郭曉農(nóng)，張 妍，董江陵，姬冰茹

(1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室,甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心中國-馬來西亞國家聯(lián)合實驗室,甘肅 蘭州 730030)

植物根際是植物與土壤進行能量交換最活躍部位，絕大部分物質(zhì)、能量與信息交換在這一小部分區(qū)域內(nèi)進行[1].隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展，化肥、農(nóng)藥等化學(xué)品的過度使用，以及人們中長期連作影響，使得土壤結(jié)構(gòu)被破壞，土地荒漠化、鹽堿化加重，進而導(dǎo)致作物質(zhì)量下降[2-3]，因此，人們開始關(guān)注具有環(huán)保、安全等特點的根際微生物[4].根際微生物根據(jù)其對植物的作用可以分為有益微生物、中性微生物和有害微生物三類[5]，而人們常用的是有益微生物，比如植物根際促生菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR，簡稱促生菌).植物根際促生菌(PGPR)的生存和對環(huán)境的適應(yīng)能力較強，不同的植物根際有不同的菌群，對植物起著直接或者間接的作用，影響植物的生長發(fā)育.PGPR可以分泌多種植物激素來促進植株的生長，比如細胞分裂素、赤霉素、生長素等[6].可以通過分泌嗜鐵素或產(chǎn)生氰化物等防治植物病害,提高植株的抗逆性[7]，還可以促進礦質(zhì)營養(yǎng)吸收利用和植物生長，抑制有害微生物[8].王艷霞[9]、鄭娜[10]、王琦琦[11]等人通過分離鹽堿化土壤中的菌株篩選出耐鹽脅迫的根際促生菌，發(fā)現(xiàn)PGPR是通過誘導(dǎo)植物產(chǎn)生耐受機制，以確保植物能在鹽堿化環(huán)境中生長[12].

蒲公英(TaraxacummongolicumHand.-Mazz.)，為多年生草本植物，種類繁多[13-14]，屬于藥食兩用的材料[15-16]，常被作為藥物使用.在《唐本草》、《本草綱目》、《中國藥典》等典籍中都有記載[17]，被稱為“天然抗生素”.蒲公英形態(tài)優(yōu)美，耐寒耐旱[18-19]，其化學(xué)成分較為復(fù)雜，從中分離出的化合物多達50種，有多糖類、芬酸類、黃酮類、香豆素、甾醇類等[20-21]，其廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代藥理學(xué)中.目前的研究多集中于蒲公英的生物活性物質(zhì)，但對于蒲公英根際微生物的研究卻鮮有報道.

蒲公英具有較強的環(huán)境適應(yīng)能力，為了研究蒲公英根際微生物的多樣性，本實驗以西北民族大學(xué)榆中校區(qū)蒲公英根際土壤為材料，開展蒲公英根際微生物初步研究.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植株

蒲公英，樣品采集于西北民族大學(xué)榆中校區(qū)(104°9′E，35°56＇N)，采集生長良好的蒲公英作為根際微生物分離材料.

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

牛肉高蛋白胨固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，瓊脂粉15 g，pH調(diào)至7.4.

吲哚試劑：對二甲氨基苯甲醛1 g，于95 ml 95%乙醇中溶解，之后緩慢加入20 ml濃鹽酸.

1.2 試驗方法

選取肉眼觀察后形態(tài)不同的菌落進行四區(qū)劃線，對菌種進行分離、純化，最終得到單菌落后做生化鑒定.首先從平板觀察培養(yǎng)菌落形態(tài)，并拍照記錄，然后通過生理生化實驗對照《伯杰細菌鑒定手冊》確定菌種類別.其中生化鑒定包括：形態(tài)觀察、革蘭氏染色、觸酶實驗、吲哚實驗等.

1.2.1 菌種分離純化

將所采樣取根部至于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，放入恒溫震蕩箱中180 r/min 30℃震蕩12 h，然后取出進行梯度稀釋，吸取菌液涂布均勻后培養(yǎng)[22-23].挑取形態(tài)不同的菌落采用四區(qū)劃線法于培養(yǎng)皿中劃線稀釋，直到出現(xiàn)單菌落后測定菌株的生理生化指標.

1.2.2 革蘭氏染色法

在載玻片中央滴加一滴0.9%生理鹽水，用滅菌接種環(huán)挑取菌落放入鹽水中，均勻涂片，風(fēng)干后，用結(jié)晶紫染液染色1～2min，水洗，用碘液覆蓋1min，水洗，吸干水分后滴加95%乙醇脫色，水洗，吸干水分，番紅復(fù)染2min，水洗后晾干鏡檢[24-26].

1.2.3 吲哚實驗

于蛋白胨水培養(yǎng)基中接種菌株，37 ℃下培養(yǎng)72 h，沿管壁緩慢加入5～10滴吲哚試劑，觀察實驗結(jié)果，同時做空白試驗.若乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，則說明可產(chǎn)生吲哚，此為吲哚實驗陽性反應(yīng)，用“+”表示，否則為陰性反應(yīng)，用“-”表示.

1.2.4 過氧化氫酶實驗

用滅菌接種環(huán)挑取實驗菌株于干凈的載玻片上，之后滴加3～4滴5%過氧化氫溶液，觀察結(jié)果.若0.5 min內(nèi)產(chǎn)生氣泡，則為陽性，反之則為陰性.

2 結(jié)果

2.1 菌株的分離純化

通過平板劃線法進行分離、純化，得到單菌，進行革蘭氏染色等生化鑒定試驗.通過實驗，觀察菌落涂布可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)選取濃度較高的菌液進行涂布時，培養(yǎng)皿上生長的菌落過于密集，所以涂布時選取的菌液濃度要適當(dāng).

2.2 形態(tài)觀察

在分離純化得到的微生物菌株中，對其進行形態(tài)特征的觀察，并拍照記錄單菌落的形態(tài)特征，作為鑒定菌株的依據(jù)，圖1為分離純化后的菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上的菌落特征.

由圖 1可知，1號菌株的菌落為白色，形態(tài)較大，呈圓形，中部隆起；2號菌株的菌落為白色，此菌株在培養(yǎng)相同時間內(nèi)能夠產(chǎn)生代謝物，形態(tài)較小，為圓形；3號菌株的菌落為黃色，形態(tài)較小，邊緣較為平整，呈圓形；4號菌株的菌落呈黃色，形態(tài)較大，中間隆起，呈圓形.

2.3 革蘭氏染色

革蘭氏陽性菌(G+菌)細胞壁中肽聚糖含量高，細胞壁厚.肽聚糖網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)可以保留碘-結(jié)晶紫絡(luò)合物，因此革蘭氏陽性菌經(jīng)復(fù)染劑染色后仍然是藍色；革蘭氏陰性菌(G-菌)細胞壁中肽聚糖含量低，細胞壁薄.用乙醇或丙酮脫色后，細菌變成無色，染色劑重新染色后，變?yōu)閺?fù)染劑顏色.因此革蘭氏陽性菌染色后為藍紫色，革蘭氏陰性菌染色后為紅色.

A：1號菌株；B：2號菌株；C：3號菌株；D：4號菌株 A：1號菌株；B：2號菌株；C：3號菌株；D：4號菌株

由圖 2可以看出，1號菌株，形態(tài)呈桿狀，部分彎曲，經(jīng)革蘭氏染色后呈現(xiàn)紅色，為革蘭氏陰性菌；2號菌株，形態(tài)呈球形，經(jīng)革蘭氏染色后呈紫色，為革蘭氏陽性菌；3號菌株，形態(tài)呈球形，多粘連在一起為鏈狀，經(jīng)革蘭氏染色后呈紫色，為革蘭氏陽性菌；4號菌株，形態(tài)呈直桿狀，經(jīng)染色后呈紫色，為革蘭氏陽性菌.

2.4 吲哚實驗

由吲哚實驗發(fā)現(xiàn)，1號、2號、3號、4號菌株的乙醚層均未呈現(xiàn)玫瑰紅色，說明這四種菌株都不能夠產(chǎn)生吲哚.

2.5 過氧化氫酶實驗

表1 過氧化氫酶實驗結(jié)果

由表1可知：1號菌株為厭氧菌，2號、3號、4號菌株均為好氧菌.

2.6 菌株鑒定結(jié)果

表2 菌株鑒定結(jié)果

通過對分離、純化后的菌株進行形態(tài)觀察、生理生化等試驗，查閱《伯杰細菌鑒定手冊》進行對照后發(fā)現(xiàn)，1號菌種屬于假單胞菌屬(Pseudomonas)，2號菌種屬于微球菌屬(Micrococcus)，3號菌種屬于鏈球菌屬(Streptococcus)，4號菌種屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，分離菌株均為土壤中常見菌屬，體現(xiàn)了蒲公英根際微生物的多樣性[27].

3 討論

通過革蘭氏染色等生理生化試驗發(fā)現(xiàn)，分離得到的4株單菌分別為假單胞菌屬、微球菌屬、鏈球菌屬、芽孢桿菌屬，其中假單胞菌屬為變形菌門，芽孢桿菌屬、鏈球菌屬為厚壁菌門，由此推測，蒲公英根際微生物的優(yōu)勢菌門可能是厚壁菌門.對比其他植物根際微生物的研究，錢蘭華等[28]對江蘇南通海邊灘涂的土壤樣品中篩選出5株耐鹽菌株，發(fā)現(xiàn)其中具有耐鹽促生能力的是巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)；汪婭婷等[29]對云南玉米根際微生物進行研究發(fā)現(xiàn)，在所研究的樣地中，變形菌門在細菌群落分布中的相對豐度最高，擬桿菌門、變形菌門和放線菌門是共同具有的優(yōu)勢菌門.說明，不同土壤當(dāng)中根際微生物的組成和結(jié)構(gòu)不同，但厚壁菌門、變形菌門、放線菌門等為共有的優(yōu)勢菌門.

根際促生菌在土壤中長期生存，形成了許多優(yōu)良特性，比如PGPR能夠通過促進植物對于養(yǎng)分的吸收或者產(chǎn)生激素類物質(zhì)來促進植物的生長發(fā)育，這樣既可以提高植物次級代謝產(chǎn)物的積累，又可以誘導(dǎo)植物體內(nèi)的抗病性或抗逆性，使植物對病害或逆境及時發(fā)出響應(yīng)，以增強植物的抗逆性[30-31].基于這幾種優(yōu)良特性，PGPR 被用作植物生物制劑或生物防治制劑，而PGPR 生物制劑可以部分或完全代替化學(xué)肥料、殺蟲劑等微生物制劑[32-33].因此，利用土壤有益微生物開發(fā)菌肥、菌劑等產(chǎn)品具有廣闊的應(yīng)用前景[34].

4 結(jié)論

本次實驗以蒲公英根際土壤為實驗材料，共分離得到4種菌株，分別為假單胞菌屬、微球菌屬、鏈球菌屬、芽孢桿菌屬.其中，假單胞菌屬、芽孢桿菌屬對植物生長有促進作用，屬于根際有益微生物，即根際促生菌[35].假單胞菌和芽孢桿菌是土壤中常見的根際促生菌株.