姚鵬飛，張鵬江，孫 楊

瘧疾是由瘧原蟲引起的蟲媒傳染病，在全球尤其是熱帶地區(qū)肆虐流行，每年約2.28億人發(fā)病，40.5萬人死亡[1]，嚴(yán)重威脅著人類的健康。目前，臨床常用奎寧和青蒿素類藥物對(duì)瘧疾患者進(jìn)行預(yù)防和救治[2]，但是在瘧疾肆虐的國(guó)家，上述藥物不易獲得且價(jià)格昂貴，會(huì)給患者造成較重的醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。此外，隨著藥物耐藥性增加，瘧疾的治療與防控效果也逐年下降，因此具有適應(yīng)性和持久性的抗瘧疾疫苗成為研究熱點(diǎn)。目前，疫苗相關(guān)研究主要圍繞瘧原蟲生命周期不同階段或多個(gè)階段的生物分子抗原開展。因此，本文重點(diǎn)就瘧原蟲在人體內(nèi)發(fā)育過程的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，為瘧疾疫苗研發(fā)和瘧疾防控救治提供參考。

1 無癥狀紅細(xì)胞外期

1.1 子孢子接種 瘧原蟲感染的雌性按蚊叮咬人體后，通過唾液管注射唾液至皮下，產(chǎn)生局部麻醉效應(yīng)并形成局部小血腫，位于唾液腺中的感染性子孢子與唾液一起注入皮膚真皮層。由于人體皮膚的分層結(jié)構(gòu)，按蚊的喙部常刺入真皮層，但皮膚的厚度因部位不同，少部分子孢子也可能被注入表皮層或皮下組織。只有20%接種的子孢子能夠成功離開真皮層[3]。

1.2 子孢子遷移 感染的雌性按蚊唾液中含有γ干擾素誘導(dǎo)的巰基還原酶，其不利于子孢子遷移運(yùn)動(dòng)[4]。子孢子接種于皮膚后，必須離開皮膚遷移到血管才能成功轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟繼續(xù)其生命周期，因此須要突破多個(gè)細(xì)胞屏障，包括皮膚成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、皮膚吞噬細(xì)胞以及肝竇狀隙的Kupffer細(xì)胞和肝細(xì)胞。子孢子能靶向肝細(xì)胞遷移，是因?yàn)楦胃]組織及肝細(xì)胞表面含有高度硫酸化的硫酸肝素蛋白多糖（heparin sulfate proteoglycans,HSPGs）[5]。子孢子離開皮膚依賴子孢子滑行運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞穿越能力的兩種行為[6-7]。

滑行運(yùn)動(dòng)是一種基質(zhì)依賴性運(yùn)動(dòng)，其特點(diǎn)是缺乏纖毛或鞭毛，并且沒有明顯細(xì)胞形態(tài)的改變[8]?；羞\(yùn)動(dòng)的關(guān)鍵分子是子孢子細(xì)胞表面跨膜蛋白——血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)匿名蛋白（thrombospondin-related anonymous protein,TRAP）家族，上述蛋白在區(qū)域構(gòu)造上具有幾個(gè)共同特征，包括細(xì)胞外黏附結(jié)構(gòu)域和胞漿結(jié)構(gòu)域，其連接到肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白分子馬達(dá)[5]，子孢子必須黏附到基質(zhì)或細(xì)胞上以提供拉力[8]。子孢子細(xì)胞外黏附域與基質(zhì)結(jié)合，使分子馬達(dá)向后轉(zhuǎn)移TRAP，從而將子孢子向前推進(jìn)。TRAP家族中最關(guān)鍵的蛋白是TRAP，因?yàn)榘邢騎RAP導(dǎo)致的突變，子孢子的運(yùn)動(dòng)方式或速度只發(fā)生輕微變化，但血管侵襲性和感染性顯著降低[6]。同樣，輻射減毒能夠消弱子孢子，調(diào)整其運(yùn)動(dòng)角度，影響移動(dòng)速度，改變運(yùn)動(dòng)類型和方向[9]?；羞\(yùn)動(dòng)幾乎是任意方向，直到它們接觸血管內(nèi)皮細(xì)胞或者淋巴系統(tǒng)。子孢子遷移特征的研究有助于終止遷移運(yùn)動(dòng)抗體的研發(fā)[10]。

子孢子離開皮膚的另外一個(gè)關(guān)鍵特性是子孢子穿越宿主細(xì)胞的能力，這種能力對(duì)于子孢子從接種點(diǎn)遷移至肝細(xì)胞非常重要。細(xì)胞穿越包括活躍的子孢子進(jìn)入宿主細(xì)胞，快速遷移通過細(xì)胞質(zhì)，然后從宿主細(xì)胞膜排出等過程[11]。子孢子能夠穿越細(xì)胞依賴子孢子穿越微絲蛋白和穿孔素樣蛋白-1（perforin-like protein-1,PLP-1）。子孢子在不破壞宿主細(xì)胞膜的基礎(chǔ)上，通過封包于暫時(shí)性空泡（transient vacuoles,TV）內(nèi)穿越細(xì)胞，隨后子孢子利用pH敏感性和PLP-1自TV排出，避免了宿主溶酶體降解，達(dá)到逃避宿主細(xì)胞防御的目的[11]。研究發(fā)現(xiàn)，基因敲除編碼子孢子穿越微絲蛋白的基因?qū)ψ渔咦哟┰剿拗骷?xì)胞的能力具有重要影響[12]。

兩種活動(dòng)類型表明，遠(yuǎn)離血管真皮層的子孢子移動(dòng)快且移動(dòng)距離相對(duì)較大，鄰近血管處的子孢子活力受到限制，移動(dòng)慢且路徑更加彎曲，但有利于與血管接觸[6]。上述過程中，僅部分子孢子到達(dá)目的地，大部分在真皮層被宿主自身免疫系統(tǒng)破壞清除；或者進(jìn)入淋巴管，引流到達(dá)淋巴結(jié)，最終被吞噬清除。進(jìn)入血管的子孢子快速被血流帶走，進(jìn)入淋巴系統(tǒng)的則較緩慢。大約15%～20%的子孢子最終引流進(jìn)入淋巴結(jié)，成為最初存活的子孢子，但其不能繼續(xù)發(fā)育至紅細(xì)胞期，將成為免疫反應(yīng)的抗原。子孢子的靶向抗體顯著影響其在小鼠皮膚中的運(yùn)動(dòng)，證實(shí)子孢子是有效的疫苗靶點(diǎn)[3]。

1.3 子孢子入侵肝細(xì)胞 子孢子通過血流靶向HSPGs運(yùn)輸?shù)竭_(dá)肝臟，通過感知肝竇狀隙血流環(huán)境，黏附到竇狀隙內(nèi)皮細(xì)胞。子孢子在TV內(nèi)穿越有孔內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞樣Kupffer細(xì)胞構(gòu)成的竇狀隙屏障[13]，最后駐留在一個(gè)肝細(xì)胞中。穿越竇狀隙屏障對(duì)子孢子感染肝細(xì)胞很重要，因?yàn)樗鼏?dòng)了子孢子入侵肝細(xì)胞的過程。缺乏細(xì)胞穿越能力的子孢子不能達(dá)到血管，逐漸被吞噬清除[13]。細(xì)胞穿越需要的蛋白包括子孢子穿越微絲蛋白、PLP-1、動(dòng)合子和子孢子細(xì)胞穿越蛋白、磷脂酶、配子逸出和子孢子穿越蛋白等[14]。

子孢子一旦跨過內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，就由“遷移模式”轉(zhuǎn)變?yōu)椤叭肭帜Ｊ健?。子孢子表?-半胱氨酸結(jié)構(gòu)域蛋白P36是識(shí)別和有效入侵肝細(xì)胞的關(guān)鍵決定因素之一。惡性瘧和間日瘧分別與宿主細(xì)胞CD81受體和清道夫受體BI結(jié)合進(jìn)而感染肝細(xì)胞[15]。鈣依賴蛋白激酶6激活轉(zhuǎn)換信號(hào)，通過結(jié)合肝細(xì)胞呈遞的HSPGs，降低了子孢子細(xì)胞穿越能力，促進(jìn)了環(huán)子孢子蛋白（circumsporozoite protein,CSP）的分解，使子孢子轉(zhuǎn)換為肝細(xì)胞入侵模式[16]。CSP由一個(gè)高重復(fù)區(qū)和一個(gè)黏附性I型凝血酶敏感蛋白重復(fù)序列（thrombospondin repeat,TSR）組成。遷移過程中，CSP羧基端掩蓋了細(xì)胞黏附域，該域在唾液腺子孢子中也被掩蓋。接觸肝細(xì)胞時(shí)，CSP與HSPGs結(jié)合，激活CSP水解程序，CSP被瘧原蟲蛋白酶水解，移除羧基末端，暴露細(xì)胞器頂端TSR黏附域，進(jìn)而附著在內(nèi)皮上，將遷移性子孢子轉(zhuǎn)化為侵入性子孢子[17]。到達(dá)肝細(xì)胞后不久，細(xì)胞的穿越活動(dòng)就停止了，進(jìn)入了生命周期的下一階段。

子孢子頂端微線體釋放蛋白P36和P52能與肝細(xì)胞肝配蛋白A2受體相互作用，形成納蟲空泡（parasitophorous vacuole,PV）[18]。無論哪種跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)方式，子孢子最終都在肝細(xì)胞中的納蟲空泡膜（parasitophorous vacuole membrane,PVM）內(nèi)。由于瘧原蟲駐留在PV中，從宿主細(xì)胞到瘧原蟲的營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸和從瘧原蟲到宿主細(xì)胞的信號(hào)傳遞變得復(fù)雜。瘧原蟲駐留在細(xì)胞內(nèi)PVM中，持續(xù)發(fā)育，直至肝細(xì)胞期結(jié)束。

1.4 肝細(xì)胞內(nèi)分裂增殖 子孢子進(jìn)入肝細(xì)胞后，速發(fā)型子孢子第2 d開始DNA復(fù)制并進(jìn)入分裂模式。經(jīng)過反復(fù)分裂，子孢子逐漸發(fā)育成為侵入性結(jié)構(gòu)，稱為裂殖子，發(fā)育頂峰時(shí)每一個(gè)感染的肝細(xì)胞能夠釋放40 000個(gè)裂殖子。遲發(fā)型子孢子須經(jīng)過休眠期后才開始裂體增殖，這個(gè)階段的子孢子叫做休眠子，惡性瘧原蟲和三日瘧原蟲無休眠子。

PVM完全解體后，大量裂殖子釋放到宿主細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)，同時(shí)被宿主細(xì)胞膜包裝成充滿裂殖子的小囊泡（稱為微體），使瘧原蟲避開宿主免疫系統(tǒng)，尤其是在進(jìn)入血液的過程中，避開了眾多的Kupffer細(xì)胞[19]。研究表明，肝細(xì)胞內(nèi)瘧原蟲排出需要半胱氨酸蛋白酶，因此靶向破壞半胱氨酸蛋白酶活性可以阻止瘧原蟲從肝細(xì)胞排出[20]。成熟的裂殖子稱為紅細(xì)胞外裂殖子，其進(jìn)入血液后部分被吞噬細(xì)胞吞噬殺滅，部分侵入紅細(xì)胞定居于PVM內(nèi)發(fā)育增殖[21]。

2 有癥狀紅細(xì)胞內(nèi)期

2.1 裂殖子入侵紅細(xì)胞 裂殖子釋放到血液循環(huán)中后，游離裂殖子以快速、動(dòng)態(tài)、多步驟的過程侵入紅細(xì)胞[22]，由此進(jìn)入瘧原蟲紅細(xì)胞內(nèi)期。瘧原蟲裂殖子結(jié)構(gòu)包括稠密顆粒、微絲、棒狀體以及這些細(xì)胞器分泌的多種蛋白，比如活性酶二肽氨基肽酶[23]、紅細(xì)胞結(jié)合樣蛋白家族[24]、RhopH復(fù)合體[25]，上述結(jié)構(gòu)或蛋白有利于裂殖子侵入并附著紅細(xì)胞。裂殖子通過表面蛋白1將裂殖子附著于紅細(xì)胞，頂膜抗原-1（apical membrane antigen-1,AMA-1）通過再定向作用，使裂殖子尖端與紅細(xì)胞膜并列，棒狀體頸部蛋白2與AMA-1相互作用，使裂殖子和紅細(xì)胞膜間形成緊密連接，最后裂殖子跨膜蛋白TRAP在肌動(dòng)蛋白-肌球蛋白分子馬達(dá)產(chǎn)生的拉力下完全侵入紅細(xì)胞[26-27]。紅細(xì)胞期的疫苗能夠減慢裂殖子黏附侵入紅細(xì)胞，從而達(dá)到預(yù)防目的[28]。

2.2 裂殖子紅細(xì)胞內(nèi)繁殖 裂殖子從受感染的紅細(xì)胞中排出和侵入新的紅細(xì)胞，是瘧原蟲指數(shù)級(jí)無性繁殖的必要過程。在感染的紅細(xì)胞內(nèi)，瘧原蟲經(jīng)歷了裂殖的無性繁殖過程。侵入紅細(xì)胞不久，瘧原蟲變成擁有紅色核點(diǎn)和藍(lán)色環(huán)狀胞漿的環(huán)狀體，稱為早期滋養(yǎng)體。隨著發(fā)育長(zhǎng)大，胞漿伸出不規(guī)則的偽足以攝噬血紅蛋白，最終形成晚期滋養(yǎng)體。未被利用的血紅蛋白分解成正鐵血紅素顆粒沉積在原漿內(nèi)呈棕褐色，稱為瘧色素。當(dāng)宿主紅細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)耗竭時(shí)，裂殖子細(xì)胞器分泌不同的蛋白酶，促使PVM和紅細(xì)胞膜破裂[29]，瘧原蟲爆發(fā)性釋放并侵入新的紅細(xì)胞。一旦紅細(xì)胞期產(chǎn)生的瘧原蟲數(shù)量超過某個(gè)閾值（大約100/μl），瘧疾的癥狀就會(huì)出現(xiàn)。

2.3 瘧疾臨床發(fā)作過程 裂殖子通過體內(nèi)TNF-α和血糖水平的日常節(jié)律變化進(jìn)行周期性生長(zhǎng)發(fā)育。瘧原蟲幾乎于同時(shí)間點(diǎn)，以類似的速率發(fā)育并釋放裂殖子、解體的液泡和其他代謝產(chǎn)物[30]，瘧原蟲抗原成分的集中出現(xiàn)，誘導(dǎo)產(chǎn)生了大量促炎細(xì)胞因子和趨化因子，引起強(qiáng)烈的先天性免疫反應(yīng)，導(dǎo)致瘧疾寒戰(zhàn)、高熱、頭痛等典型癥狀發(fā)作[31]。惡性瘧原蟲可以在感染紅細(xì)胞表面表達(dá)惡性瘧紅細(xì)胞膜蛋白-1分子，后者介導(dǎo)感染的紅細(xì)胞與宿主血管內(nèi)皮細(xì)胞受體結(jié)合，使感染的紅細(xì)胞沉積在重要臟器的微血管床上，導(dǎo)致肺、肝、腸、腦和胎盤血液循環(huán)障礙[32-34]。

在瘧原蟲的血液期，部分裂殖子在紅細(xì)胞內(nèi)經(jīng)3～6 代裂體增殖后，不再進(jìn)行無性分裂，逐漸發(fā)育為雌性配子體或雄性配子體。配子體在人體內(nèi)可存活2～3個(gè)月，當(dāng)人體再次被雌性按蚊叮咬后，病原體又傳播給按蚊，配子體繼續(xù)在按蚊體內(nèi)發(fā)育。因此，阻斷配子體傳播給蚊蟲可以有效控制瘧疾的傳播和感染[35]。

3 小 結(jié)

綜上所述，瘧原蟲在人體內(nèi)發(fā)育過程極其復(fù)雜，經(jīng)歷了瘧原蟲（即子孢子、裂殖子）人體紅細(xì)胞外、紅細(xì)胞內(nèi)入侵及發(fā)育等過程，瘧原蟲在各階段擁有不同的生物學(xué)特征，據(jù)此可以研究和開發(fā)阻斷瘧原蟲發(fā)育繁殖的藥物和疫苗，以達(dá)到高效控制瘧疾傳播目的。