劉細(xì)幫 胡旭鋼 唐夏莉 陳清勇

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）是肺癌最常見(jiàn)的病理亞型，患者5年平均生存率僅為15%[1-2]。盡管近年來(lái)診斷和治療方法不斷改進(jìn)，但LUAD患者的總體生存率并未提高。因此，有必要尋找新的預(yù)后生物標(biāo)志物，這不僅有助于改善個(gè)體化治療，還能為開(kāi)發(fā)新的治療靶點(diǎn)提供參考。胞質(zhì)分裂蛋白調(diào)節(jié)因子1（protein regulator of cytokinesis 1，PRC1）基因位于人體15號(hào)染色體上（15q26.1），編碼含有620個(gè)氨基酸的蛋白；屬于微管相關(guān)蛋白家族，參與細(xì)胞有絲分裂和細(xì)胞周期調(diào)控[3]。研究發(fā)現(xiàn)，PRC1 是乳腺癌[4]、膀胱癌[5]、肝細(xì)胞癌[6]和胃癌[7]等腫瘤的致癌因子，并且PRC1的表達(dá)與LUAD細(xì)胞的增殖、侵襲和凋亡相關(guān)，可能是LUAD潛在的治療靶點(diǎn)[8-9]。但目前PRC1對(duì)LUAD患者總體預(yù)后影響的相關(guān)研究較少。本研究旨在通過(guò)對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù)的挖掘，分析PRC1 mRNA表達(dá)水平與LUAD患者總體預(yù)后的相關(guān)性，探討其作為L(zhǎng)UAD預(yù)后標(biāo)志物的可行性，為今后有關(guān)PRC1的機(jī)制研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 PRC1數(shù)據(jù)的獲取 33種腫瘤數(shù)據(jù)來(lái)自腫瘤免疫評(píng)估資源（tumor immune estimation resource,TIMER）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cistrome.shinyapps.io/timer/），通過(guò) Diff Exp模塊檢索PRC1在腫瘤組織與正常對(duì)照組織中的表達(dá)情況。通過(guò)腫瘤基因圖譜（the cancer genome atlas,TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://portal.gdc.cancer.gov/）獲取 PRC1表達(dá)的RNASeq數(shù)據(jù)，獲得的數(shù)據(jù)中包含517例原發(fā)性LUAD患者和59例正常肺組織，其中504例LUAD患者記錄了生存數(shù)據(jù)，并以PRC1 mRNA表達(dá)的中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。利用基因表達(dá)綜合（gene expression omnibus,GEO）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）分別下載包含LUAD組織及正常對(duì)照組織或癌旁正常組織的基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集GSE31210、GSE75037和 GSE68465，其中 GSE31210、GSE68465 數(shù)據(jù)集各包含226、362例LUAD患者完整的臨床資料以及生存信息，并以PRC1 mRNA表達(dá)的中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。同時(shí)，從人類(lèi)蛋白質(zhì)圖譜（human protein atlas,HPA）數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.proteinatlas.org/）獲取腫瘤以及正常對(duì)照組織中PRC1蛋白免疫組化染色數(shù)據(jù)。

1.2 基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）采用GSEA 4.0進(jìn)行分析。根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中PRC1 mRNA表達(dá)的中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，以Hallmark基因集作為參考基因集，通過(guò)GSEA分析PRC1參與LUAD發(fā)展的可能機(jī)制，設(shè)置置換次數(shù)為1 000次，以P＜0.05、錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate,FDR）＜0.25為顯著富集基因集。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用R 3.6和GraphPad 8.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)；多組比較采用單因素方差分析。生存曲線分析采用Kaplan-Meier法，組間比較采用log-rank檢驗(yàn)。采用R軟件ROC的時(shí)間序列分析（timeROC）包繪制ROC曲線并計(jì)算AUC值。Cox回歸模型分析PRC1與LUAD患者總生存期（overall survival,OS）、無(wú)進(jìn)展生存期（progression-free survival,PFS）的關(guān)系，并計(jì)算HR值及其95% CI。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織中PRC1 mRNA表達(dá) 在TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)提供的33種腫瘤數(shù)據(jù)中，膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma,BLCA）、乳腺浸潤(rùn)癌（breast invasive carcinoma,BRCA）、膽管癌（cholangiocarcinoma,CHOL）、結(jié)腸癌（colon adenocarcinoma,COAD）、食管癌（esophageal carcinoma,ESCA）、頭頸鱗狀細(xì)胞癌（head and neck squamous cell carcinoma,HNSC）、腎嫌色細(xì)胞癌（kidney chromophobe,KICH）、腎透明細(xì)胞癌（kidney renal clear cell carcinoma,KIRC）、乳頭狀腎細(xì)胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma,KIRP）、肝細(xì)胞肝癌（liver hepatocellular carcinoma,LIHC）、LUAD、肺鱗癌（lung squamous carcinoma,LUSC）、胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma,PRAD）、直腸腺癌（rectum adenocarcinoma,READ）、胃癌（stomach adenocarcinoma,STAD）、甲狀腺癌（thyroid car－cinoma,THCA）、子宮內(nèi)膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma,UCEC）17種腫瘤組織中PRC1 mRNA表達(dá)水平均高于正常對(duì)照組織，見(jiàn)圖1。

圖1 腫瘤組織中胞質(zhì)分裂蛋白調(diào)節(jié)因子1（PRC1）表達(dá)

2.2 LUAD組織和正常對(duì)照組織中PRC1的表達(dá) 在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和GSE31210數(shù)據(jù)集中，LUAD組織中PRC1 mRNA表達(dá)水平均明顯高于正常對(duì)照組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01），見(jiàn)圖2a-b。在GSE75037數(shù)據(jù)集中，LUAD組織中PRC1 mRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見(jiàn)圖2c。在HPA數(shù)據(jù)庫(kù)中，PRC1免疫組化染色結(jié)果顯示，PRC1蛋白在正常對(duì)照組織中弱表達(dá)，而在LUAD組織中強(qiáng)表達(dá)，見(jiàn)圖2d-e。

圖2 肺腺癌（LUAD）組織和正常對(duì)照組織中胞質(zhì)分裂蛋白調(diào)節(jié)因子1（PRC1）的表達(dá)[a-b：腫瘤基因圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)、GSE31210數(shù)據(jù)集中LUAD組織和正常對(duì)照組織中PRC1 mRNA表達(dá)水平比較，與正常對(duì)照組織比較，**P＜0.01；c：GSE75037數(shù)據(jù)集中LUAD組織和癌旁正常組織中PRC1 mRNA表達(dá)水平比較，與癌旁正常組織比較，**P＜0.01；d-e：正常對(duì)照組織和LUAD組織中PRC1蛋白表達(dá)的比較，免疫組化染色，×40]

2.3 PRC1 mRNA表達(dá)水平與LUAD患者臨床特征的關(guān)系 通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)PRC1 mRNA表達(dá)水平與LUAD患者的年齡、M分期均無(wú)關(guān)（均P＞0.05），但與LUAD患者的性別、吸煙、T分期、N分期和TNM分期均有關(guān)（均P＜0.01），見(jiàn)表1。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中不同臨床特征LUAD患者PRC1表達(dá)水平比較

2.4 PRC1 mRNA表達(dá)與LUAD預(yù)后的關(guān)系

2.4.1 PRC1 mRNA表達(dá)與OS和PFS的關(guān)系 在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)、GSE31210和GSE68465數(shù)據(jù)集中，通過(guò)Kaplan-Meier生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，除GSE68465數(shù)據(jù)集中的PFS外，其余PRC1高表達(dá)組患者PFS和OS均差于低表達(dá)組（均 P＜0.05），見(jiàn)圖 3（插頁(yè)）。

圖3 胞質(zhì)分裂蛋白調(diào)節(jié)因子1（PRC1）表達(dá)與總生存期（OS）和無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）的關(guān)系[a-b：腫瘤基因圖譜（TCGA）中PRC1高表達(dá)組與低表達(dá)組OS和PFS生存曲線比較；c-d:GSE31210數(shù)據(jù)集中PRC1高表達(dá)組與低表達(dá)組OS和PFS生存曲線比較；e-f:GSE68465數(shù)據(jù)集中PRC1高表達(dá)組與低表達(dá)組OS和PFS生存曲線比較]

2.4.2 影響LUAD患者預(yù)后的臨床特征分析 在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，ROC曲線模型的OS顯示，1、3、5年生存率AUC值分別為0.674、0.632、0.590；ROC曲線模型的PFS顯示，1、3、5年生存率 AUC 值分別為 0.611、0.583、0.506，見(jiàn)圖4a-b。單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示LUAD患者的性別、年齡和吸煙與OS均無(wú)關(guān)（均P＞0.05），但T分期、N分期、TNM分期和PRC1 mRNA表達(dá)水平與OS均有關(guān)（均P＜0.05）；單因素Cox回歸分析結(jié)果顯示LUAD患者的性別、年齡、TNM分期和吸煙與PFS均無(wú)關(guān)（均P＞0.05），但T分期、N分期和PRC1 mRNA表達(dá)水平均與PFS均有關(guān)（均P＜0.05）。將以上所有單因素納入多因素Cox回歸分析顯示，T分期、N分期和PRC1 mRNA表達(dá)水平均是影響LUAD患者OS和PFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（均P≤0.05），見(jiàn)圖4c-f。

圖4 影響肺腺癌（LUAD）患者預(yù)后的臨床特征分析[a-b：腫瘤基因圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中總生存期（OS）和無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）的ROC曲線；c-d：TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中OS單因素和多因素Cox分析；e-f：TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中PFS單因素和多因素Cox分析]

2.5 GSEA識(shí)別與PRC1相關(guān)的信號(hào)通路 為了確定PRC1作用的潛在信號(hào)通路，在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中，GSEA分析結(jié)果顯示，PRC1高表達(dá)樣本富集在有絲分裂紡錘體、G2M檢查點(diǎn)、E2F信號(hào)通路、DNA修復(fù)等基因集中，見(jiàn)圖5。

圖5 基因集富集分析（GSEA）識(shí)別與胞質(zhì)分裂蛋白調(diào)節(jié)因子1（PRC1）相關(guān)的信號(hào)通路

3 討論

細(xì)胞周期是哺乳動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育所必需的進(jìn)化保守過(guò)程，因?yàn)榧?xì)胞周期畸變是癌癥的標(biāo)志[10]。PRC1被認(rèn)為是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）底物，在早期細(xì)胞分裂中，是維持紡錘體中段所需的微管相關(guān)蛋白[11-12]。細(xì)胞分裂是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及復(fù)雜的生化和細(xì)胞動(dòng)力學(xué)因素[10]，而PRC1作為細(xì)胞分裂的關(guān)鍵蛋白，其表達(dá)異?？梢鸺?xì)胞分裂的紊亂。研究表明，PRC1的過(guò)表達(dá)通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，并與早期復(fù)發(fā)和患者預(yù)后不良相關(guān)[6]。敲除PRC1可顯著抑制胃癌細(xì)胞增殖，減少胃癌細(xì)胞克隆形成并抑制其侵襲和遷移[7]。但是，目前PRC1在肺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制方面的研究較少，尤其是與患者臨床預(yù)后生存及標(biāo)志物篩查的研究鮮有報(bào)道。

本研究中，筆者通過(guò)對(duì)多個(gè)大樣本數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，PRC1的表達(dá)水平在包括LUAD在內(nèi)的多種腫瘤組織中上調(diào)，LUAD組織中PRC1表達(dá)也明顯高于正常對(duì)照組織和癌旁正常組織；且免疫組化結(jié)果提示，LUAD組織中PRC1蛋白表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組織。在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)和GSE68465數(shù)據(jù)集中，PRC1表達(dá)與腫瘤的T分期、N分期和TNM分期均有關(guān)，提示PRC1可能參與LUAD的進(jìn)展?；诙鄠€(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的生存分析結(jié)果，表明PRC1 mRNA表達(dá)水平與LUAD患者的PFS、OS呈負(fù)相關(guān)，其表達(dá)水平越高，LUAD患者預(yù)后越差。并且該結(jié)果與Bu等[13]研究結(jié)果類(lèi)似，該研究發(fā)現(xiàn)在卵巢癌組織PRC1呈高表達(dá)，并且PRC1的表達(dá)與生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。

單因素及多因素Cox回歸分析顯示，T分期、N分期和PRC1 mRNA表達(dá)水平均是影響LUAD患者的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。為了進(jìn)一步探討PRC1在LUAD中的潛在功能，GSEA分析結(jié)果表明，在有絲分裂紡錘體、G2M檢查點(diǎn)、E2F信號(hào)通路、DNA修復(fù)等通路高度富集。G2M檢查點(diǎn)能在DNA損傷的情況下阻止細(xì)胞周期，使細(xì)胞在進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞周期階段前修復(fù)DNA損傷，從而維持基因組完整性[14]。因此，PRC1過(guò)表達(dá)時(shí)可能通過(guò)影響細(xì)胞周期和DNA修復(fù)，從而促進(jìn)LUAD細(xì)胞的增殖分化。CDK-RB-E2F軸是細(xì)胞周期進(jìn)程的核心轉(zhuǎn)錄機(jī)制，該軸的一個(gè)或多個(gè)關(guān)鍵組成部分的變化幾乎發(fā)生在所有腫瘤中，并導(dǎo)致致癌E2F活性增強(qiáng)，使腫瘤細(xì)胞增殖不受控制，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展[15]。而PRC1作為CDK底物，過(guò)表達(dá)時(shí)可能促進(jìn)該軸的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)一步增加E2F活性，導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展。由此可見(jiàn)，PRC1可能參與LUAD發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，可能是LUAD治療的潛在靶點(diǎn)。

綜上所述，PRC1基因在LUAD中可能是一個(gè)潛在的致癌基因。PRC1在LUAD中的表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及患者的預(yù)后有著非常密切的關(guān)系，可作為一個(gè)重要的候選生物標(biāo)志物。因此，有必要對(duì)該基因在LUAD中的機(jī)制以及功能進(jìn)一步研究，為全面掌握PRC1在腫瘤中的作用以及LUAD的預(yù)防診治提供更多依據(jù)。