田曼 祁正亮

鑒于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫發(fā)病率逐年上升,相關(guān)實(shí)驗(yàn)及臨床研究也日益受到重視,常用治療方案中理氣消癭方作為常用中藥湯劑,臨床治療中已取得一定應(yīng)用效果,不過(guò)其具體藥物生效的分子機(jī)制尚未被闡明［1,2］。本文擬采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)PI3K/Akt 信號(hào)通路中分子蛋白的表達(dá),從細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)層面,研究中藥理氣消癭方對(duì)PI3K/Akt 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中相關(guān)分子表達(dá)的影響和內(nèi)在規(guī)律,從而闡明其治療結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的作用機(jī)制,進(jìn)一步為其臨床推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 大鼠信息 Wist-ar 雄性大白鼠60 只,自湖北疾病控制中心處購(gòu)得,許可證號(hào)為SCXK(鄂)2015-0018,大鼠平均體重為(223.52±10.25)g。

1.2 方法

1.2.1 主要儀器 北京大龍控股有限公司聲場(chǎng)的微量移液器,ABI 公司提供的QuantStudio 6 型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀,北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司提供的EDC-810 型PCR 儀。

1.2.2 處理方法 將60 只大鼠以隨機(jī)數(shù)字法分為空白對(duì)照組、消癭方組、模型組、優(yōu)甲樂(lè)組,每組15 只,實(shí)驗(yàn)前置于同一室內(nèi)環(huán)境下飼喂,室溫控制在20℃,恒濕50%。

1.2.2.1 造模 大鼠飼喂14 d 后開(kāi)始造模,除空白對(duì)照組外其余3 組小鼠均給予濃度為0.1%的丙基硫氧嘧啶(PTU)溶液,早晨灌胃1 次,持續(xù)灌服8 周,利用多普勒超聲完成造模檢查,確定造模成功后開(kāi)始后續(xù)試驗(yàn)［3］。

1.2.2.2 給藥 空白對(duì)照組：堅(jiān)持每日進(jìn)行普通胃喂養(yǎng)并給予生理鹽水灌胃,2 次/d,灌胃2～3 ml/次。模型組：完成造模后同樣給予生理鹽水灌胃,方案與空白對(duì)照組一致。優(yōu)甲樂(lè)組：給予優(yōu)甲樂(lè)(深圳市中聯(lián)制藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H20010522)溶液灌服,濃度0.1 mg/L,1 ml/100 g。消癭方組：給予活血消癭方(湖北省中醫(yī)院藥劑科,批號(hào)：鄂藥科試劑Z20090005)灌服,組方為：柴胡、青皮、橘葉、郁金、蜣螂蟲、細(xì)辛、三棱、白芥子、萊菔子、瓜蔞皮,每片含生藥0.45 g,將藥碾末后傾入離心管,加Milli-Q 純水振蕩混勻配制成15%混懸液,灌服給予濃度為88 g/L 的理氣消癭方溶液,灌服,1 次/d,持續(xù)灌服8 周。

1.2.3 標(biāo)本獲取 完成最后1 次干預(yù)后禁食12 h、禁飲2 h,給予常規(guī)麻醉后固定于鼠臺(tái),切開(kāi)大鼠頸部皮膚,暴露氣管后找到兩側(cè)甲狀腺,分離周圍組織后取部分甲狀腺組織,保存在2 ml 凍藏管內(nèi),并放入冰箱備用,溫度為-20℃。

1.2.4 RT-PCR 檢測(cè) ①PI3K 引物順序?yàn)椋?'-GC TCTTCTTCCACCTGTCTCG-3'/5'-CACAGCCCGAAGT CCGTTA-3',擴(kuò)增產(chǎn)物大小為176 bp,Akt 引物順序?yàn)椋?'-TGAGACCGACACCAGGTATTTTG-3'/5'-GCTGAG TAGGAGAACTGGGGAA-3',擴(kuò)增產(chǎn)物大小為135 bp［4］。Tunel 試劑盒及配套試劑(Roche,貨號(hào)11681817910),DAB顯色劑(DAKO,貨號(hào)K5007)。②RNA 獲取：13000 r/min完成離心,離心時(shí)間10 min,后續(xù)加入250 μl 氯仿,震蕩離心管15 s 后孵育3 min,再以相同轉(zhuǎn)速離心8 min,轉(zhuǎn)移上清液至新離心管內(nèi),加入0.8 倍體積異丙醇,孵育15 min,再度離心10 min,獲得RNA。③反轉(zhuǎn)錄：取PCR 管,加入總RNA 2 μg,加入去離子水10 μl,并置入dT 18 μl,混合均勻后完成離心,冷卻后加入反應(yīng)試劑,在42℃條件下孵育60 min,給予80℃加熱,持續(xù)5 min 終止反應(yīng)。取0.5 ml PCR 管,逐次加入試劑并完成PCR 擴(kuò)充,使用△△CT 法完成結(jié)果處理。

1.3 觀察指標(biāo) 比較四組大鼠 PI3K、Akt 信號(hào)通路分子表達(dá)量以及1 個(gè)月內(nèi)存活情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組PI3K 信號(hào)通路分子表達(dá)量比較 空白對(duì)照組PI3K 信號(hào)通路分子表達(dá)量為(1.00±0.01)低于模型組的(1.52±0.07)、優(yōu)甲樂(lè)組的(1.41±0.07)、消癭方組的(1.31±0.08),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=28.482、22.457、14.892,P＜0.05)。消癭方組PI3K 信號(hào)通路分子表達(dá)量明顯低于模型組及優(yōu)甲樂(lè)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=7.651、3.643,P＜0.05)。

2.2 四組Akt 信號(hào)通路分子表達(dá)量比較 空白對(duì)照組Akt 信號(hào)通路分子表達(dá)量為(1.00±0.01)低于模型組的(2.14±0.08)、優(yōu)甲樂(lè)組的(2.01±0.03)、消癭方組的(1.67±0.07),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=54.764、123.70、36.697,P＜0.05)。消癭方組Akt 信號(hào)通路分子表達(dá)量均低于模型組、優(yōu)甲樂(lè)組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.124、12.388,P＜0.05)。

2.3 四組大鼠存活情況比較 空白對(duì)照組存活15 只,存活率為100.00%；模型組存活5 只,存活率為33.33%；優(yōu)甲樂(lè)組存活8 只,存活率為53.33%；消癭方組存活15 只,存活率為100.00%?？瞻讓?duì)照組小鼠存活率100.00%明顯高于模型組的33.33%、優(yōu)甲樂(lè)組的53.33%,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；空白對(duì)照組與消癭方組大鼠存活率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

甲狀腺腫屬于常見(jiàn)甲狀腺疾病。觸診和高分辨率超聲檢查發(fā)現(xiàn)的人群甲狀腺結(jié)節(jié)患病率分別為3%～7%和20%～76%［5］。甲狀腺單發(fā)結(jié)節(jié)患病率為11.6%,甲狀腺多發(fā)結(jié)節(jié)發(fā)病率為7%,近年來(lái),此病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì),而臨床上也越來(lái)越多見(jiàn)其與甲狀腺癌并存的報(bào)道。

當(dāng)前本病的研究分析認(rèn)為細(xì)胞異常凋亡/增生在甲狀腺腫發(fā)生中起到了重要作用。在部分學(xué)者的研究中發(fā)現(xiàn),甲狀腺腫合并有增生結(jié)節(jié)的患者其P27 表達(dá)量明顯高于甲狀腺癌及單純甲狀腺腫患者,提示患者病灶處于細(xì)胞增殖階段,因而猜測(cè)結(jié)節(jié)性甲狀腺腫存在一定惡變轉(zhuǎn)化能力。而在人TNF 相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRALL)檢測(cè)中有學(xué)者發(fā)現(xiàn),甲狀腺癌與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者TRALL 陽(yáng)性表達(dá)率較正常人冥想更高,推測(cè)細(xì)胞的增生與凋亡關(guān)系失衡為也可能為本病發(fā)展的重要因素。

在分子調(diào)控機(jī)制的研究中指出,PI3K/Akt 信號(hào)通路可對(duì)機(jī)體細(xì)胞的增殖、凋亡進(jìn)行調(diào)控,其中Akt 能夠有效利用磷酸化絲氨酸等對(duì)細(xì)胞的存活及增殖產(chǎn)生影響,其主要利用激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及其相應(yīng)下游途徑完成特殊蛋白翻譯,促成細(xì)胞增殖。該分子通路可激活P70S6K,完成核糖體蛋白mRNA 翻譯,另外也可通過(guò)促進(jìn)4E-BP-1 進(jìn)一步完成磷酸化,達(dá)到增加mRNA 轉(zhuǎn)錄的效果,繼而對(duì)蛋白質(zhì)合成產(chǎn)生調(diào)控作用。PI3K/Akt 信號(hào)通路均可抑制4E-BP-1 表達(dá),達(dá)到調(diào)控細(xì)胞增殖的效果,此外還可對(duì)P21、P27 的表達(dá)進(jìn)行抑制,對(duì)G1期進(jìn)程起到加速作用,促使細(xì)胞分化。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中,PI3K/Akt 信號(hào)通路可通過(guò)抑制Forkhead 家族轉(zhuǎn)錄因子活性對(duì)BAD的多種物質(zhì)進(jìn)行磷酸化,阻斷P53,調(diào)節(jié)NF-κB,上調(diào)凋亡抑制因子(IAPs)表達(dá)等充分對(duì)細(xì)胞凋亡產(chǎn)生抑制。就本次研究結(jié)果顯示,空白對(duì)照組PI3K 信號(hào)通路分子表達(dá)量低于模型組、優(yōu)甲樂(lè)組、消癭方組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。空白對(duì)照組Akt 信號(hào)通路分子表達(dá)量低于模型組、優(yōu)甲樂(lè)組、消癭方組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。表明在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的發(fā)生與PI3K/Akt 信號(hào)通路表達(dá)上調(diào)有直接關(guān)聯(lián)。

臨床結(jié)節(jié)性甲狀腺腫治療中常用優(yōu)甲樂(lè)為常用藥物,其主要通過(guò)增加機(jī)體蛋白酶的合成及酶活性影響患者細(xì)胞增殖發(fā)育達(dá)到治療目的,但臨床應(yīng)用中存在一定局限性。結(jié)節(jié)性甲狀腺在中醫(yī)學(xué)上歸屬于“結(jié)癭”范疇,結(jié)節(jié)性甲狀腺腫以正氣虧虛為發(fā)病內(nèi)因,誘因?yàn)榍橹臼д{(diào),高發(fā)原因?yàn)轱嬍称鹁邮С?在整個(gè)發(fā)病過(guò)程中痰瘀貫穿其中,作為一個(gè)病理環(huán)節(jié)極為重要,也極易導(dǎo)致該病反復(fù)復(fù)發(fā)和遷延難愈,結(jié)節(jié)性甲狀腺腫痰血瘀阻不但具備痰瘀的特點(diǎn),而且呈現(xiàn)自身特點(diǎn),以甲狀腺結(jié)節(jié)、甲狀腺局部疼痛、甲狀腺腫大等為主要臨床表現(xiàn)。消癭方由柴胡、青皮、橘葉、郁金、蜣螂蟲等多種中藥材組合而成,主要用于活血化瘀,組方內(nèi)郁金可活血止痛、行氣解郁；柴胡疏肝破氣,消積化滯；橘皮理氣健脾、燥濕化痰；細(xì)辛祛風(fēng)止痛；三棱破血行氣、降氣化痰；萊菔子消積止痛、消食除脹；蜣螂蟲活血止痛；瓜蔞皮清化熱痰,利氣寬胸；柴胡具有升舉陽(yáng)氣之效,多藥合用于本病治療中效果明顯,已為臨床驗(yàn)證。經(jīng)本次大鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),消癭方組PI3K/Akt信號(hào)通路分子表達(dá)量均明顯低于模型組及優(yōu)甲樂(lè)組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)?？瞻讓?duì)照組小鼠存活率100.00%明顯高于模型組的33.33%、優(yōu)甲樂(lè)組的53.33%,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；空白對(duì)照組與消癭方組大鼠存活率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。猜測(cè)本方可抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路激活達(dá)到調(diào)控患者細(xì)胞凋亡/增殖的目的,繼而對(duì)本病起到一定治療效果。

在胡根等［5］的研究中同樣進(jìn)行分組研究,發(fā)現(xiàn)模型鼠的PI3K/Akt 信號(hào)通路分子表達(dá)量較空白對(duì)照組明顯更高,而應(yīng)用消癭方治療的大鼠PI3K/Akt 信號(hào)通路分子表達(dá)量較常規(guī)西藥治療及模型鼠明顯更低。本次研究與其研究存在一定相似性。

綜上所述,消癭方用于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫治療中可通過(guò)抑制PI3K/Akt 信號(hào)通路的激活,達(dá)到治療目的。