莫榮艷，熊麗文，梁惠娟，黃 鈺，黎益圖，何 濤，覃 磊

（來賓市動物疫病預(yù)防控制中心 546100）

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用液相阻斷ELISA 檢測方法檢測豬血清樣品80份，快速檢測豬的O 型口蹄疫抗體效價(jià)≥1∶64 有多少份。 ELISA抗體效價(jià)與免疫動物攻毒保護(hù)的關(guān)系：豬的抗體效價(jià)≥1∶64,99%以上保護(hù)；抗體效價(jià)＜1∶4，不保護(hù)；效價(jià)在1∶4～45,50%保護(hù)。

1 材料和方法

檢測樣品：豬血清80 份（樣品不能有溶血狀態(tài)、受污染、破損、變質(zhì))，編號為DA1～DA80。

實(shí)驗(yàn)器材：酶標(biāo)儀；37℃恒溫箱；超純水儀；移液器；配套移液槍尖；96 孔U 型微量血凝板；移液槽；吸水紙；檢測試劑盒是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫病毒O 型抗體液相阻斷ELISA 檢測試劑盒。

2 試劑準(zhǔn)備

將口蹄疫病毒O 型抗體液相阻斷ELISA 檢測試劑盒從冰箱取出，放置常溫解凍，試劑恢復(fù)常溫后使用。 打開超純水儀，取出2L 超純水裝在容器備用，按照檢測試劑盒說明書，配制25倍PBST 濃縮液，用超純水稀釋成1 倍PBST（例如：1mL 濃縮液加入24mL 超純水）。 打開恒溫箱電源，設(shè)置溫度到37℃，溫度上升到37℃才能按實(shí)驗(yàn)要求正常工作。 配制口蹄疫O 型病毒抗原：按照抗原配制比例,用PBST 稀釋液稀釋到工作濃度（1∶25，即1mL 病毒抗原加24mL PBST 稀釋液）。

3 實(shí)驗(yàn)操作步驟

3.1 稀釋血清 80 份血清需要96 孔U 型微量血凝板共5塊，在血凝板邊緣標(biāo)記數(shù)字（橫向標(biāo)記為1,2-12，縱向標(biāo)記為A,B-H），一塊板可以稀釋16 份血清樣品。例如編號為DA1 的血清樣品，先在血凝板上A1～A5 孔中入PBST 稀釋液50μL，然后在第A1 孔加入血清樣品50μL， 混勻后吸出50μL 移到第A2 孔，依次稀釋到第A5 孔， 從第A5 孔中吸出50μL 移到抗原抗體反應(yīng)板（例如放在A1 孔）。把所有樣品稀釋完后移到抗原抗體反應(yīng)板，對樣品所在的位置做好標(biāo)記。 用10～100μL 8 道移液器來稀釋血清，這樣效率更高。

3.2 陽性對照稀釋 在抗原抗體反應(yīng)板A11～H11 孔先加入PBST 稀釋液50μL/孔， 然后在A11 孔中加入陽性對照50μL，混勻后吸出50μL 移到B11 孔，依次稀釋到H11 孔，從H11 孔中吸出50μL 棄掉。

3.3 陰性對照稀釋 在抗原抗體反應(yīng)板A12～B12 孔 （例如）先加入PBST 稀釋液50μL /孔， 然后在A12 孔中加入陰性對照50μL，混勻后吸出50μL 移到B12 孔，從B12 孔中吸出50μl 棄掉。

3.4 在樣品孔、陽性對照孔、陰性對照孔中加入50μL/孔口蹄疫O 型病毒抗原（1×），在E12～H12 孔中只加口蹄疫O 型病毒抗原（1×）100 μL /孔，蓋膜封板，振蕩反應(yīng)板10s 左右，然后放冰箱4℃靜置過夜或放恒溫箱37℃溫育90min。

3.5 將抗原抗體混合液從抗原抗體反應(yīng)板上按次序轉(zhuǎn)移至已包被口蹄疫O 型兔抗的ELISA 板上，50μL /孔， 蓋膜封板，放恒溫箱37℃溫育60min。

3.6 從恒溫箱取板出來，甩掉板上的液體，每孔加入300μL PBST 稀釋液洗板，連續(xù)洗板3～5 次，在吸水紙上甩干（可以把反應(yīng)板倒置對著燈光看，孔里沒有水珠就可以了）。 按50μL /孔加口蹄疫O 型豚鼠抗體工作液， 蓋膜封板， 放恒溫箱37℃溫育30min。

3.7 從恒溫箱取板出來，甩掉板上的液體，每孔加入300μL PBST 稀釋液，連續(xù)洗板3～5 次，在吸水紙上甩干，按50μL /孔加兔抗豚鼠IgG-HRP 工作液， 蓋膜封板， 放恒溫箱37℃溫育30min。

3.8 從恒溫箱取板出來，甩掉板上的液體，每孔加入300μL PBST 稀釋液，連續(xù)洗板3～5 次，在吸水紙上甩干，TMB 底物A 溶液和底物B 溶液以1∶1 比例混勻， 用移液器吸出TMB 底物A 溶液2.5mL 和底物B 溶液2.5mL 混勻（按實(shí)際用量計(jì)算，免得浪費(fèi)試劑），加入混勻的底物溶液50μL /孔，37℃避光（可以在包被板上蓋上報(bào)紙）顯色15min。

3.9 從恒溫箱取板出來，加入終止液50μL /孔，終止反應(yīng)，打開酶標(biāo)儀，在酶標(biāo)儀上讀取D450nm 值。

4 結(jié)果判定

4.1 實(shí)驗(yàn)認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)：每板設(shè)4 孔病毒抗原對照，病毒抗原對照D450nm 值應(yīng)在1.0 以上。陽性對照抗體效價(jià)應(yīng)在1∶1024±1 滴度以內(nèi)，陰性對照血清抗體效價(jià)應(yīng)＜1∶8。

4.2 血清抗體效價(jià)的判定：病毒抗原對照4 孔，棄去最高和最低D450nm 值，計(jì)算剩余2 孔的平均D450nm 值，再除以2，即50%對照值， 該值即為臨界值， 表示阻斷50%反應(yīng)的對照D450nm 值。 被檢血清D450nm 值大于臨界值的孔為陰性孔，小于等于臨界值的孔為陽性孔。

5 小結(jié)與討論

液相阻斷ELISA 免疫抗體檢測方法，具有靈敏性、特異性和穩(wěn)定性，能及時(shí)、準(zhǔn)確的監(jiān)測抗體，為防控口蹄疫O 型疫病提供了有效保障。 80 份豬血清, 結(jié)果是陽性有78 份，陰性有2 份，抗體保護(hù)率為98%。 通過這個(gè)口蹄疫病毒O 型液相阻斷ELISA 免疫抗體檢測快捷方法，能快速、高效的提高工作效率。