何璠，鄭偉偉，陳冰冰，曾耀明， 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬溫州中醫(yī)院消化內(nèi)科 浙江省溫州市 325000

0 引言

胃癌是最常見的上皮惡性腫瘤，也是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1].胃癌治療是一個綜合過程，涉及手術(shù)、放射治療和化療等，胃癌患者接受根治性切除術(shù)，但由于癌細胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移性，導(dǎo)致患者的5年生存率很低[2].因此，更好地了解胃癌的發(fā)病機制并探索新的治療靶點是胃癌臨床治療的當(dāng)務(wù)之急.微小RNA(microRNA，miRNA)是由18-25個核苷酸組成的一類小的、內(nèi)源性非編碼RNA，其可通過結(jié)合靶mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)起作用，導(dǎo)致靶mRNA降解或翻譯抑制.據(jù)報道，異常表達的miRNA通過影響細胞增殖、侵襲和遷移等與癌癥的發(fā)生相關(guān)[3，4].因此，研究miRNA的功能可能為開發(fā)癌癥的新治療策略提供理論基礎(chǔ).研究表明[5-7]，miR-139-5p是一種潛在的調(diào)節(jié)性miRNA，在包括結(jié)膀胱癌、卵巢癌和肺癌等惡性腫瘤中表達下調(diào)，發(fā)揮抑癌因子的作用.之前的研究顯示，miR-139-5p在胃癌組織中呈低表達，其低表達與患者TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[8].但未見關(guān)于miR-139-5p對人胃癌細胞侵襲和遷移能力影響作用機制的研究.p21活化的激酶5(p21-Activated kinase 5，PAK5)基因又稱PAK7，是一種致癌基因，在促進腫瘤發(fā)生中的細胞遷移和侵襲方面具有至關(guān)重要的作用[9].目前研究已證實，Wnt/β-catenin信號通路參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程[10].本研究旨在揭示miR-139-5p對胃癌細胞侵襲和遷移的影響，并探究其對PAK5的靶向調(diào)控及可能的作用機制，以期為發(fā)掘胃癌的治療新靶點提供實驗依據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料 細胞和主要試劑:人胃黏膜細胞株GES1及人胃癌細胞株SGC-7901、AGS和BGC-823均為美國ATCC產(chǎn)品;PRIM-1640培養(yǎng)基為美國HyClone公司產(chǎn)品;RNA提取試劑盒為北京天根公司產(chǎn)品;Transwell小室和Matrigel基質(zhì)膠均為美國Coring公司產(chǎn)品;miR-139-5p mimics和陰性對照mimis control(引用文獻[11])均為廣州市銳博生物公司產(chǎn)品;脂質(zhì)體Lipofectamine 2000試劑為美國Invitogen公司產(chǎn)品;熒光素酶報告基因載體及Dual-Luciferase熒光素酶報告基因檢測試劑盒均為美國Promega公司成品;PAK5-Wt及PAK5-Mut重組熒光素酶報告基因載體均為上海生工生物工程有限公司產(chǎn)品;鼠抗人PAK5、Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1和內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體均為美國CST公司產(chǎn)品;山羊抗鼠二抗為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品.

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng):人正常胃黏膜細胞GES1和胃癌細胞SGC-7901、AGS和BGC-823均培養(yǎng)在含10%胎牛血清的PRIM-1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)液中含1×103U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素雙抗，將細胞放置在體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)中，并將相對濕度設(shè)置為95%.每隔1 d換液1次，每隔2 d傳代一次.

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染和分組:對數(shù)期SGC-7901細胞以胰蛋白酶消化，在轉(zhuǎn)染前1 d種植到6孔板中，放置在37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，待細胞達50%-60%融合時，參照Lipofectamine 2000制造商說明書分別將miR-139-5p mimics或陰性對照mimis control轉(zhuǎn)染至SGC-7901細胞，分別命名為miR-139-5p組和miR-NC組，同時設(shè)置空白對照記為Control組.

1.2.3 qRT-PCR檢測miR-139-5p以及PAK5 mRNA的表達:收集對數(shù)生長期的正常胃黏膜細胞GES1和胃癌細胞SGC-7901、AGS、BGC-823以及轉(zhuǎn)染48 h后各組SGC-7901細胞，以RNA提取試劑盒提取RNA.合成第一鏈cDNA.以U6為內(nèi)參，使用實時熒光定量PCR檢測試劑盒檢測細胞中miR-139-5p相對表達量，以β-actin為內(nèi)參檢測細胞中PAK5 mRNA相對表達量.所用引物序列:miR-139-5p正向引物為5’-GCCTCTACAGTGCACGTGTCTC-3’;反向引物為5’-CGCTGTTCTCATCTGTCTCGC-3’.U6正向引物為5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’;反向引物為5’-CGCTTCACGAATT TGCGTGTCAT-3’.PAK5正向引物為5’-GGCGTCCTCTTGTGTCTTC-3’;反向引物為5’-GTACTGAGTCCTTCTGATTTGC-3’.β-actin正向引物為5’-GTGGACATCCGCAAAGAC-3’;反向引物為5’-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3’.采用2-△△Ct法分析基因表達量.

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達:收集GES1、SGC-7901、AGS、BGC-823和轉(zhuǎn)染48 h后各組SGC-7901細胞，提取蛋白質(zhì)，BCA法測定蛋白濃度，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜膜，封閉，洗膜并加入一抗，PAK5一抗稀釋比1:500、Wnt3a一抗稀釋比1:800、β-catenin一抗稀釋比1:800、Cyclin D1一抗稀釋比1:800，4 ℃孵育過夜，再加入稀釋比1:300的二抗，室溫孵育2 h，采用ECL化學(xué)法顯影曝光條帶，采用GAPDH進行表達，用Image J軟件計算條帶灰度值.

1.2.5 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力:用稀釋的Matrigel膠包被Transwell小室的上室.轉(zhuǎn)染48 h后各組SGC-7901細胞以無血清培養(yǎng)液洗滌并調(diào)整密度為1×105個/mL，上室添加100 μL細胞懸液，下室添加含10%胎牛血清培養(yǎng)液500 μL，培養(yǎng)24 h.PBS沖洗小室，拭去上室膜的細胞，多聚甲醛固，結(jié)晶紫染色，計數(shù)穿膜至小室的細胞數(shù).

1.2.6 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力:轉(zhuǎn)染48 h后各組SGC-7901細胞以胰酶消化，鋪板6孔板，待細胞貼壁后呈單層匯合時，使用無菌槍頭做劃痕，觀察并記錄劃痕距離，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，再次觀察并記錄劃痕寬度，細胞遷移率(%)=(0 h劃痕距離-24 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%.

1.2.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?TargetScan在線軟件預(yù)測顯示miR-139-5p和PAK5 3’UTR上存在相互結(jié)合堿基位點，提示PAK5可能是miR-139-5p下游的靶基因.分別將野生型PAK5-Wt和突變型PAK5-Mut重組熒光素酶報告基因載體與miR-139-5p mimics及對照共轉(zhuǎn)染SGC-7901細胞，培養(yǎng)48 h，使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測定細胞的相對熒光素酶活性.

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 21.0版軟件進行統(tǒng)計分析，以上實驗重復(fù)3次，實驗數(shù)據(jù)以mean±SD表示，采用單因素方差分析比較多組間差異，采用SNK-q檢驗分析兩兩組間差異，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 miR-139-5p和PAK5靶向關(guān)系驗證 TargetScan在線軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)，miR-139-5p與PAK5 3’UTR序列之間具有靶向結(jié)合位點，表明PAK5可能是miR-139-5p的直接靶基因.本實驗雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達miR-139-5p后，PAK5-Wt細胞相對熒光素酶活性明顯下將(P＜0.05)，而PAK5-Mut細胞相對熒光素酶活性無顯著變化.見圖1.提示miR-139-5p和PAK5存在靶向關(guān)系.

表1 各細胞系中miR-139-5p和PAK5的表達水平比較(mean±SD)

表2 各組SGC-7901細胞中miR-139-5p表達水平比較(mean±SD)

表3 各組SGC-7901細胞穿膜細胞數(shù)比較(mean±SD)

2.2 miR-139-5p和PAK5的表達差異性 qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示，胃癌細胞SGC-7901、AGS和BGC-823中miR-139-5p的表達水平明顯低于正常胃黏膜細胞GES1(P＜0.05)，而PAK5 mRNA和蛋白的表達顯著高于胃黏膜細胞(P＜0.05).實驗結(jié)果顯示，胃癌SGC-7901細胞中miR-139-5p的表達水平最低，PAK5的表達水平最高.見圖2和表1所示.因此選用胃癌SGC-7901細胞為研究對象進行后續(xù)實驗探究.

表4 各組胃癌SGC-7901細胞遷移率比較(mean±SD)

圖1 miR-139-5p靶向PAK5關(guān)系驗證.A:TargetScan預(yù)測顯示miR-139-5p與PAK5 3’UTR有靶向結(jié)合位點；B:雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CPAK5是miR-139-5p的靶基因.與miR-NC組相比，aP＜0.05.

圖2 Western blot檢測各細胞系中PAK5蛋白表達情況.

圖3 Western blot檢測miR-139-5p可調(diào)控PAK5蛋白表達.

2.3 轉(zhuǎn)染miR-139-5p mimics對miR-139-5p和PAK5表達的影響 qRT-PCR結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，胃癌SGC-7901細胞轉(zhuǎn)染miR-139-5p mimics后，miR-139-5p組中miR-139-5p表達水平明顯升高(P＜0.05)，而Control組中miR-139-5p表達水平無無明顯變化.Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與miR-NC組相比，miR-139-5p組中PAK5蛋白表達顯著降低(P＜0.05)，而Control組細胞中PAK5蛋白表達水平無明顯變化.見表2和圖3所示.表明在SGC-7901細胞轉(zhuǎn)染miR-139-5p mimics能夠有效上調(diào)miR-139-5p的表達，且miR-139-5p能夠靶向負調(diào)控PAK5蛋白表達.

表5 各組SGC-7901細胞中Wnt3a、β-catenin和Cyclin D1蛋白水平比較(mean±SD)

圖4 Transwell實驗檢測各組胃癌SGC-7901細胞侵襲能力.

圖5 劃痕實驗檢測各組胃癌SGC-7901細胞遷移能力.

2.4 過表達miR-139-5p抑制胃癌SGC-7901細胞侵襲能力 Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，與miR-NC組相比，miR-139-5p組中穿膜細胞數(shù)顯著減少(P＜0.05)，而Control組穿膜細胞數(shù)無明顯變化.見圖4和表3所示.表明過表達miR-139-5p能夠有效抑制胃癌SGC-7901細胞侵襲能力.

2.5 過表達miR-139-5p抑制胃癌SGC-7901細胞遷移能力 劃痕實驗結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-139-5p組細胞遷移率明顯降低(P＜0.05)，而Control組細胞遷移率無明顯變化.見圖5和表4所示.表明過表達miR-139-5p可明顯抑制胃癌SGC-7901細胞的遷移.

圖6 Western blot檢測各組SGC-7901細胞中Wnt3a、β-catenin和Cyclin D1蛋白水平.

2.6 過表達miR-139-5p可阻斷Wnt/β-catenin信號通路的激活 Western blot結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-139-5p組細胞中Wnt3a、β-catenin和Cyclin D1蛋白表達水平明顯降低(P＜0.05)，而Control組細胞中Wnt3a、β-catenin和Cyclin D1蛋白表達水平無明顯變化.見圖6和表5.說明過表達miR-139-5p能夠有效阻斷Wnt/β-catenin信號通路的激活.

3 討論

胃癌是第三大最常見的癌癥類型，也是中國癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一.侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要生物學(xué)特征，也是手術(shù)、放療和化療失敗的主要原因[12].因此，探究胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機制對開發(fā)有效治療胃癌的策略具有重要意義.近幾十年來，miRNA在腫瘤發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及腫瘤診斷和治療等方面的作用受到廣大學(xué)者的極大關(guān)注[13].miR-139-5p在人類多種類型腫瘤中呈低表達，且抑制腫瘤細胞侵襲和遷移[13-16].最近Zhang等人[17]研究顯示，miR-139-5p靶向調(diào)控SLC39A7，并通過Akt/mTOR信號通路影響胃癌細胞的增殖、遷移和凋亡.Hou等人[18]研究結(jié)果顯示，miR-139-5p的過度表達顯著抑制了胃癌細胞的生長和增殖，并抑制了裸鼠移植胃癌細胞的腫瘤生長，機制研究顯示，miR-139-5p可通過靶向NF-κB信號通路負性調(diào)節(jié)PMP22的表達影響胃癌的進展.以往研究顯示[17，18]，miR-139-5p在胃癌中能夠抑制侵襲和遷移，然而其潛在機制仍需深入探究.本實驗qRTPCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與以往研究一致，3株胃癌細胞系中miR-139-5p的表達量顯著低于正常胃黏膜細胞系，這提示miR-139-5p可能在胃癌中發(fā)揮抑癌基因的作用.

本實驗在miR-139-5p基礎(chǔ)表達量最低的胃癌SGC-7901細胞中轉(zhuǎn)染miR-139-5p mimics來探究其對胃癌細胞侵襲和遷移的影響，Transwell及劃痕實驗發(fā)現(xiàn)，過表達miR-139-5p后，SGC-7901細胞侵襲和遷移能力顯著降低.miRNA通常通過調(diào)控靶基因發(fā)揮其生物學(xué)功能，本實驗通過生物信息學(xué)方法預(yù)測了miR-139-5p的潛在基因效應(yīng)子，結(jié)果顯示PAK5基因3’UTR區(qū)域有miR-139-5p的靶向結(jié)合序列.本實驗雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示PAK5為miR-139-5p的靶基因，且miR-139-5p可負向調(diào)控PAK5蛋白表達.PAK5是最近發(fā)現(xiàn)的PAK家族成員，在膀胱癌、骨肉瘤和黑色素瘤等多種腫瘤中過表達，具有促進腫瘤行為的潛在能力[19-21].多項研究[22，23]發(fā)現(xiàn)PAK5在促進腫瘤發(fā)生中的細胞遷移和侵襲方面具有至關(guān)重要的作用.本實驗發(fā)現(xiàn)PAK5在胃癌細胞系中的表達明顯升高，這與以前PAK5在胃癌中高表達的研究相符.近期Li等[24]研究表明PAK5作為一種致癌基因，通過激活Wnt/β-catenin信號通路參與乳腺癌的進展.Wnt/β-catenin信號通路在調(diào)節(jié)多種生物過程中起著至關(guān)重要的作用，包括細胞增殖、分化、侵襲和遷移[25].據(jù)報道[26，27]，Wnt/β-catenin信號通路的異常激活與人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān).在本研究中，miR-139-5p過表達導(dǎo)致胃癌SGC-7901細胞中Wnt/β-catenin信號通路中三個關(guān)鍵靶點Wnt3a、β-catenin和Cyclin D1蛋白表達水平的下調(diào).以上數(shù)據(jù)表明miR-139-5p能夠通過直接靶向抑制PAK5的表達來阻斷Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑.

4 結(jié)論

總之，本實驗結(jié)果顯示，miR-139-5p在胃癌細胞中呈低表達，過表達miR-139-5p通過負向調(diào)控PAK5的表達阻斷Wnt/β-catenin信號通路的激活來阻礙胃癌細胞遷移以及侵襲能力.然而尚未涉及PAK5功能恢復(fù)實驗進行驗證尚顯不足，后續(xù)實驗將進行補充驗證.本實驗結(jié)果提示miR-139-5p和PAK5有可能是胃癌治療的新作用靶點.

文章亮點

實驗背景

胃癌(Gastric cancer，GC)作為消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，具有早期轉(zhuǎn)移、晚期預(yù)后差的特點，隨著社會環(huán)境和飲食習(xí)慣的改變，其發(fā)病率和死亡率呈上升趨勢，手術(shù)和化療仍然是GC患者的主要治療方法，但療效不佳.鑒于目前的不利形勢，尋找一種對胃癌的診斷和治療具有高度敏感性的生物標(biāo)志物對胃癌患者具有重要的臨床意義.近年來，微小RNA(microRNA，miRNA)被證明可作為抑癌基因或癌前基因，其異常表達可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān).表達與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，因此通常被認為是癌癥診斷或治療的目標(biāo)方向.miRNA作為一種小的非編碼RNA，通過與靶基因的3’UTR結(jié)合來調(diào)控靶基因的表達.本研究從miRNA靶向基因方面探究其對胃癌細胞侵襲和遷移的影響及潛在機制.

實驗動機

本研究的主題是miR-139-5p對胃癌細胞侵襲和遷移的影響，擬解決的問題是了解miR-139-5p如何影響胃癌細胞侵襲和遷移以及其和PAK5之間的關(guān)系，隨后探究miR-139-5p在胃癌發(fā)生發(fā)展的潛在機制，以期為胃癌臨床治療提供新的靶點.

實驗?zāi)繕?biāo)

研究的主要目標(biāo)是miR-139-5p對胃癌細胞侵襲和遷移影響的機制，研究得到miR-139-5p在胃癌細胞中呈低表達，而PAK5呈高表達，過表達miR-139-5p能夠抑制胃癌細胞侵襲和遷移，且miR-139-5p能夠靶向負調(diào)控PAK5，此外，過表達miR-139-5p能夠阻斷Wnt/β-catenin信號通路的激活.本研究為胃癌的治療提供新的思路.

實驗方法

本研究首先通過qRT-PCR和Western blot分別檢測miR-139-5p和PAK5在胃癌細胞中的表達情況，通過轉(zhuǎn)染構(gòu)建過表達miR-139-5p的細胞株，Transwell和劃痕實驗檢測細胞侵襲和遷移能力，Western blot檢測Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達情況，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-139-5p和PAK5之間的靶向關(guān)系.

實驗結(jié)果

本研究結(jié)果是miR-139-5p在胃癌細胞中低表達，而PAK5在胃癌細胞中異常高表達.過表達miR-139-5p能夠抑制胃癌細胞侵襲和遷移能力，且能夠靶向抑制PAK5的表達，此外，過表達miR-139-5p能夠抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，達到了本研究的目的，對胃癌發(fā)生和發(fā)展的分子機制有了進一步的的了解，可應(yīng)用于胃癌的臨床治療.

實驗結(jié)論

miR-139-5p能夠靶向負調(diào)控PAK5的表達，過表達miR-139-5p可通過阻斷Wnt/β-catenin信號通路抑制胃癌細胞的侵襲和遷移.盡管關(guān)于miRNA在胃癌中的作用機制的報道很多，但其上游和下游機制仍然難以捉摸，這是我們未來研究的另一個目的.

展望前景

本研究只在體外細胞中研究了miR-139-5p對胃癌細胞侵襲和遷移能力的影響，未涉及體內(nèi)模型實驗尚顯不足，且到臨床上的應(yīng)用相差甚遠，因此后續(xù)實驗需在小鼠體內(nèi)進行驗證，并且在未來的實驗中，我們開展更多的基礎(chǔ)實驗，以彌補我們研究的不足.