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        口蹄疫病毒O 型液相阻斷ELISA 免疫抗體檢測快捷方法

        2021-03-28 15:57:36莫榮艷熊麗文梁惠娟黎益圖
        今日畜牧獸醫(yī) 2021年1期
        關(guān)鍵詞:孔中恒溫箱稀釋液

        莫榮艷,熊麗文,梁惠娟,黃 鈺,黎益圖,何 濤,覃 磊

        (來賓市動物疫病預(yù)防控制中心 546100)

        本實驗應(yīng)用液相阻斷ELISA 檢測方法檢測豬血清樣品80份,快速檢測豬的O 型口蹄疫抗體效價≥1∶64 有多少份。 ELISA抗體效價與免疫動物攻毒保護(hù)的關(guān)系:豬的抗體效價≥1∶64,99%以上保護(hù);抗體效價<1∶4,不保護(hù);效價在1∶4~45,50%保護(hù)。

        1 材料和方法

        檢測樣品:豬血清80 份(樣品不能有溶血狀態(tài)、受污染、破損、變質(zhì)),編號為DA1~DA80。

        實驗器材:酶標(biāo)儀;37℃恒溫箱;超純水儀;移液器;配套移液槍尖;96 孔U 型微量血凝板;移液槽;吸水紙;檢測試劑盒是中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所口蹄疫病毒O 型抗體液相阻斷ELISA 檢測試劑盒。

        2 試劑準(zhǔn)備

        將口蹄疫病毒O 型抗體液相阻斷ELISA 檢測試劑盒從冰箱取出,放置常溫解凍,試劑恢復(fù)常溫后使用。 打開超純水儀,取出2L 超純水裝在容器備用,按照檢測試劑盒說明書,配制25倍PBST 濃縮液,用超純水稀釋成1 倍PBST(例如:1mL 濃縮液加入24mL 超純水)。 打開恒溫箱電源,設(shè)置溫度到37℃,溫度上升到37℃才能按實驗要求正常工作。 配制口蹄疫O 型病毒抗原:按照抗原配制比例,用PBST 稀釋液稀釋到工作濃度(1∶25,即1mL 病毒抗原加24mL PBST 稀釋液)。

        3 實驗操作步驟

        3.1 稀釋血清 80 份血清需要96 孔U 型微量血凝板共5塊,在血凝板邊緣標(biāo)記數(shù)字(橫向標(biāo)記為1,2-12,縱向標(biāo)記為A,B-H),一塊板可以稀釋16 份血清樣品。例如編號為DA1 的血清樣品,先在血凝板上A1~A5 孔中入PBST 稀釋液50μL,然后在第A1 孔加入血清樣品50μL, 混勻后吸出50μL 移到第A2 孔,依次稀釋到第A5 孔, 從第A5 孔中吸出50μL 移到抗原抗體反應(yīng)板(例如放在A1 孔)。把所有樣品稀釋完后移到抗原抗體反應(yīng)板,對樣品所在的位置做好標(biāo)記。 用10~100μL 8 道移液器來稀釋血清,這樣效率更高。

        3.2 陽性對照稀釋 在抗原抗體反應(yīng)板A11~H11 孔先加入PBST 稀釋液50μL/孔, 然后在A11 孔中加入陽性對照50μL,混勻后吸出50μL 移到B11 孔,依次稀釋到H11 孔,從H11 孔中吸出50μL 棄掉。

        3.3 陰性對照稀釋 在抗原抗體反應(yīng)板A12~B12 孔 (例如)先加入PBST 稀釋液50μL /孔, 然后在A12 孔中加入陰性對照50μL,混勻后吸出50μL 移到B12 孔,從B12 孔中吸出50μl 棄掉。

        3.4 在樣品孔、陽性對照孔、陰性對照孔中加入50μL/孔口蹄疫O 型病毒抗原(1×),在E12~H12 孔中只加口蹄疫O 型病毒抗原(1×)100 μL /孔,蓋膜封板,振蕩反應(yīng)板10s 左右,然后放冰箱4℃靜置過夜或放恒溫箱37℃溫育90min。

        3.5 將抗原抗體混合液從抗原抗體反應(yīng)板上按次序轉(zhuǎn)移至已包被口蹄疫O 型兔抗的ELISA 板上,50μL /孔, 蓋膜封板,放恒溫箱37℃溫育60min。

        3.6 從恒溫箱取板出來,甩掉板上的液體,每孔加入300μL PBST 稀釋液洗板,連續(xù)洗板3~5 次,在吸水紙上甩干(可以把反應(yīng)板倒置對著燈光看,孔里沒有水珠就可以了)。 按50μL /孔加口蹄疫O 型豚鼠抗體工作液, 蓋膜封板, 放恒溫箱37℃溫育30min。

        3.7 從恒溫箱取板出來,甩掉板上的液體,每孔加入300μL PBST 稀釋液,連續(xù)洗板3~5 次,在吸水紙上甩干,按50μL /孔加兔抗豚鼠IgG-HRP 工作液, 蓋膜封板, 放恒溫箱37℃溫育30min。

        3.8 從恒溫箱取板出來,甩掉板上的液體,每孔加入300μL PBST 稀釋液,連續(xù)洗板3~5 次,在吸水紙上甩干,TMB 底物A 溶液和底物B 溶液以1∶1 比例混勻, 用移液器吸出TMB 底物A 溶液2.5mL 和底物B 溶液2.5mL 混勻(按實際用量計算,免得浪費試劑),加入混勻的底物溶液50μL /孔,37℃避光(可以在包被板上蓋上報紙)顯色15min。

        3.9 從恒溫箱取板出來,加入終止液50μL /孔,終止反應(yīng),打開酶標(biāo)儀,在酶標(biāo)儀上讀取D450nm 值。

        4 結(jié)果判定

        4.1 實驗認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn):每板設(shè)4 孔病毒抗原對照,病毒抗原對照D450nm 值應(yīng)在1.0 以上。陽性對照抗體效價應(yīng)在1∶1024±1 滴度以內(nèi),陰性對照血清抗體效價應(yīng)<1∶8。

        4.2 血清抗體效價的判定:病毒抗原對照4 孔,棄去最高和最低D450nm 值,計算剩余2 孔的平均D450nm 值,再除以2,即50%對照值, 該值即為臨界值, 表示阻斷50%反應(yīng)的對照D450nm 值。 被檢血清D450nm 值大于臨界值的孔為陰性孔,小于等于臨界值的孔為陽性孔。

        5 小結(jié)與討論

        液相阻斷ELISA 免疫抗體檢測方法,具有靈敏性、特異性和穩(wěn)定性,能及時、準(zhǔn)確的監(jiān)測抗體,為防控口蹄疫O 型疫病提供了有效保障。 80 份豬血清, 結(jié)果是陽性有78 份,陰性有2 份,抗體保護(hù)率為98%。 通過這個口蹄疫病毒O 型液相阻斷ELISA 免疫抗體檢測快捷方法,能快速、高效的提高工作效率。

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