曾韻穎，陳信忠，龔艷清，郭書林，朱黃鑫

（廈門海關(guān)，福建廈門 361026）

螯蝦種類繁多，分布廣泛，主要棲于淡水，耐污能力強(qiáng)，多種螯蝦可供人類食用，具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值。此外，一些螯蝦體色艷麗美觀，而且容易飼養(yǎng)，近年來(lái)成為觀賞水族館里的新寵。變形藻絲囊霉（Aphanomyces astaci，A.astaci）導(dǎo)致的螯蝦瘟是最嚴(yán)重的流行病之一，對(duì)全球螯蝦物種構(gòu)成了重大威脅，已導(dǎo)致歐洲和亞洲的本土螯蝦大量死亡。A.astaci是全球100 種最嚴(yán)重的外來(lái)入侵物種之一[1]。

由于源產(chǎn)螯蝦種類很少，我國(guó)于20 世紀(jì)40 年代從北美引進(jìn)了俗稱小龍蝦的克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），因其生存和繁殖能力強(qiáng)，成為我國(guó)主要養(yǎng)殖品種。20 世紀(jì)90 年代我國(guó)又從澳大利亞引進(jìn)了澳洲淡水龍蝦紅螯螯蝦（Cherax quadricarinatus），因其食性廣、生長(zhǎng)快、肉質(zhì)鮮美，深受市場(chǎng)歡迎。我國(guó)已成為全球最大的螯蝦生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)。目前除臺(tái)灣地區(qū)外，我國(guó)大陸地區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖螯蝦發(fā)生螯蝦瘟。本文對(duì)螯蝦瘟的病原學(xué)、流行病學(xué)和診斷技術(shù)進(jìn)行綜述，以期為我國(guó)螯蝦瘟防控技術(shù)儲(chǔ)備研究提供參考。

1 病原

1.1 病原及分類

螯蝦瘟的病原主要為A.astaci，其屬于卵菌綱（Oomycota）水霉目（Saprolegniales），因具有絲狀等特性而被歸入真菌。但其與真菌有明顯不同，而與褐藻和硅藻關(guān)系更密切，因此卵菌綱與硅藻和褐藻一起被歸為菌界（Stramenopiles）或藻物界（Chromista）。

基于隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）的研究[2-4]，發(fā)現(xiàn)A.astaci有5 個(gè)基因型，被歸為4 個(gè)群或4種菌株：A 群（Astacus，簡(jiǎn)稱As 菌株）來(lái)自?shī)W斯塔歐洲螯蝦（A.astacus）和格魯西東歐螯蝦（A.leptodactylus）；B 群（PacifastacusI，簡(jiǎn)稱PsI 菌株）來(lái)自瑞典奧斯塔歐洲螯蝦和歐洲的信號(hào)螯蝦（P.leniusculus）；C 群（PacifastacusII，簡(jiǎn)稱PsII 菌株）來(lái)自加拿大信號(hào)螯蝦；D 群（ProcambarusII，簡(jiǎn)稱Pc 菌株）來(lái)自西班牙克氏原螯蝦。除此之外，Makkonen 等[5]報(bào)告了來(lái)自叉肢螯蝦（Orconectes limosus）的E 群e 菌株。文獻(xiàn)[6]報(bào)道，PsI 菌株致病力最強(qiáng)，可導(dǎo)致所有奧斯塔歐洲螯蝦在幾天內(nèi)死亡，而As 菌株毒力一般較弱。

有關(guān)A.astaci的基因組已有較多的研究報(bào)告。Makkonen 等[7]對(duì)A.astaciPc 基因型菌株P(guān)O3 和魚類流行性潰瘍綜合征病原入侵絲囊霉（A.invadans）菌株NJM9701 線粒體DNA（mtDNA）基因組進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)兩者的mtDNA 分別為 49 489 bp 和49 061 bp，具有相似的遺傳內(nèi)容和結(jié)構(gòu)，編碼35 種蛋白質(zhì)。

近年來(lái)有很多學(xué)者對(duì)不同地區(qū)的A.astaci菌株基因型進(jìn)行了研究。Martín-Torrijos 等[8]報(bào)告：來(lái)自美國(guó)東南部螯蝦和對(duì)蝦的A.astaci線粒體rnnS和rnnL基因具有迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最高遺傳多樣性，包含8 個(gè)基因型，其中6 個(gè)為新描述的基因型；A.astaci在該地區(qū)分布廣泛，遺傳多樣，支持螯蝦瘟起源于美國(guó)東南部的假說(shuō)；A.astaci沒(méi)有表現(xiàn)出明確的物種特異性或地理模式。

在歐洲，Moj?i?ová 等[9]對(duì)2014—2019 年發(fā)生在捷克的螯蝦瘟病原基因型進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)與宿主克氏原螯蝦有關(guān)的D 群菌株導(dǎo)致了捷克奧斯塔歐洲螯蝦和石螯蝦（Austropotamobius torrentium）大量死亡。微衛(wèi)星基因分型技術(shù)也重新鑒定了兩個(gè)As 中獨(dú)特的SSR 基因型。Rezinciuc等[10]對(duì)白圓鉗螯蝦（Austropotamobius pallipes）分離的A.astaci菌株進(jìn)行AFLP-PCR 分析，發(fā)現(xiàn)所有菌株均為D 群，并具有相似的適應(yīng)溫暖水溫的特性。Panteleit 等[3]2018 年報(bào)告格魯西東歐螯蝦A.astaci感染率為9%，叉肢螯蝦感染率為8%。所有海洋十足目動(dòng)物中均未檢測(cè)出A.astaci。來(lái)自德涅斯特河的格魯西東歐螯蝦攜帶B 群菌株，而來(lái)自多瑙河三角洲的A.astaci屬于A 群和B 群。在多瑙河的入侵螯蝦種群中還發(fā)現(xiàn)A 群A.astaci。微衛(wèi)星分析揭示了與基因型Up 相同的基因型。Makkonen 等[11]比較了3 種基因型的A.astaci菌株對(duì)奧斯塔歐洲螯蝦的致病力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PsI 菌株具有高致病力，可在幾天內(nèi)殺死所有螯蝦；兩種As菌株致病力較小，部分受感染螯蝦未出現(xiàn)死亡；試驗(yàn)證實(shí)兩種As 菌株之間的毒力存在差異；另外還發(fā)現(xiàn)部分奧斯塔歐洲螯蝦對(duì)螯蝦瘟抵抗力有所增強(qiáng)，尤其對(duì)As 菌株。Makkonen 等[12]報(bào)告不同A.astaci基因型之間的毒力存在明顯差異：PsI 菌株在人工感染的奧斯塔歐洲螯蝦種群中可引起快速發(fā)病和死亡，而As 菌株的毒力存在差異，表現(xiàn)出更多可變性，如部分奧斯塔歐洲螯蝦種群對(duì)一些As菌株表現(xiàn)出明顯增加的抗性。

除了常見的A.astaci，引起螯蝦疫病的病原可能還包括其他致病的絲囊霉。Viljamaa-Dirks 等[13]報(bào)告了一種導(dǎo)致奧斯塔歐洲螯蝦暴發(fā)螯蝦瘟的新病原，暫定為芬尼克絲囊霉（Aphanomyces fennicussp.novum）。該病原與A.astaci非常相似，采用OIE 推薦的特異性檢測(cè)A.astaciITS基因的普通PCR 和qPCR 檢測(cè)，結(jié)果均呈陽(yáng)性，但通過(guò)有關(guān)菌絲結(jié)構(gòu)和厚壁孢子形成的形態(tài)學(xué)特征，以及使用RAPD-PCR 法、微衛(wèi)星基因分型法、病原毒力檢測(cè)和基于ITS測(cè)序的系統(tǒng)發(fā)育分析等方法，可以將該菌與A.astaci區(qū)分。Makkonen 等[14]從美國(guó)加州的信號(hào)螯蝦中分離了35 個(gè)A.astaci菌株和2 個(gè)新的絲囊霉屬菌株，發(fā)現(xiàn)其中A.astaciB 群菌株對(duì)奧斯塔歐洲螯蝦有很強(qiáng)的毒力；一個(gè)新菌株與在中歐水蚤中發(fā)現(xiàn)的絲囊霉高度相似，另一個(gè)新菌株與芬蘭的奧斯塔歐洲螯蝦中分離的變形藻絲囊霉或芬尼克絲囊霉分離株（序列相似性為93%）關(guān)系最密切，兩種新菌株都不會(huì)引起螯蝦死亡。絲囊霉屬物種的多樣性尚未完全被闡明，因?yàn)橥坏攸c(diǎn)采集的少量螯蝦中發(fā)現(xiàn)了多種絲囊霉屬物種。

1.2 病原生物學(xué)特性

A.astaci生活史簡(jiǎn)單。營(yíng)養(yǎng)菌絲侵入宿主組織后產(chǎn)生基質(zhì)外孢子囊，孢子囊釋放變形蟲樣的初生孢子，隨后釋放出雙鞭毛游動(dòng)孢子。游動(dòng)孢子在水中游動(dòng)，當(dāng)遇到易感寄主時(shí)，就附著并發(fā)芽，產(chǎn)生侵入性營(yíng)養(yǎng)菌絲。游動(dòng)孢子對(duì)螯蝦角質(zhì)層具有趨化性。

不同A.astaci菌株的最佳生長(zhǎng)溫度有所不同。在實(shí)驗(yàn)室條件下，菌絲體在4.0～29.5 ℃均可生長(zhǎng)。但大多數(shù)菌株的適宜生長(zhǎng)溫度小于18 ℃，水溫高于21 ℃時(shí)生長(zhǎng)緩慢。種群間傳播速度取決于水溫等多個(gè)因素?，F(xiàn)場(chǎng)觀察表明：在4～16 ℃時(shí)，較高的水溫會(huì)加快傳播速度；在低水溫時(shí)，傳播曲線增長(zhǎng)非常緩慢，宿主發(fā)生死亡的時(shí)間可能長(zhǎng)達(dá)數(shù)月。從克氏原螯蝦分離的菌株在較高水溫下生長(zhǎng)得更好[10]。

A.astaci孢子形成對(duì)于疾病的傳播至關(guān)重要。Strand 等[15]報(bào)告了隱性攜帶者螯蝦釋放A.astaci孢子的動(dòng)態(tài)過(guò)程：在沒(méi)有死亡和脫殼的情況下，隱性感染的螯蝦持續(xù)釋放中等數(shù)量的孢子（每只螯蝦約2 700 個(gè)孢子/周）；垂死的螯蝦在死亡前1 周釋放的孢子數(shù)量顯著增加，可能在虛弱個(gè)體中出現(xiàn)了螯蝦瘟病癥；水溫18 ℃時(shí)產(chǎn)生的孢子明顯比4 ℃多，但水溫從17 ℃上升到23 ℃時(shí)，水溫越高，釋放的孢子數(shù)量越少。綜上表明不同階段的隱性感染螯蝦都會(huì)對(duì)高度敏感的螯蝦物種構(gòu)成持續(xù)感染風(fēng)險(xiǎn)。Svoboda 等[16]研究表明，受感染的叉肢螯蝦在蛻皮期間，A.astaci孢子數(shù)量顯著增加。Makkonen 等[17]報(bào)告了PsI 菌株感染奧斯塔歐洲螯蝦后釋放A.astaci孢子的動(dòng)態(tài)過(guò)程：死亡前2 d 到死后12 h 的孢子數(shù)為500～2 000 個(gè)/L，死后24 h孢子數(shù)顯著增加至12 000 個(gè)/L，2 d 后達(dá)到峰值約65 000 個(gè)/L，死后第4 天開始下降，直到低于死亡前水平。該結(jié)果證實(shí)垂死和剛死亡的螯蝦可釋放出大量孢子，在死后1～3 d 內(nèi)逐漸達(dá)到峰值。螯蝦感染僅3 d 即出現(xiàn)急性死亡證實(shí)了PsI 基因型的致死潛力，而強(qiáng)大的孢子形成能力可能是PsI 基因型的關(guān)鍵毒力因素之一。

2 流行病學(xué)

2.1 地理分布

北美洲擁有全球最豐富的淡水螯蝦物種。螯蝦瘟被認(rèn)為起源于北美，這是因?yàn)楸泵酪酝獾膰?guó)家引進(jìn)北美螯蝦進(jìn)行養(yǎng)殖、游釣或水族館觀賞，導(dǎo)致螯蝦瘟傳播，使本土螯蝦種群數(shù)量減少。目前A.astaci主要分布在北美和歐洲。1859 年首次在意大利發(fā)現(xiàn)歐洲本土螯蝦——白圓鉗螯蝦大規(guī)模死亡，標(biāo)志著A.astaci開始在歐洲傳播。隨后，1874 年在法德邊境地區(qū)又暴發(fā)了幾次螯蝦瘟[18]。后來(lái)的幾十年，A.astaci病原體沿著多瑙河流域擴(kuò)散，目前已遍布?xì)W洲大部分地區(qū)。20 世紀(jì)60 年代西班牙首次暴發(fā)螯蝦瘟疫情，20 世紀(jì)80 年代該病進(jìn)一步擴(kuò)展到不列顛群島、土耳其、希臘和挪威[19]。

近年來(lái)歐洲不斷有暴發(fā)螯蝦瘟的報(bào)告。Martín-Torrijos 等[20]對(duì)西班牙2004 年以來(lái)發(fā)生的50 多起螯蝦瘟進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)A.astaci已經(jīng)活躍了45年，克氏原螯蝦和信號(hào)螯蝦已成為A.astaci的保蟲宿主；北部地區(qū)主要為b 基因型，南部、中部和東部地區(qū)主要為d1 和d2 基因型。Filipová 等[18]報(bào)告法國(guó)信號(hào)螯蝦種群中A.astaci平均感染率約為20%，因信號(hào)螯蝦與本土的白圓鉗螯蝦有著相似的棲息地，可對(duì)其構(gòu)成嚴(yán)重威脅。其他一些非本土螯蝦物種——叉肢螯蝦、O.immunis和克氏原螯蝦中也檢測(cè)到A.astaci。Tilmans 等[21]首次報(bào)告了荷蘭的螯蝦瘟發(fā)生情況，發(fā)現(xiàn)6 種外來(lái)甲殼動(dòng)物種群中，叉肢螯蝦和信號(hào)螯蝦為中等水平感染，中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）和Orconectes cf.virilis中也檢出陽(yáng)性，而克氏原螯蝦為零星感染，Procambarus cf.acutus中還未檢測(cè)到病原體，證明了單個(gè)區(qū)域內(nèi)潛在宿主之間A.astaci流行率存在顯著差異。Parvulescu 等[22]報(bào)告了羅馬尼亞多瑙河及其支流對(duì)本土格魯西東歐螯蝦和入侵的叉肢螯蝦分布的監(jiān)測(cè)結(jié)果：2009—2011 年叉肢螯蝦的相對(duì)密度隨著時(shí)間的推移穩(wěn)步增加，而本地格魯西東歐螯蝦的密度急劇下降，至少32%的入侵螯蝦和41%的本土螯蝦感染了A.astaci。Cammà 等[23]報(bào)告了意大利發(fā)現(xiàn)的第一起螯蝦瘟，從發(fā)病的白園鉗螯蝦中分離到A.astaci和A.repetans兩種病原。Caprioli 等[24]也報(bào)告了意大利白園鉗螯蝦種群中檢測(cè)到A.astaci感染。Svoboda 等[25]報(bào)告了格魯西東歐螯蝦種群感染A.astaci的情況：在20 世紀(jì)80年代，該種群因螯蝦瘟而急劇下降，盡管從那時(shí)起螯蝦瘟一直存在，但該地區(qū)的格魯西東歐螯蝦種群已經(jīng)有所恢復(fù)；34 只外觀健康的螯蝦中有5 只感染了A.astaci，表明歐洲本土螯蝦已經(jīng)可以與A.astaci共存。Mruga?a 等[26]最近在波斯尼亞和黑塞哥維那觀察到由A.astaci引起的螯蝦死亡，僅發(fā)生在歐洲螯蝦中，表明該病原對(duì)這個(gè)地區(qū)的本地物種構(gòu)成威脅。Kozubíková 等[27]調(diào)查了捷克的信號(hào)螯蝦和叉肢螯蝦的A.astaci感染率，發(fā)現(xiàn)信號(hào)螯蝦感染率很低，而叉肢螯蝦感染率很高，并且病原體流行與水體類型之間存在明顯的關(guān)系，流動(dòng)水體中的感染率通常超過(guò)50%，而孤立靜止的水體感染率通常較低。

在亞洲，Hsieh 等[28]首次報(bào)告了我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)養(yǎng)殖的紅螯螯蝦自然感染A.astaci。2013 年底，臺(tái)灣5 個(gè)螯蝦養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)未知疾病，累積死亡率為中至高。通過(guò)PCR 分析檢測(cè)到A.astaci，其與歐洲相關(guān)菌株序列相似性為99.8%～100%，原位雜交試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)病原體為A.astaci。日本1927 年從北美引進(jìn)克氏原螯蝦和信號(hào)螯蝦，導(dǎo)致本土的日本螯蝦（Cambaroides japonicus）種群數(shù)量下降。Martín-Torrijos 等[29]報(bào)告了日本首例本土的日本螯蝦暴發(fā)螯蝦瘟，通過(guò)組織學(xué)和分子生物學(xué)方法對(duì)病原進(jìn)行了研究，對(duì)線粒體核糖體rnnS和rnnL的分析表明，病原是來(lái)自克氏原螯蝦的一種新的A.astacid3 菌株。

目前尚無(wú)A.astaci在非洲、中美洲、南美洲等地區(qū)分布的記錄。澳大利亞和新西蘭尚未發(fā)現(xiàn)螯蝦瘟[29]。但A.astaci的實(shí)際分布可能比報(bào)告的廣泛得多。

2.2 易感宿主

所有種類和不同生命階段的螯蝦均對(duì)A.astaci易感，但感染率存在物種差異。北美螯蝦易感，但其具有較強(qiáng)的抵抗力，信號(hào)螯蝦、克氏原螯蝦等感染后通常不發(fā)病。歐洲螯蝦包括奧斯塔歐洲螯蝦、白園鉗螯蝦、石螯蝦、格魯西東歐螯蝦等都高度易感，可以導(dǎo)致其天然種群急劇下降，瀕臨滅絕[4]。

不同菌株對(duì)不同螯蝦的致病力可能有所不同，具有一定的宿主特異性。Jussila 等[30]對(duì)分離自健康石螯蝦的As 菌株與分離自?shī)W斯塔歐洲螯蝦、信號(hào)螯蝦和石螯蝦的PsI 菌株的毒性進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)PsI 菌株感染奧斯塔歐洲螯蝦和石螯蝦的死亡率均為100%，而信號(hào)螯蝦的死亡率僅為25%；As 菌株對(duì)奧斯塔歐洲螯蝦致病，但對(duì)信號(hào)螯蝦和石螯蝦不致病，表明對(duì)某種歐洲本土螯蝦呈隱形感染的A.astaci菌株可能對(duì)其他歐洲本土螯蝦有害。Kusar 等[31]報(bào)告斯洛文尼亞本土石螯蝦和非本土的信號(hào)螯蝦的感染率分別為55.6%和11.4%，而且受感染的石螯蝦種群與非本土螯蝦攜帶者并沒(méi)有接觸，卻連續(xù)兩年持續(xù)感染A.astaci。

Martín-Torrijos 等[4]用北美克氏原螯蝦中分離的AP03 基因型A.astaci菌株對(duì)歐洲本地螯蝦白圓鉗螯蝦進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)盡管大多數(shù)螯蝦表現(xiàn)出高死亡率，但種群之間存在顯著差異，其中部分種群對(duì)螯蝦瘟表現(xiàn)出高抗性，在4 個(gè)月的監(jiān)測(cè)期內(nèi)表現(xiàn)出100%的存活率；組織學(xué)分析顯示，組織中存在高度免疫反應(yīng)，即菌絲 的包裹和黑化，類似于在北美抗性螯蝦物種中發(fā)現(xiàn)的反應(yīng)。

除了螯蝦以外，中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）也被證明對(duì)A.astaci易感。Svoboda 等[32]報(bào)告了兩種淡水蝦——黃金米蝦（Neocaridina davidi）和戴氏沼蝦（Macrobrachium dayanum）人工感染A.astaci試驗(yàn)的結(jié)果：感染后兩種蝦均未出現(xiàn)死亡，在黃金米蝦組織中未發(fā)現(xiàn)A.astaci數(shù)量增加，但在戴氏沼蝦的組織中發(fā)現(xiàn)A.astaci數(shù)量的增長(zhǎng)，表明A.astaci可能在該物種的組織中生長(zhǎng)。

2.3 傳播方式和途徑

A.astaci主要通過(guò)受感染的螯蝦或受污染的水以及漁網(wǎng)、漁具、靴子等受污染設(shè)備的轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)行傳播。受感染螯蝦釋放出游動(dòng)孢子，游動(dòng)孢子在水中游動(dòng)，對(duì)螯蝦具有明顯的趨化性，再附著未感染螯蝦。人為活動(dòng)造成棲息地改變打破了自然傳播的屏障，使攜帶病原體的入侵物種進(jìn)一步擴(kuò)大范圍；氣候變化改變了環(huán)境條件，進(jìn)一步使一些入侵物種受益，并有利于疾病的發(fā)展和傳播。歐洲20 世紀(jì)主要通過(guò)引進(jìn)的北美螯蝦野外放養(yǎng)或從養(yǎng)殖場(chǎng)逃脫而傳播A.astaci，現(xiàn)在主要通過(guò)北美螯蝦種群的擴(kuò)散以及私人將北美螯蝦放歸野外等途徑傳播。

有關(guān)A.astaci在不同種類螯蝦之間的傳播研究較少。James 等[33]在英國(guó)一條河流的孤立水域和開放水域中監(jiān)測(cè)信號(hào)螯蝦和強(qiáng)健螯蝦（Orconectes virilis）中的A.astaci，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)水域的信號(hào)螯蝦都檢測(cè)到A.astaci，但強(qiáng)健螯蝦僅在開放水域發(fā)現(xiàn)感染A.astaci，而且強(qiáng)健螯蝦感染的A.astaci基因型與信號(hào)螯蝦的菌株相關(guān)，可能來(lái)自受感染的信號(hào)螯蝦。Svoboda 等[34]研究表明，叉肢螯蝦可以在蛻皮期間將A.astaci傳播給易感的奧斯塔歐洲螯蝦，奧斯塔歐洲螯蝦感染率明顯高于美洲螯蝦。

A.astaci還可以通過(guò)魚類的消化系統(tǒng)傳播，但通過(guò)哺乳動(dòng)物和鳥類消化道傳播的可能性很小。Svoboda 等[35]在歐洲水獺和美洲水貂的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)食肉溫血?jiǎng)游锏南纻鞑.astaci可能性很小，A.astaci對(duì)哺乳類的體溫敏感，但不同菌株對(duì)高溫的抗性存在差異，其中E、D 群比A、B群菌株更敏感。

2.4 發(fā)病率和死亡率

原產(chǎn)于北美大陸的螯蝦對(duì)A.astaci具有較強(qiáng)的抗性，可隱性感染而不發(fā)病，成為病原體的終身攜帶者。不同地區(qū)的北美螯蝦A.astaci感染率相差很大，感染率介于0～100%。芬蘭的最新報(bào)告表明，冷水環(huán)境下A.astaci可在奧斯塔歐洲螯蝦種群中以低感染率長(zhǎng)期流行。不過(guò)，Thomas 等[36]發(fā)現(xiàn)：北美螯蝦也會(huì)死于螯蝦瘟，孵化4 周后的幼年信號(hào)螯蝦感染后死亡率很高，高水平感染的成年信號(hào)螯蝦也表現(xiàn)出行為異常，如很少離開水、逃避反應(yīng)遲緩等。

歐洲螯蝦暴露于A.astaci的孢子中通常會(huì)導(dǎo)致感染并最終死亡，早期感染率可能較低，但可能導(dǎo)致相鄰種群100%死亡。其傳播速度與寄主種類、年齡、種群密度以及水溫等因素相關(guān)，傳播時(shí)間變化很大，可能從幾周到幾個(gè)月不等。珍稀的奧斯塔歐洲螯蝦種群被A.astaci感染數(shù)月后，不會(huì)出現(xiàn)明顯死亡，病原可在宿主種群中持續(xù)傳播幾年時(shí)間。

2.5 臨床癥狀

A.astaci最初感染外骨骼角質(zhì)層，隨后感染腹部和關(guān)節(jié)周圍的軟質(zhì)角質(zhì)層。高度敏感的歐洲螯蝦所有組織都可能被感染，而北美螯蝦感染通常局限于角質(zhì)層。

臨床癥狀與感染強(qiáng)度、水溫以及宿主種類等有關(guān)，差別很大。通常暴發(fā)的最初表現(xiàn)是，螯蝦出現(xiàn)大量死亡，或協(xié)調(diào)性不佳、身體不能翻轉(zhuǎn)等。感染性病灶可能肉眼可見，也可能無(wú)法辨別，常見表皮下肌肉局部變白或呈棕色。有時(shí)在受感染表皮中可以看到菌絲，菌絲會(huì)在表皮上形成細(xì)小的棕色痕跡。最典型的癥狀是，受感染或死亡個(gè)體的腹部和尾部胸腹側(cè)柔軟的角質(zhì)層、肛周區(qū)域的角質(zhì)層、甲殼和腹部之間的角質(zhì)層、步行足關(guān)節(jié)等部位出現(xiàn)黑色素斑點(diǎn)。這種黑色素斑點(diǎn)是宿主免疫反應(yīng)的結(jié)果。對(duì)A.astaci具有抗性的螯蝦通過(guò)與A.astaci細(xì)胞壁相互作用，觸發(fā)其免疫系統(tǒng)而產(chǎn)生廣泛反應(yīng)，激活酚氧化酶原系統(tǒng)產(chǎn)生細(xì)胞毒性化合物和黑色素，以確保病原體包裹在角質(zhì)層中，防止其完全定殖于血腔。而一些對(duì)A.astaci敏感的螯蝦因無(wú)法阻止其血腔中的菌絲生長(zhǎng)而發(fā)病死亡[4，37]。對(duì)于隱性感染的北美螯蝦，角質(zhì)層黑色化可能還有其他原因。

3 診斷技術(shù)

螯蝦瘟臨床癥狀的診斷價(jià)值十分有限，很多隱性感染的螯蝦不表現(xiàn)任何臨床癥狀。Alderman等[38]報(bào)告了A.astaci的IM 瓊脂培養(yǎng)方法，并描述了菌落、營(yíng)養(yǎng)菌絲、孢子囊、初級(jí)孢子、游動(dòng)孢子等各個(gè)發(fā)育階段的形態(tài)結(jié)構(gòu)。Viljamaa-Dirks 等[39]對(duì)A.astaci的分離方法進(jìn)行了改進(jìn)。但這種分離方法可能要求較高，不僅要求送達(dá)實(shí)驗(yàn)室的被檢樣本處于良好狀態(tài)，而且要求檢驗(yàn)員具有一定的真菌分離經(jīng)驗(yàn)。目前監(jiān)測(cè)螯蝦瘟最合適的方法是PCR 方法。使用普通PCR 或?qū)崟r(shí)熒光PCR 擴(kuò)增出預(yù)期的PCR 產(chǎn)物即可確診，通過(guò)基因測(cè)序可以進(jìn)一步確認(rèn)基因型。

3.1 普通PCR 方法

已有幾種具有不同靈敏度和特異性的PCR 檢測(cè)方法。這些方法的敏感性可能與樣品質(zhì)量有關(guān)，對(duì)具有明顯臨床癥狀、瀕死或剛死的螯蝦樣品檢測(cè)敏感性較高。多數(shù)PCR 方法具有良好的特異性，但對(duì)于新發(fā)現(xiàn)的菌株，應(yīng)通過(guò)測(cè)序進(jìn)一步確認(rèn)。

Oidtmann 等[40]報(bào)告了 基 于A.astaci5.8S rDNA 基因ITS序列的PCR 方法。對(duì)27 個(gè)A.astaci菌株、20 個(gè)卵菌綱非A.astaci菌株以及5種真菌的測(cè)試證明，該引物具有良好的特異性。奧斯塔歐洲螯蝦感染A.astaci后，2 d 即可檢測(cè)出陽(yáng)性。Tuffs 等[41]比較了3 種檢測(cè)A.astaci的PCR方法的靈敏度和特異性，發(fā)現(xiàn)所有方法都具有良好的靈敏度和特異性，檢測(cè)限約為10 個(gè)游動(dòng)孢子。Casabella-Herrero 等[42]驗(yàn)證了兩種基于A.astaci線粒體核糖體rnnS和rnnL亞基的PCR 方法，并對(duì)包括其他卵菌屬物種和芬尼克絲囊霉在內(nèi)的76 個(gè)分離株進(jìn)行了特異性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)依據(jù)rnnS區(qū)域的序列分析足以鑒定A.astaci，但僅僅依據(jù)rnnL序列可能難以準(zhǔn)確區(qū)分A.astaci和其他卵菌科的物種。Makkonen 等[5]開發(fā)了兩組引物來(lái)擴(kuò)增核糖體rnnS和rnnL亞基的mtDNA，以研究A.astaci的多樣性。該方法可以直接從受感染的螯蝦組織中檢測(cè)和鑒定A.astaci基因型，在27 個(gè)A.astaci菌株中確認(rèn)了4 個(gè)群（A、B、D、E）和5 個(gè)基因型（a、b、d1、d2、e）。

3.2 實(shí)時(shí)PCR 技術(shù)

3.3 菌株基因型分型技術(shù)

確定菌株基因型是對(duì)螯蝦瘟進(jìn)行分子流行病學(xué)研究的重要工具。Viljamaa-Dirks 等[47]應(yīng)用RAPD-PCR 技術(shù)，對(duì)芬蘭的奧斯塔歐洲螯蝦分離的A.astaci進(jìn)行基因分型，發(fā)現(xiàn)43 株屬于As 基因型，26 株屬于Ps1 基因型；大多數(shù)Ps1 菌株（83%）與螯蝦瘟急性死亡有關(guān)，只有33%的As菌株與疫病暴發(fā)相關(guān)；As 菌株比Ps1 菌株更常見，在一些水體中可連續(xù)幾年分離到As 菌株。

通常RAPD-PCR 技術(shù)需要對(duì)菌株進(jìn)行純培養(yǎng)。Minardi 等[48]通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增不同基因型獨(dú)有的基因組序列，可以直接對(duì)臨床螯蝦樣本中的A.astaci菌株進(jìn)行基因分型。采用該方法對(duì)各種臨床樣本以及培養(yǎng)物進(jìn)行鑒定，成功區(qū)分了A、B、D 和 E群，C群還需要對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序來(lái)確認(rèn)。Caprioli 等[49]使用微衛(wèi)星標(biāo)記法，對(duì)2009—2016年引起意大利7 起螯蝦瘟的菌株進(jìn)行基因分型，確定有A、B、D 共3 個(gè)群，表明即使在相對(duì)較小的區(qū)域內(nèi)也可能存在多種基因型。A 群不僅在發(fā)生螯蝦瘟?xí)r被檢測(cè)到，而且在進(jìn)口供人類食用的外觀健康的格魯西東歐螯蝦中也呈陽(yáng)性。Grandjean等[50]應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)，對(duì)宿主組織樣本中的A.astaci進(jìn)行基因分型，證明不同的北美螯蝦宿主攜帶多種基因型，包括最初在19 世紀(jì)引入歐洲導(dǎo)致螯蝦瘟的基因型。該技術(shù)可以直接對(duì)純培養(yǎng)樣品和混合基因組樣本中的病原體進(jìn)行基因分型。James 等[45]使用微衛(wèi)星病原體基因分型技術(shù)，證實(shí)至少一個(gè)英國(guó)信號(hào)螯蝦種群感染了已知具有毒性的B 群A.astaci。

Minardi 等[51]結(jié)合生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)開發(fā)了針對(duì)線粒體DNA 的A.astaci基因分型分子標(biāo)記，提高了基因分型的靈敏度；利用這些技術(shù)對(duì)不同臨床樣品進(jìn)行驗(yàn)證，證明在英國(guó)水域存在A 群和B 群A.astaci。

3.4 環(huán)境DNA 監(jiān)測(cè)技術(shù)

環(huán)境DNA（environmental DNA，eDNA）技術(shù)是一種直接從水、土壤、空氣或生物體殘留物等環(huán)境樣本中提取DNA 進(jìn)行物種調(diào)查的方法，是一種非致死性、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的物種監(jiān)測(cè)技術(shù)。通過(guò)分析水樣中的eDNA，可以確定水生環(huán)境中是否存在入侵的、瀕危或商業(yè)上重要的物種或病原，盡早發(fā)現(xiàn)外來(lái)物種或有害生物入侵，保護(hù)本土物種和生態(tài)。

物種特異性eDNA 引物首先被用來(lái)檢測(cè)和區(qū)分物種。eDNA 已經(jīng)成功證明入侵螯蝦存在于日本安康湖附近的幾乎所有小溪中，表明eDNA 分析是一種有效的、高度敏感的評(píng)估水生生物分布方法[29]。Troth 等[52]基于eDNA 分析的調(diào)查方法來(lái)評(píng)估白圓鉗螯蝦、螯蝦瘟病原和信號(hào)螯蝦之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)該方法比傳統(tǒng)方法具有更高的特異性和靈敏度。不過(guò)，基于eDNA 對(duì)物種生物量進(jìn)行定量分析的方法還不太可靠。Robinson 等[53]報(bào)告了同時(shí)檢測(cè)信號(hào)螯蝦、白圓鉗螯蝦和螯蝦瘟病原eDNA 的實(shí)時(shí)PCR 方法，對(duì)來(lái)自威爾士和英格蘭水樣和現(xiàn)場(chǎng)樣品的eDNA 進(jìn)行直接檢測(cè)，顯示信號(hào)螯蝦、本地白圓鉗螯蝦以及螯蝦瘟病原均為陽(yáng)性。

雖然eDNA 方法簡(jiǎn)便易行，但需要從大量的水中進(jìn)行分離濃縮，而且DNA 很容易降解而影響檢測(cè)結(jié)果。Pavi? 等[1]采用微生物生物膜方法提取螯蝦表皮中的DNA，可以檢測(cè)螯蝦中的A.astaci，無(wú)需進(jìn)行致死性取樣，可以替代基于eDNA 的監(jiān)測(cè)方法；用PCR 和qPCR 對(duì)該方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與傳統(tǒng)的致死取樣方法一致。

Agersnap 等[54]報(bào)告了天然水體中監(jiān)測(cè)奧斯塔歐洲螯蝦、信號(hào)螯蝦和格魯西東歐螯蝦的方法，建立了基于線粒體細(xì)胞色素氧化酶1 的3 種螯蝦特異性檢測(cè)和定量PCR 分析，包括對(duì)2 個(gè)格魯西東歐螯蝦進(jìn)化支的單獨(dú)分析。通過(guò)兩種方法檢測(cè)，確定檢測(cè)限均為5 拷貝，定量限分別為 5 和10 拷貝，并在已知的天然淡水生態(tài)系統(tǒng)中檢測(cè)到所有3 個(gè)物種的螯蝦種群。

4 小結(jié)

螯蝦瘟已經(jīng)對(duì)部分歐洲和亞洲國(guó)家的本土螯蝦和養(yǎng)殖螯蝦種群帶來(lái)巨大威脅。雖然有關(guān)螯蝦瘟的病原研究國(guó)外較多，但變形藻絲囊霉菌株和基因型較多，因而給病原檢測(cè)和鑒定帶來(lái)一定困難。目前尚無(wú)有效的治療藥物和方法可以控制該病對(duì)受感染養(yǎng)殖場(chǎng)的影響。但限制疫區(qū)內(nèi)的螯蝦轉(zhuǎn)運(yùn)可以在一定程度上控制該病的傳播。養(yǎng)殖場(chǎng)必須采取嚴(yán)格的生物安全措施，減少病原通過(guò)設(shè)備、車輛或人員傳播。另外，要規(guī)范野外放生行為，禁止在有易感種群的野外放生各種螯蝦。

我國(guó)除臺(tái)灣以外，尚無(wú)針對(duì)螯蝦瘟的研究報(bào)告。我國(guó)大陸地區(qū)養(yǎng)殖小龍蝦規(guī)模大、分布廣，雖然至今尚無(wú)螯蝦瘟發(fā)生的報(bào)告，但正不斷從境外引進(jìn)螯蝦進(jìn)行種質(zhì)資源改良或觀賞。由于所有螯蝦都對(duì)螯蝦瘟易感，因此存在螯蝦瘟通過(guò)直接或間接的蝦苗貿(mào)易從疫區(qū)傳入大陸地區(qū)的巨大風(fēng)險(xiǎn)；加之，我國(guó)大陸地區(qū)養(yǎng)殖螯蝦疫情十分復(fù)雜，而基層又缺乏有效的病原診斷技術(shù)，使得很多傳染病病原需要深入研究。為有效監(jiān)控螯蝦瘟在我國(guó)的傳播，有關(guān)部門需在小龍蝦養(yǎng)殖區(qū)開展流行病學(xué)調(diào)查，并實(shí)施螯蝦瘟監(jiān)測(cè)計(jì)劃，同時(shí)需加強(qiáng)對(duì)進(jìn)境螯蝦及其產(chǎn)品的嚴(yán)格檢疫。