∶1 000 稀釋，美國(guó)CST，貨號(hào)14796）、小鼠Bcl-2 抗體（1∶1 000 稀釋，美國(guó)CST 公司，貨號(hào)15071），兔Cleaved Caspase-3 抗體（1∶500 稀釋，美國(guó)CST 公司，貨號(hào)9664），兔單克隆GAP4 抗體（1∶1 000 稀釋，美國(guó)abcam 公司，貨號(hào)ab75810）。所用二抗均購(gòu)于碧云天生物技術(shù)有限公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠（1∶2 000稀釋，貨號(hào)A0216）及山羊抗兔（1∶2 000 稀釋，貨號(hào)A0208）。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用TRIzol 法提取各組皮層組織總RNA 后，采用NanoDrop 對(duì)RNA 的濃度及質(zhì)量測(cè)定。取2 μg RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)在Thermo RT-qPCR 儀進(jìn)行。操作步驟說明如下：每個(gè)反應(yīng)設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量擴(kuò)增曲線測(cè)得目的基因及內(nèi)參基因的Ct 值，用GAPDH 標(biāo)準(zhǔn)化目的基因的表達(dá)水平，通過2-△△Ct法分析，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。實(shí)驗(yàn)中所用引物序列設(shè)計(jì)如下：TNF-α：正向（GGAACACGTCGTGGGATAATG），反向（GGCAGACTTTGGATGCTTCTT）、IL-6：正向（TCTATA-CCACTTCACAAGTCGGA），反向（GAATTGCCATTGCACAACTCTTT）、IL-1β：正向（GCAACTGTTCCTGAACTCAACT），反向（ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT）、GAPDH：正向（AGGTCGGTGTGAACGGATTTG），反向（TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA）。

1.6 改良神經(jīng)功能缺損評(píng)分在CCI 損傷后的1、3、7、14 d 采用改良的神經(jīng)功能缺損評(píng)分表（modified neurological severity scores，mNSS）對(duì)小鼠進(jìn)行功能評(píng)定，具體包括行走測(cè)試、感覺實(shí)驗(yàn)、提尾實(shí)驗(yàn)、平衡木實(shí)驗(yàn)、反射缺失和不正常運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)。

1.7 轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)（Rota-Rod test）在CCI損傷后14 d對(duì)小鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)功能評(píng)估。具體如下：將損傷后的小鼠置于測(cè)試儀器上，首先給予30 s 的時(shí)間適應(yīng)，然后啟動(dòng)轉(zhuǎn)棒式疲勞儀，讓小鼠在轉(zhuǎn)速為5 r/min 的轉(zhuǎn)棒上爬行90 s。隨后調(diào)整轉(zhuǎn)速為16 r/min，同時(shí)完成記時(shí)，采用紅外裝置監(jiān)測(cè)小鼠從轉(zhuǎn)棒的跌落，同時(shí)自動(dòng)停止記時(shí)，最后記錄小鼠在轉(zhuǎn)桿上運(yùn)動(dòng)的具體時(shí)間，以及小鼠第一次從轉(zhuǎn)棒上跌落的時(shí)間（潛伏期）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Quantity one 軟件處理Western blot 結(jié)果，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤顯示，使用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件包作統(tǒng)計(jì)分析，多組間進(jìn)行用單因素方差分析，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CoQ10 可降低TBI 后炎癥因子的表達(dá)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法檢測(cè)CoQ10 對(duì)TBI 后炎癥因子表達(dá)的影響。結(jié)果顯示：與Sham 相比，TBI 組炎癥指標(biāo)TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥因子表達(dá)明顯上調(diào)（P＜0.001）；與TBI 組相比，LDG 組和HDG 組的TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥因子表達(dá)顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），見圖1。

圖1 Real-time PCR 檢測(cè)不同組小鼠皮層組織中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β 的mRNA 水平Fig.1 Evaluating the mRNA levels of TNF-α，IL-6 and IL-1β in cortex of mice in different groups by Real-time PCR

2.2 CoQ 可抑制TBI 后細(xì)胞凋亡與Sham 組相比，TBI 組Bax 和c-Cas3 蛋白表達(dá)顯著增加，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，同時(shí)Bcl-2/Bax 比率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。與TBI 組相比，LDG組和HDG組Bax和c-Cas3蛋白表達(dá)顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著增加，同時(shí)Bcl-2/Bax 比率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），提示低劑量或高劑量CoQ 均能改善凋亡蛋白的表達(dá)，阻止細(xì)胞凋亡，見圖2、3。

2.3 CoQ10可上調(diào)TBI后神經(jīng)再生蛋白GAP43的表達(dá)CoQ10 處理組（LDG 和HDG）GAP43 mRNA及蛋白表達(dá)量較TBI 組顯著增加（P＜0.001），見圖4。

圖2 Western blot 檢測(cè)各組Bcl-2、Bax 蛋白表達(dá)水平Fig.2 Detecting the protein levels of Bcl-2 and Bax in different groups by Western blot

圖3 Western Blot 檢測(cè)各組c-Caspase3 蛋白表達(dá)水平Fig.3 Detecting c-Caspase3 protein level in different groups by Western blot

2.4 CoQ10 處理可部分改善TBI 后神經(jīng)功能改良神經(jīng)功能損傷評(píng)分（mNSS）結(jié)果顯示：與TBI 組相比，CoQ10 治療可以明顯降低腦外傷CCI 造模后7 和14 d 的mNSS 評(píng)分?jǐn)?shù)值，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，效果逐漸明顯；而且HDG 組小鼠mNSS 評(píng)分改善更加明顯。轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TBI 后CoQ10 處理組小鼠在轉(zhuǎn)棒上停留的時(shí)間相對(duì)TBI 小鼠延長(zhǎng)（P＜0.001），見圖5。

圖4 Real-time PCR 及Western Blot 檢測(cè)各組GAP43 蛋白表達(dá)水平Fig.4 The mRNA and protein levels of GAP43 in different groups were detected by Real-time PCR and Western Blot

圖5 CoQ10 可降低TBI 后mNSS 評(píng)分、增加TBI 小鼠的轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)時(shí)間Fig.5 Treatment with CoQ10 can reduce the mNSS score and increase the time in Rota-Rod test

3 討論

在TBI 損傷后的腦組織存在復(fù)雜的變化，其主要受到氧化應(yīng)激反應(yīng)、線粒體功能障礙、細(xì)胞凋亡及炎癥損傷、鈣超載、自由基增多和脂質(zhì)過氧化等多種作用機(jī)制的調(diào)控［3-8］。由于腦組織中的不飽和脂肪酸含量相對(duì)豐富，導(dǎo)致其極易發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并且腦組織中的抗氧化酶含量少，加重了其損傷的程度［3-8］。大量證據(jù)［3-4，7-8］表明，神經(jīng)炎癥是TBI 后繼發(fā)性腦損傷的重要因素，TBI 后出現(xiàn)的一系列炎癥反應(yīng)：如單核細(xì)胞增多、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及淋巴細(xì)胞減少，在繼發(fā)性腦損傷過程中起重要作用［3，7］。此外，腦組織中炎癥細(xì)胞的聚集，進(jìn)而誘發(fā)炎癥因子的釋放，更進(jìn)一步的加重了腦損傷［3，7，17］。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，TNF-α 和白細(xì)胞介素（主要IL-6、IL-8、IL-1β等）是與腦損傷相關(guān)的炎性因子［3，7，17］。TNF-α主要由神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在應(yīng)激性過程中產(chǎn)生［3，7，17］，其在腦損傷加重的過程中起重要作用。有研究表明，CoQ10 可以通過降低腦組織的TNF-α的水平，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞［18］。本研究結(jié)果顯示，CoQ10 不僅顯著降低腦組織中TNF-α ，而且降低IL-1β、IL-6 的表達(dá)，表明CoQ10 可減少炎癥細(xì)胞釋放炎癥因子，進(jìn)而對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起保護(hù)作用。

TBI 后，過度的氧化應(yīng)激反應(yīng)及炎癥損傷可誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，最終導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙的發(fā)生［18］。在此過程中，Bax 基因作為促進(jìn)凋亡的核心基因，其表達(dá)主要通過促使細(xì)胞色素C 穿越線粒體內(nèi)膜，激活caspase 的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用［19-20］；而Bcl-2 基因則是抑制凋亡的核心基因，其表達(dá)主要通過與Bax 基因結(jié)合形成異源性二聚體，實(shí)現(xiàn)對(duì)Bax 基因的抑制作用，進(jìn)而抑制進(jìn)一步的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，抑制Bax 基因的促凋亡活性［19-21］。實(shí)際情況下，Bax 基因與Bcl-2 基因的表達(dá)比例實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在接受信號(hào)刺激后的結(jié)局為生存/死亡的精準(zhǔn)調(diào)控。此外，Caspase-3 基因在上述神經(jīng)細(xì)胞凋亡的極聯(lián)反應(yīng)通路中位居核心，其表達(dá)與激活決定了凋亡的信號(hào)通路的傳導(dǎo)［20，22］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TBI 后腦組織中Bcl-2/Bax 基因比率下調(diào)，呈現(xiàn)損傷后凋亡激活，而給予CoQ10后，Bcl-2基因表達(dá)明顯升高、Bax 及c-Caspase3 基因表達(dá)顯著降低，Bcl-2/Bax 比率顯著升高，這表明CoQ10 可抑制凋亡信號(hào)，具有神經(jīng)保護(hù)作用。

過度的炎癥激活不僅可導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡，也能阻礙神經(jīng)可塑性，不利于軸突生長(zhǎng)［4，8，23］。而神經(jīng)細(xì)胞的存活及神經(jīng)再生是神經(jīng)功能康復(fù)的基礎(chǔ)。本研究發(fā)現(xiàn)CoQ10 可上調(diào)神經(jīng)再生標(biāo)記物GAP43，表明CoQ10 可改善神經(jīng)再生能力。一方面可能是殘存的神經(jīng)元增多所致；一方面可能是抑制炎癥損傷后，改善神經(jīng)損傷后的微環(huán)境有利于神經(jīng)再生所致。通過行為學(xué)評(píng)估TBI 小鼠的神經(jīng)功能情況，發(fā)現(xiàn)CoQ10 可部分改善TBI 后的神經(jīng)功能障礙，這一結(jié)果可能是因?yàn)槠鋵?duì)炎癥損傷的抑制及細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。

綜上所述，TBI 后CoQ10 處理可減少TBI 后腦組織中炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)而減低細(xì)胞凋亡，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞再生及部分神經(jīng)功能康復(fù)，對(duì)防治TBI后的繼發(fā)性腦損傷可能具有良好的應(yīng)用前景，但此類作用的定量機(jī)制及關(guān)聯(lián)效應(yīng)有待更進(jìn)一步研究，總之，這一理論依據(jù)為臨床TBI 治療策略的優(yōu)化提供了新契機(jī)。