吳 爽，強 榮，張瑞雪，華 偉

(1.西安醫(yī)學院，陜西 西安 710000；2.西北婦女兒童醫(yī)院醫(yī)學遺傳科，陜西 西安 710061)

新生兒疾病篩查(newborn screening，NBS)是一項成功的公共衛(wèi)生項目，是指在新生兒期對嚴重危害新生兒健康的先天性、遺傳性疾病施行專項檢查，在出現(xiàn)癥狀之前提供早期診斷和治療，從而改善臨床結(jié)果[1]。1963年，Guthrie和Susi[2]首次報道了細菌抑制試驗篩查苯丙 酮尿癥(phenylketonuria，PKU)，開啟了新生兒篩查的序幕。隨之，酶活性測定半乳糖血癥、放射性免疫法篩查先天性甲狀腺功能減低癥(congenital hypothyroidism，CH)均獲得成功，至此以PKU和CH為主的NBS在歐美發(fā)達地區(qū)迅速開展。到20世紀90年代，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)使NBS發(fā)生了革命性的轉(zhuǎn)變，它可以通過一次實驗篩查多種疾病，大大擴展了篩查病種[3]。如今，NBS已在國際上廣泛推廣，是國際公認的降低新生兒疾病發(fā)病率及死亡率的重要措施。

目前，NBS篩查方法主要包括質(zhì)譜技術(shù)、免疫學方法、酶學、高壓液相色譜及電泳等。通過檢測生化指標發(fā)現(xiàn)新生兒體內(nèi)異常的代謝改變，進而實現(xiàn)疾病的早期診斷。除CH外，現(xiàn)階段的NBS篩查病種均屬于遺傳性疾病。據(jù)統(tǒng)計，活產(chǎn)新生兒中不同種類遺傳性疾病占3%～5%[4]，使這些患兒面臨早期死亡或致殘。某些疾病，如PKU，早期干預可明顯改善預后，因而盡快明確診斷尤為重要。但是目前篩查技術(shù)存在篩查病種有限，漏檢，并可能存在假陰性及假陽性等缺點，還不能完全滿足臨床需求。隨著分子生物學的發(fā)展，DNA測序技術(shù)為NBS開辟了新的途徑。高通量測序技術(shù)(next-generation sequencing，NGS)也稱下一代測序技術(shù)，相較于傳統(tǒng)的一代測序技術(shù)，它以成本低、通量高、速度快的特點在優(yōu)生遺傳領域得到了廣泛的應用，其主要包括：遺傳病的診斷、攜帶者篩查、植入前遺傳學檢測、臨床用藥指導等。NGS按照測序覆蓋范圍大小大致分為：全基因組測序、全外顯子組測序、靶向目標基因測序。該技術(shù)通過一次性檢測數(shù)百至數(shù)千種基因變異，實現(xiàn)在分子水平對遺傳性疾病的精準診療。在新生兒領域，NGS技術(shù)已作為新生兒遺傳性疾病確診的重要依據(jù)。近年來，該技術(shù)在NBS方面的應用處于探索中，現(xiàn)對NGS在NBS方面的研究進展進行綜述。

1高通量測序技術(shù)作為二級NBS手段的應用

目前大部分NBS的模式是將NGS作為二級篩查手段，即對生化篩查陽性患兒或疑似患兒進行測序，以明確診斷、治療指導和預后評估[5]。該種篩查模式在一些疾病中運用較為成熟，如遺傳代謝病(inherited metabolic disorders，IMD)、嚴重聯(lián)合免疫缺陷病、囊性纖維化等。以IMD為例，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)目前在新生兒IMD的篩查中已得到廣泛應用，它可以在短時間內(nèi)對1個樣本進行幾十種代謝產(chǎn)物的分析，具有高靈敏性和特異性及快速、成本低的優(yōu)勢。由于IMD沒有特定的臨床表現(xiàn)，且質(zhì)譜檢測病種有限，同時涉及多個指標和比率，臨床較難判斷。如甲基丙二酸血癥和丙酸血癥質(zhì)譜指標均為C3及C3/C2。更有許多IMD存在亞型，并且不同亞型治療方案均有不同。因此，對質(zhì)譜后出現(xiàn)可疑陽性結(jié)果的患兒進行準確診斷非常重要，NGS能夠同時對多種基因進行突變分析，成為現(xiàn)階段遺傳代謝病診斷的重要手段。有研究對1 033例質(zhì)譜陽性患兒進行NGS，共診斷出各類遺傳代謝病194例，NGS均確定了疾病類型。鑒定出23種IMD，包括10種氨基酸代謝異常(43.5%)、8種有機酸缺陷病和5種脂肪酸氧化缺陷病[6]。另外，串聯(lián)質(zhì)譜結(jié)果反映的是體內(nèi)代謝物的異常，會受到嬰兒出生時的孕周、輸血情況、年齡等混雜因素的限制，NGS可以在分子層面提供明確診斷，以彌補質(zhì)譜技術(shù)的不足[7]。由于質(zhì)譜技術(shù)容易受環(huán)境因素的影響，無法區(qū)分受影響的患者及雜合攜帶狀態(tài)。有研究表明，NGS在解釋NBS中代謝物濃度異常方面很有價值，它可以區(qū)分此種情況，并可減少診斷的時間[8]。

但迄今為止，與質(zhì)譜技術(shù)的方法相比，基因檢測較質(zhì)譜技術(shù)費用高，檢測周期長，并且會帶來龐大的數(shù)據(jù)分析和難以解讀臨床意義的不明變異，會給臨床實驗室?guī)砗艽蟮奶魬?zhàn)。有研究對102例疑似IMD患兒進行了NGS，當生化實驗提示某種單基因病或特定的IMD時，NGS可以確診59%(39/66)的患兒，而當懷疑IMD但無臨床表型及生化特異性時，只有8%(3/36)的患兒通過NGS得到了診斷[9]。這說明了生化檢查和臨床表型在指導NGS數(shù)據(jù)分析中的作用。由美國國立衛(wèi)生研究院(national institutes of health，NIH)資助的基因組醫(yī)學和公共衛(wèi)生的新生兒測序(newborn sequencing in genomic medicine and public health，NSIHT)聯(lián)盟成立于2014年。NBseq計劃是NSIHT項目之一，它在182個經(jīng)生化檢測確診IMD的患兒樣本中，發(fā)現(xiàn)DNA測序遺漏了約20%確診病例，這些病例都是非常罕見的疾病，其中一些可能是由于DNA重組或調(diào)節(jié)基因活性的區(qū)域發(fā)生突變，外顯子測序無法檢測，使用全基因組測序又較為昂貴，并且結(jié)果解讀更具有挑戰(zhàn)性[10]。最近一項研究顯示，全外顯子測序技術(shù)(whole exome sequencing，WES)對于IMD的敏感性為88%，特異性為98.4%，而串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分別為99.0%和99.8%[11]，表明現(xiàn)階段NGS并不適合代替生化檢查作為一級的遺傳代謝病篩查方法。因此，將NGS技術(shù)應用到NBS中仍然是作為生化檢測結(jié)果陽性后的二級篩查方法。綜上所述，NGS和質(zhì)譜技術(shù)對IMD的篩查各有利弊，需要優(yōu)勢互補，才能發(fā)揮在臨床上的最大價值。

2高通量測序技術(shù)作為一級NBS手段的應用

隨著NGS成本的下降和基因數(shù)據(jù)庫的更新完善，人們開始考慮如何更大規(guī)模地應用DNA測序，并擴展篩查病種，以更早地發(fā)現(xiàn)由于基因缺陷而導致的新生兒健康問題，以及如何利用分子生物學改善兒童的臨床結(jié)局。

2.1高通量測序技術(shù)應用于高危新生兒疾病的篩查

任何一項技術(shù)運用于臨床中都是循序漸進的過程。在新生兒重癥監(jiān)護室(neonatal intensive care unit，NICU)中，遺傳性疾病和先天異常是導致患兒死亡的主要原因，將NGS運用于NICU中患兒的篩查是人們考慮進行廣泛NGS的第一步。對于危重患兒，得到準確診斷關(guān)乎生死，并可以縮短住院時間，改善臨床結(jié)局。Meng等[12]對278名小于100天的NICU嬰兒進行WES測序，總體診斷率為36.7%(102/278)，改善臨床結(jié)果52.0%(53/102)；另一項研究對25名NICU患兒行WES，診斷率為60%，改善臨床結(jié)果83%[13]，說明NGS測序是一種強大的工具，其使用對臨床決策有顯著影響。除此之外，NICU中的早產(chǎn)兒會因為器官系統(tǒng)不成熟，如肝臟酶活性較低、長期腸外營養(yǎng)需求等，會使NBS出現(xiàn)假陽性結(jié)果，需要反復進行NBS和額外的后續(xù)檢測，NGS可以幫助解釋此種情況[14]。有研究對NICU中的48例新生兒(非IMD疑似患兒)進行了NGS，共檢測到11例新生兒中有13種可能致病或致病突變，該研究的入選人群并不局限于懷疑患有特定遺傳代謝病者，為NGS用于NICU中患兒疾病的篩查提供了參考[15]。但是，由于測序結(jié)果的解釋可能會模棱兩可，測序中還會有次要發(fā)現(xiàn)，而且父母可能因為其產(chǎn)生的焦慮情緒及經(jīng)濟壓力，使這種方法在臨床上的運用受到了阻礙[16]。

2.2高通量測序技術(shù)應用于普通新生兒的篩查

基因組測序作為“個性化”或“精確”醫(yī)學的一部分，在醫(yī)學領域具有更廣泛的實際潛力[17]。1990年，沃爾特·吉爾伯特(Walter Gilbert)就預示了這一點，其推斷到2030年或2040年，所有新生兒出生時都會進行基因測序，有朝一日基因測序?qū)⒊蔀镹BS的重要手段。

普通新生兒無相關(guān)的臨床表型，對其進行基因測序主要是為了當前或未來疾病發(fā)生風險的預測。早些年，僅有少許國外文獻報道將NGS用于普通新生兒疾病的篩查[18]。對于發(fā)病概率很小的無癥狀人群，基因組測序的陽性或陰性預測價值尚不清楚，但是對于目前缺乏常規(guī)生化NBS方法的罕見疾病，可以將NGS用于一階篩查，篩查何種疾病需要仔細考慮各種因素，如發(fā)病年齡、嚴重程度、外顯率、確診方法、可治療性及預后[16]。BabySeq計劃[19]也是NSIHT項目之一，目的在于探索NGS在健康和患病新生兒中的應用情況，并評估NGS的醫(yī)學、行為和經(jīng)濟影響。它對127名普通新生兒和32名NICU中患兒進行WES測序，結(jié)果提示9.4%(10個普通，5個NICU)的新生兒有兒童期患病風險；另外在85名(3.5%)父母同意接受檢測關(guān)于成人發(fā)病風險變異的新生兒中，發(fā)現(xiàn)有3名(3.5%)會導致遺傳性乳腺癌、卵巢癌或林奇綜合征的致病變異，還發(fā)現(xiàn)有7名新生兒與藥物基因組學的相關(guān)變異[7]。該研究表明了NGS可以提醒攜帶者的父母注意遺傳風險，輔助臨床醫(yī)生為患兒家庭提供生育咨詢，且藥物基因組變異可以指導患兒選擇用藥。BabySeq計劃還分析了493位新生兒父母及144位臨床醫(yī)生對NBS和NGS效用和差異的看法，大多數(shù)父母(71%)和臨床醫(yī)生(51%)都認為NGS對孩子健康有益，但其覺得NGS(35%，70%)比NBS更具有風險(19%，39%)(均P<0.05)。與臨床醫(yī)生相比，新生兒父母們認為NGS的益處更多，風險更??；而與其父母相比，臨床醫(yī)生更關(guān)注與基因測序相關(guān)的隱私和歧視問題。大多數(shù)父母(93%)和所有臨床醫(yī)生(100%)都同意新生兒在出生后均應進行NBS，但只有33%的父母和8%的臨床醫(yī)生認為所有新生兒都應進行基因測序[20]。所以當想要將NGS廣泛實施前，除了關(guān)注其在臨床上使用的優(yōu)勢和缺點外，還有必要去了解新生兒父母和臨床醫(yī)生對NGS的態(tài)度、看法，以及怎么接受和評價NGS的診斷結(jié)果。

3展望與挑戰(zhàn)

高通量測序可通過一次性檢測數(shù)千種致病變異縮短診斷疾病的時間，甚至可檢測出未知的基因突變，明確未來疾病的發(fā)生風險，為早期干預、預防健康問題提供可能。這一系列優(yōu)勢使其近幾年得到了迅速發(fā)展，但與此同時，它也面臨著諸多挑戰(zhàn)。第一，主要是對基因變異的解釋，尤其對特定變異可能出現(xiàn)的臨床表型、嚴重程度和發(fā)病時間的預測尤其困難，現(xiàn)仍然缺乏足夠大的特定種族基因數(shù)據(jù)庫來準確評估某些變異的可能致病性。這些無法解釋的突變，統(tǒng)稱為意義未知的突變(VUS)，會構(gòu)成風險低估(突變是致病的，與疾病相關(guān)，被解釋為良性)和風險高估(良性突變被誤解為致病)的雙重危險。所以這一難題需要通過國際間聯(lián)合構(gòu)建共享數(shù)據(jù)庫，以可靠的實驗室快速診斷技術(shù)，解決龐大的數(shù)據(jù)分析問題。第二，目前全國范圍內(nèi)的NBS是國家優(yōu)生優(yōu)育強制性的政策。若在新生兒篩查中引入NGS，因為涉及隱私、倫理問題及對意義未知突變帶來的心理壓力，可能會遭到父母的拒絕。針對這種情況，可以設計一組與可防可治疾病相關(guān)的高風險基因突變位點進行靶向基因測序，并且這些疾病得到良好預后的關(guān)鍵是從新生期或幼兒時期就開始干預。同時，它也不太可能取代目前所有的NBS手段，因為串聯(lián)質(zhì)譜等生化測試在檢測某些疾病方面更具有優(yōu)勢，所以須將各種檢驗手段依據(jù)其優(yōu)勢應用于臨床，才可以使檢驗手段更加成熟完善。