李秋璇，郭玥盺，華嶸暄， 首都醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)“5+3一體化”專業(yè)北京市 100069

尚宏偉， 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實驗中心 北京市 100069

李利生， 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實驗中心 北京市 100069

徐敬東， 北京市首都醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)與病理生理學(xué)系 北京市 100069

0 引言

隨著腸道與機(jī)體其他臟器之間的健康與疾病之間的相關(guān)性日益受到關(guān)注，許多疾病的起源于腸道的猜想引起廣大醫(yī)務(wù)工作者的高度重視.然而，目前仍有一些問題無法解決.M細(xì)胞作為腸道上皮屏障重要的組成，其生物學(xué)特性以及與機(jī)體的健康關(guān)系近年來成為研究的熱點.

1922年日本科學(xué)家Kenzaburo Kumagai首次發(fā)現(xiàn)并報道了濾泡關(guān)聯(lián)上皮(follicle-associated epithelium，F(xiàn)AE)部位的抗原內(nèi)化;由于研究技術(shù)的羈絆，在經(jīng)歷了漫長的過程后，于1972年由美國科學(xué)家Robert Owen借助掃描電鏡在人類派氏結(jié)(Peyer’s patches，PPs)發(fā)現(xiàn)了一種形態(tài)上不同于周圍上皮細(xì)胞的特殊細(xì)胞.這種細(xì)胞表面沒有豐富的微絨毛，而是有許多“微褶皺”，基底膜內(nèi)陷呈“囊袋狀”.因此，將它命名為微褶皺細(xì)胞(microfold cell，M cell)[1].大量的研究表明M細(xì)胞來源于腸隱窩Lgr5+干細(xì)胞，其分化和成熟是多途徑分子機(jī)制的調(diào)控，其中核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)和S100A4蛋白尤為重要.RANKL缺乏會導(dǎo)致M細(xì)胞分化障礙，導(dǎo)致幼稚M細(xì)胞增加;而S100A4缺乏會導(dǎo)致成熟M細(xì)胞的缺乏[2].由于M細(xì)胞在腸道免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，它既能轉(zhuǎn)運抗原，又是病原體進(jìn)入機(jī)體的入口.而成熟M細(xì)胞缺乏，導(dǎo)致腸道抗原轉(zhuǎn)運受阻，從而無法啟動腸道免疫應(yīng)答.最新研究表明M細(xì)胞與多種疾病有密切關(guān)系.本綜述從生物學(xué)角度和免疫學(xué)角度闡述M細(xì)胞的作用，并就其與疾病的相關(guān)性進(jìn)行闡述.

1 M細(xì)胞的生物學(xué)特性

腸相關(guān)淋巴組織(gut associated lymphoid tissue，GALT)分為兩部分，有結(jié)構(gòu)的組織粘膜濾泡和彌漫淋巴組織[3].粘膜濾泡是免疫誘導(dǎo)區(qū)，是免疫應(yīng)答的淋巴傳入?yún)^(qū);彌漫淋巴組織是免疫應(yīng)答的淋巴傳出區(qū)[4].免疫誘導(dǎo)區(qū)包括PPs、腸系膜淋巴結(jié)(msenteric Lymph Node，MLN)、孤立淋巴濾泡等腸道淋巴組織.PPs由FAE、上皮下圓頂(sub-epithelium dome，SED)和B細(xì)胞濾泡(B cells follicle)組成[5].M細(xì)胞主要存在于FAE，同時M細(xì)胞在支氣管相關(guān)淋巴組織(bronchial-associated lymphoid tissue，BALT)和鼻咽相關(guān)淋巴組織(nasopharyngeal lymphoid tissue，NALT)分布.

圖1 腸道環(huán)境中M細(xì)胞示意圖.M細(xì)胞來源于腸隱窩Lgr5+干細(xì)胞，基底膜內(nèi)陷，呈“囊袋狀”.GP2是M細(xì)胞成熟的標(biāo)志蛋白分子.樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌IL-15，IL-15可促進(jìn)B細(xì)胞增殖分化.腸腔內(nèi)有細(xì)菌存在，可通過M細(xì)胞進(jìn)入人體.左下角是RANK和RANKL結(jié)合的分子模式圖.GP2:糖蛋白2；IL-15:白細(xì)胞介素-15；RANK:核因子κB受體活化因子；RANKL:核因子κB受體活化因子配體.

M細(xì)胞基底膜內(nèi)陷，形成“M細(xì)胞囊袋(M cell pocket)”，凹陷處包含著樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)、淋巴細(xì)胞等免疫相關(guān)細(xì)胞[6](圖1).“M細(xì)胞囊袋”是M細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志.“囊袋”結(jié)構(gòu)減少了M細(xì)胞攝取抗原、轉(zhuǎn)運抗原的距離，提高了轉(zhuǎn)運和吞吐抗原作用的效率.腔內(nèi)抗原可以被快速轉(zhuǎn)運至M細(xì)胞基底膜，并遞送至DCs，觸發(fā)腸道免疫反應(yīng)[7].相較于其他腸上皮細(xì)胞，M細(xì)胞溶酶體活性較低，所以腸腔抗原信息可以完整的轉(zhuǎn)運至DCs.DCs通過三種途徑進(jìn)行免疫應(yīng)答，DCs將抗原繼續(xù)呈遞至T細(xì)胞、B細(xì)胞;負(fù)載抗原的DCs通過淋巴引流，直接進(jìn)入MLN;DCs借助M細(xì)胞在腔內(nèi)直接捕獲抗原[8，9]，這種方式更加快捷，在腸道的速發(fā)型的免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用.由于M細(xì)胞表面存在高度糖基化、可以被凝集素靶向識別的區(qū)域[10]，荊豆凝集素-1(ulex europaeus agglutinin 1，UEA-1)可以和M細(xì)胞頂端表面的α胞頂端巖藻糖殘基特異性結(jié)合;唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素(Siglec)中的Siglec-F可以特異性靶向與M細(xì)胞結(jié)合[11].M細(xì)胞表面表達(dá)病原體識別受體(pathogen recognition receptors，PRR)，腸道病原體可以和PRR結(jié)合，以達(dá)到靶向M細(xì)胞的作用.M細(xì)胞表面還表達(dá)糖蛋白2(glycoprotein 2，GP2)，GP2可和細(xì)菌外膜Ⅰ型菌毛尾端的黏附素FimH特異性結(jié)合[12].FAE中的M細(xì)胞可以根據(jù)GP2的表達(dá)特點分為兩種亞型，一種是高表達(dá)GP2的M細(xì)胞，另一種是低表達(dá)或不表達(dá)GP2的M細(xì)胞[13].高表達(dá)GP2的M細(xì)胞可攝取腸腔抗原，低表達(dá)或不表達(dá)GP2的M細(xì)胞幾乎不攝取腸腔內(nèi)抗原.通過免疫組化技術(shù)證實Spi-B和Sox8分子表達(dá)之后在細(xì)胞膜上出現(xiàn)GP2+蛋白.在GP2-/-或GP2low/-小鼠發(fā)現(xiàn)，M細(xì)胞的正常形態(tài)或功能受損.由此可見GP2+的M細(xì)胞是成熟的、功能性的M細(xì)胞的標(biāo)志[6].重組人同種異體移植炎癥因子1(allograft inflammatory fator 1，Aif1)表達(dá)于被排斥的移植心臟上，F(xiàn)AE的M細(xì)胞也表達(dá)Aif1[14].與野生型小鼠相比，Aif1-/-小鼠FAE區(qū)域M細(xì)胞攝取轉(zhuǎn)運抗原能力下降，但幼稚M細(xì)胞的分化不受影響.β1整合素(integrin beta-1，ITGB1)在M細(xì)胞膜上表達(dá)，也是小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Y.enterocolitica)的受體[15]，然而Aif1-/-小鼠中ITGB1明顯減少，提示ITGB1表達(dá)與Aif1相關(guān)[14].同時，研究證實ITGB1還有促進(jìn)細(xì)胞粘附，連通細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的作用，是內(nèi)外環(huán)境溝通的“橋梁”[14].由此可見，ITGB1是M細(xì)胞發(fā)揮抗原呈遞功能的生物學(xué)標(biāo)志.綜上所述，UEA-1、Siglec-F、GP2、ITGB1均是M細(xì)胞的生物學(xué)標(biāo)志.由于M細(xì)胞表面有多種生物學(xué)標(biāo)志，由此可見M細(xì)胞具有復(fù)雜的生物學(xué)功能.

2 M細(xì)胞分化的分子機(jī)制

M細(xì)胞源于腸隱窩Lgr5+干細(xì)胞[16]，RANKL在GALT的SED大量存在，是由M細(xì)胞誘導(dǎo)(M-cell inducer，Mci)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子[17]，Mci細(xì)胞是高度表達(dá)膜結(jié)合型RANKL的上皮下間質(zhì)細(xì)胞.RANKL是Ⅱ型膜結(jié)合蛋白，是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族中的一員，可以和NF-κB受體活化因子(receptor activator of NF-κB，RANK)相結(jié)合[18].RANKL可以被金屬蛋白酶裂解[19]，其分布廣泛，在骨骼肌、胸腺、肝臟、結(jié)腸、小腸、腎上腺等組織均表達(dá)[20].M細(xì)胞分化主要通過兩條途徑調(diào)控，非經(jīng)典NF-κB通路和經(jīng)典NF-κB通路.

非經(jīng)典NF-κB通路是由RANKL和RANK結(jié)合啟動[21].RANKL和RANK結(jié)合后激活NF-κB誘導(dǎo)激酶(NF-κB-inducing kinase，NIK)，促進(jìn)p52/RelB蛋白的表達(dá).實驗發(fā)現(xiàn)，選擇性敲除Mci細(xì)胞上的膜結(jié)合型RANKL后，F(xiàn)AE區(qū)域幼稚M細(xì)胞無法發(fā)育成熟;Nik-/-小鼠缺乏成熟的M細(xì)胞.以上研究證明，非經(jīng)典NF-κB通路是M細(xì)胞成熟的必須途徑.同時，腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TNF receptor associated factor 6，TRAF6)是經(jīng)典NF-κB通路所必須的[22].在類器官培養(yǎng)系統(tǒng)中，用RANKL處理腸道類器官時，GP2表達(dá)上調(diào).TRAF6-/-小鼠PPs中M細(xì)胞的完全喪失，腸道抗原攝取轉(zhuǎn)運障礙[22].P50/RelA蛋白的表達(dá)可以促進(jìn)P52/RelB蛋白表達(dá)，P50/RelA蛋白和P52/RelB蛋白均可促進(jìn)Marcksl1 mRNA和Anxas蛋白的表達(dá)[22].以上研究結(jié)果提示，經(jīng)典NF-κB通路對M細(xì)胞分化發(fā)育不可或缺，并且通過多條途徑間接影響非經(jīng)典NF-κB通路.實驗表明，轉(zhuǎn)錄因子Spi-B缺乏時，Ccl9、Tnfaip2和Gp2無法正常表達(dá)，但Marksl1和Anxa5仍可正常表達(dá)[23]，轉(zhuǎn)錄因子Spi-B或Sox8二者缺其一時，GP2+M細(xì)胞未能檢測到;當(dāng)二者同時缺乏時，GP2+M細(xì)胞缺乏;只有Spi-B和Sox8同時正常表達(dá)，GP2+M細(xì)胞才能正常表達(dá).由此可見，Spi-B和Sox8對GP2+M細(xì)胞的分化與成熟不可或缺(如圖2所示).

研究表明富含溶菌酶的樹突狀細(xì)胞、先天淋巴細(xì)胞可以合成S100A4蛋白.S100A4蛋白是由人類S100A4基因編碼的蛋白質(zhì)，存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，參與細(xì)胞發(fā)育和分化的調(diào)控，在細(xì)胞運動、侵襲和微管蛋白聚合中發(fā)揮作用[24].DOCK8基因定位于人類9號染色體p24.3，其編碼的DOCK8蛋白可激活Rho-GTP酶，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，尤其是肌動蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控、影響細(xì)胞遷移活動.研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)缺乏DOCK8時，S100A4+細(xì)胞數(shù)量減少，S100A4減少會導(dǎo)致M細(xì)胞成熟障礙.腸道類器官系統(tǒng)培養(yǎng)中腸隱窩Lgr5+干細(xì)胞可以被誘導(dǎo)分化成M細(xì)胞，使用S100A4后幼稚M細(xì)胞減少，而成熟M細(xì)胞增加;DOCK-/-小鼠S100A4含量顯著下降，幼稚M細(xì)胞無法分化成熟，導(dǎo)致攝取轉(zhuǎn)運腸腔內(nèi)抗原能力下降[2].推測S100A4是調(diào)控M細(xì)胞成熟的重要的因子，通過S100A4-RelB-SOX8通路調(diào)控M細(xì)胞的成熟[2](如圖2所示).

圖2 M細(xì)胞分化的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分子機(jī)制圖.RANKL是M細(xì)胞分化的重要信號分子，非經(jīng)典通路和經(jīng)典通路均與之相關(guān).S100A4蛋白是調(diào)控M細(xì)胞成熟的重要環(huán)境因子，可通過S100A4-RelB-SOX8通路，和RANKL共同調(diào)控M細(xì)胞的成熟.RANKL:核因子κB受體活化因子配體.

3 M細(xì)胞與免疫應(yīng)答

M細(xì)胞的抗原攝取作用對特異性免疫應(yīng)答至關(guān)重要.研究表明[25]，RANK-/-小鼠缺乏成熟M細(xì)胞，導(dǎo)致抗原攝取障礙和PPs中杯狀細(xì)胞(goblet cell，GC)減少，腸道固有層的免疫球蛋白A(immunoglobulin A，IgA)陽性B細(xì)胞減少，腸道中s-IgA含量下降[25].與RANK-/-小鼠相似，SOX8-/-小鼠IgA含量也減少，但I(xiàn)gA含量較RANK-/-小鼠減少程度更輕.在葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)模型和敗血癥小鼠模型中，NIK-/-小鼠缺乏成熟M細(xì)胞，IgA和白細(xì)胞介素17(interleukin17，IL-17)含量下降，IgA和IL-17含量下降會增加小鼠對UC和敗血癥的易感性[21]，提示M細(xì)胞和IgA、IL-17的分泌有關(guān)，M細(xì)胞相關(guān)的IgA、IL-17可以預(yù)防小鼠UC和敗血癥的發(fā)生.除此之外，M細(xì)胞的抗原攝取作用還有助于誘導(dǎo)全身性抗原特異性IgG反應(yīng).因此，M細(xì)胞不僅在腸道免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用，在全身免疫反應(yīng)中也至關(guān)重要.

圖3 M細(xì)胞分化與成熟過程中重要的分子標(biāo)志與模式圖.成熟M細(xì)胞由腸隱窩Lgr5+干細(xì)胞分化而來.Marckls1，Anxa5是早期的生物學(xué)標(biāo)志，Spi-B，Sox8都表達(dá)后，GP2表達(dá)，GP2是M細(xì)胞成熟標(biāo)志.Tnfaip2，CCL9在GP2之前表達(dá).GP2:糖蛋白2.

4 M細(xì)胞與疾病

M細(xì)胞不僅可以啟動腸道免疫應(yīng)答，還是病原體入侵機(jī)體的門戶.M細(xì)胞與許多疾病的發(fā)生都密切相關(guān)，這與它特殊的“囊袋狀”結(jié)構(gòu)有關(guān).該結(jié)構(gòu)提高了M細(xì)胞攝取、轉(zhuǎn)運抗原的效率，同時也給病原體提供了侵襲人體的入口.結(jié)核病、朊蛋白病和克羅恩病(Crohn’s disease，CD)的發(fā)生都與M細(xì)胞密切相關(guān).結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis，Mtb)和朊病毒將M細(xì)胞作為入侵機(jī)體的靶點，CD患者免疫系統(tǒng)紊亂的加劇與M細(xì)胞有關(guān).

4.1 M細(xì)胞與結(jié)核病 過去一直認(rèn)為結(jié)核病開始于Mtb侵入肺泡巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞，但是這種觀點缺乏數(shù)據(jù)支持.目前研究證實在活動性結(jié)核病病例中，大約10%只有頸部淋巴竇(cervical lymph nodes，cLN)感染，無肺部感染，這表明活動性結(jié)核病可能不需要肺部感染，因此肺部感染可能不是必須的[26].這個疑惑困擾著許多臨床醫(yī)務(wù)工作者.

眾所周知，Spi-B?/?小鼠GALT和NALT的成熟M細(xì)胞數(shù)量減少.給Spi-B?/?小鼠和WT小鼠分別接種相同劑量Mtb，7 d后發(fā)現(xiàn)，相較于野生型小鼠，Spi-B?/?小鼠cLN中的Mtb更少;WT小鼠和Spi-B?/?小鼠肺部都未檢測到Mtb[26].由此可見，成熟M細(xì)胞減少會抑制Mtb的轉(zhuǎn)運和擴(kuò)散.為了探究WT小鼠M細(xì)胞受抑制后，Mtb的轉(zhuǎn)運擴(kuò)散是否會受到抑制，使用WT小鼠注射抗小鼠RANKL單克隆抗體IK22-5，并且接種同等劑量的Mtb，發(fā)現(xiàn)cLN中Mtb數(shù)量只有開始接種的一半.由此推測，通過IK22-5抑制M細(xì)胞成熟可抑制Mtb從NALT向cLN擴(kuò)散.因此，可以推斷出M細(xì)胞是Mtb入侵機(jī)體的門戶，這對于疫苗的研究也有著重大的意義，成為目前疫苗研究開發(fā)的熱點，受到科研工作者的關(guān)注[26].

4.2 M細(xì)胞與朊蛋白病 朊蛋白病是一種人類和多種動物均可患的傳染性退行性腦病，感染因子是朊病毒.宿主細(xì)胞正常朊蛋白(PrPC)的一級結(jié)構(gòu)和朊蛋白(PrPSc)一級結(jié)構(gòu)相同，PrPC錯誤折疊后轉(zhuǎn)變?yōu)镻rPSc，而且PrPSc會促使PrPC轉(zhuǎn)變成PrPSc[27].朊病毒病包括庫魯病(Kuru disease)、克雅氏綜合癥(Ceutzfeldt-jakob disease，CJD)、格斯特曼綜合癥(Gustman syndrome，GSS)及致死性家庭性失眠癥(fatal family insomnia，F(xiàn)FI).有研究表明M細(xì)胞是朊病毒從腸腔侵入PPs和各個器官的重要目標(biāo)靶點.使用抗小鼠RANKL單克隆抗體處理IK22-5小鼠后，幼稚M細(xì)胞無法發(fā)育成熟[28].實驗動物口腔暴露朊病毒一段時間后，對照組PPs、MLNs和脾臟中檢測到大量PrPSc;而M細(xì)胞缺如的實驗組PPs、MLNs和脾臟中未檢測到PrPSc.341 d后，對照組小鼠死于朊蛋白病;454 d之前，實驗組小鼠均未出現(xiàn)朊病毒感染相關(guān)癥狀[28].上述實驗表明，M細(xì)胞的消除可阻止朊病毒的入侵和播散，阻止朊病毒對腦的損害.因此，腸道M細(xì)胞與朊病毒病原體的運輸和侵入人體有關(guān)[29].目前普遍認(rèn)為M細(xì)胞是朊病毒入侵機(jī)體的靶點，但也成為研究和預(yù)防朊蛋白病的重要靶點.

4.3 M細(xì)胞與克羅恩病 CD是炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)的一種.CD患者的固有免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)紊亂，有研究表明[30]，40%病人體內(nèi)出現(xiàn)胰腺自身抗體，而自身抗體的抗原恰恰是胰腺腺泡中的GP2.胰腺可以合成并分泌GP2，因此胰腺腺泡細(xì)胞中存在大量GP2，GP2還會隨著胰液進(jìn)入腸腔[31].腸道免疫系統(tǒng)功能紊亂可能會促進(jìn)GP2抗體的產(chǎn)生[32].炎癥性腸病產(chǎn)生炎癥性細(xì)胞因子，炎癥性細(xì)胞因子與M細(xì)胞的發(fā)育和功能密切相關(guān).炎癥性細(xì)胞因子TNFα?xí)T發(fā)產(chǎn)生PP型M細(xì)胞[33].有研究證實CD患者結(jié)腸中M細(xì)胞數(shù)量明顯增加[34]，該變化提示隨著M細(xì)胞數(shù)量增加，其抗原呈遞能力升高可能會加強(qiáng)免疫系統(tǒng)對GP2自身抗體的應(yīng)答.同時對患者結(jié)腸活組織進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄分析，發(fā)現(xiàn)M細(xì)胞中Spi-B和Sox8的表達(dá)上調(diào)[35].全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)顯示，M細(xì)胞中IBD高度易感基因ccl20，nr5a2，jak2，ptger4，sh2b3，ahr表達(dá)上調(diào)[35];而缺乏M細(xì)胞時，小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的感染性結(jié)腸炎，腸道細(xì)菌出現(xiàn)多樣性的變化以及移位.由此可見，M細(xì)胞也是形成腸道屏障重要的調(diào)節(jié)者之一，在腸道穩(wěn)態(tài)的維持中不可或缺[36].M細(xì)胞的數(shù)量變化可作為IBD的臨床診斷指標(biāo)[37].

5 結(jié)論

綜上所述，“囊袋狀”的M細(xì)胞其結(jié)構(gòu)的特殊性決定功能的復(fù)雜性與多樣性.其攝取轉(zhuǎn)運腸腔抗原至抗原呈遞細(xì)胞，參與腸道和機(jī)體的免疫反應(yīng).同時，M細(xì)胞的分化受多種因子調(diào)控，其中RANKL最為重要.成熟的M細(xì)胞表面有多種生物學(xué)標(biāo)志，其中GP2是M細(xì)胞成熟的標(biāo)志.M細(xì)胞是多種病原體入侵機(jī)體的入口，因此M細(xì)胞是感染性疾病研究的重要靶點之一.M細(xì)胞不僅僅和腸道疾病相關(guān)，還和神經(jīng)退行性腦病聯(lián)系密切，這提示M細(xì)胞對于機(jī)體健康不可忽視.當(dāng)然，M細(xì)胞在疾病中更多細(xì)節(jié)性問題還有待進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)、研究和探討.