呂夢娜，韋柳明，單 芬，彭仕明，陳 武，翟俊瓊

（1.廣州動物園，廣州市野生動物研究中心，廣東廣州 510070；2.華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院，廣東廣州 510642）

貓細小病毒（feline parvovirus，F(xiàn)PV）又名貓泛白細胞減少癥病毒（feline panleukopenia virus），是造成動物患上貓泛白細胞減少癥（feline panleukopenia，F(xiàn)PL）的病原[1]。FPL 是一種高度傳染性和致死性疾病，其臨床特征是急性腸炎，出現(xiàn)嚴重脫水和敗血癥，以淋巴衰竭和全血細胞減少為顯著特征[2-3]。FPV 已經被歐美地區(qū)多個國家定義為嚴重的貓傳染病之一。1957 年Bilin 首次分離培養(yǎng)出該病毒，1964 年Johnson 從豹的脾臟中也分離出FPV[4]。

FPV 是無囊膜的單股DNA 病毒，其病毒粒子直徑為20～24 nm，呈二十面體對稱結構。

FPV 的衣殼蛋白由VP1、VP2、VP3 組成，其中VP2 占90%，為最主要的結構蛋白，決定宿主范圍和病毒與宿主的相互作用[5]。FPV 基因組全長4～6 kb，相對分子質量為（1.5～2.0）×106。FPV 在自然界中分布極為廣泛，對外界因素抵抗力強[6]，60 ℃加熱30 min 不能使其完全滅活；對乙醚、氯仿和丙酮等脂溶性溶劑和酸、堿、酚（0.5%）及胰蛋白酶都有抵抗力，0.2%～0.5%甲醛溶液處理20～24 h 能夠使其滅活，0.5%福爾馬林和0.175%次氯酸鈉能有效將其殺滅[7-8]。

研究表明，F(xiàn)PV 在自然條件下可感染虎、豹、獅等大型貓科動物[3，9-12]，而小型貓科動物和水貂最易感[13]。國外研究者還曾對俄羅斯遠東地區(qū)的野生東北虎進行FPV 抗體檢測，發(fā)現(xiàn)抗體陽性率很高[14]。在我國，F(xiàn)PV 全年流行，尤其是冬季及初春季節(jié)。目前，國內對獅源FPV 的研究較少。為此，本研究通過細胞培養(yǎng)從非洲獅糞便中分離得到1 株FPV，并對其VP2基因進行擴增和序列分析，以了解FPV 的遺傳進化情況，對該病的診斷和治療提供依據，也為后期相關疫苗的研制打下基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞、病料及主要試劑

本研究所用的貓腎細胞F81，由華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院微生物教研室饋贈，由本實驗室培養(yǎng)和凍存；病料，由廣東省某動物園提供，且經膠體金試紙條檢測為細小病毒陽性；病毒總RNA/DNA 提取試劑盒，購自AXYGEN；膠回收試劑盒，購自OMEGA；pMDTM19-T 載體、反轉錄試劑盒、ExTaq酶、DH5α 感受態(tài)細胞，均購自TAKARA；胎牛血清、DMEM 培養(yǎng)基、PBS 緩沖液和0.25%胰蛋白酶，購自Gibco。

1.2 引物設計

登錄NCBI 查找細小病毒序列，用Primer premier 5.0 設計并合成2 對特異性引物。其中：1對為鑒定細小病毒引物，目的條帶大小約為600 bp（F1：5'-AAAGAGTAGTTGTAAATAATT-3'；R1：5'-CCTATATAACCAAAGTTAGTAG-3'）；1 對為擴增細小病毒VP2基因引物，目的條帶大小約為1 800 bp（F2：5'-ATGAGTGATGGAGCAGTTCA-3'；R2：5'-GGAATATAATTTTCTAGGTGCTAGT-3'）。2 對引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.3 病料收集與處理

采集廣東省某動物園疑似感染FPV 的非洲獅糞便，用適量已滅菌的PBS 稀釋成懸液并加入青、鏈霉素，渦旋振蕩后12 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液經0.22 μm 過濾除菌后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 病毒分離培養(yǎng)與鑒定

常規(guī)方法培養(yǎng)F81 細胞，待細胞長滿單層后，棄培養(yǎng)基，用PBS 小心清洗后，加入0.25%的EDTA 胰蛋白酶進行消化，待細胞逐漸脫落時，加入含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基終止消化并吹打均勻。細胞傳代的同時，在培養(yǎng)液中按體積比1/10 的量接種處理好的病毒濾液，同時設立不接毒的對照組，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長至80%左右，若還未產生細胞病變（CPE）則將培養(yǎng)液更換為含2%胎牛血清、1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)觀察3～4 d，每天觀察有無產生CPE；若無CPE，盲傳4～5 代，仍無棄之。若出現(xiàn)CPE ≥80%，則反復凍融3 次收毒，提取細胞培養(yǎng)物DNA，使用鑒定引物按照25.0 μL反應體系（Primemix ExTaq酶12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL）進行PCR 擴增（95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共30 個循環(huán)；最后72 ℃終延伸10 min），產物經1.0%瓊脂糖凝電泳觀察結果。若條帶大小相符，送至北京擎科生物科技有限公司測序。

1.5 VP2 基因擴增、測序及序列分析

以1.4 中提取的DNA 為模板進行PCR 反應，擴增VP2基因序列（反應體系、程序以及操作同1.4）；電泳后切膠回收目的條帶大小的產物，將其連接到pMDTM19-T 載體，轉化至DH5α 感受態(tài)細胞后，涂布于含Amp+的LB 平板；待平板上形成肉眼可見的單個菌落后，挑取單個菌落搖菌提取質粒，將鑒定為陽性的質粒送至北京擎科生物科技有限公司測序。將測序結果與NCBI 上的26 個序列（表1）進行比較，用軟件MEGA 6.06 分析本研究得到的VP2基因與參考毒株的遺傳進化規(guī)律，用MegAlign 分析核苷酸序列同源性。

表1 參考毒株信息

2 結果

2.1 病毒分離與鑒定

病毒濾液接種F81 細胞，盲傳至第3 代，48 h后細胞發(fā)生典型病變，表現(xiàn)為細胞拉絲現(xiàn)象，隨后，細胞間隙慢慢變大，逐漸脫落（圖1）。經細小病毒特異性引物PCR 擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在600 bp左右處出現(xiàn)特異性條帶且對照組為陰性，與預期目的條帶片段大小一致（圖2），測序結果經比對確定為FPV，并將該毒株命名為FPV CHNHN-1。

圖1 細胞接毒培養(yǎng)結果

圖2 病毒培養(yǎng)液PCR 鑒定結果

2.2 VP2 基因序列擴增與測序

經細小病毒VP2特異性引物擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)在1 800 bp 左右處出現(xiàn)特異性條帶，與預期目的條帶大小一致（圖3），經連接、轉化后，提取質粒、測序、拼接得到FPV CHNHN-1 毒株的VP2基因序列。

圖3 VP2 基因擴增結果

經序列分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)PV CHN-HN-1 毒株VP2蛋白的6 個決定宿主差異的氨基酸位點80、93、103、323、564 和568 位均未發(fā)生改變（圖4），而當80、564 和568 位分別為賴氨酸、天冬酞胺和丙氨酸時，細小病毒只能在貓科動物體內增殖。

圖4 VP2 基因測序峰圖

2.3 VP2 基因序列分析

將FPV CHN-HN-1 的VP2基因序列與GeneBank 上公布的26 株參考株VP2基因序列進行同源性比對。由圖5 可知，分離株FPV CHNHN-1 與GeneBank 上公布的其他26 株毒株同源性在97.8%～100%，其中與JN-FPV-96（MZ836373.1）、TZ-FPV-112（MZ836368.1）、FPV-SH2003（MW811187.1）、BJ051（MT270580.1）相似性最高，均為100%；而與98-10SA2010（HQ602986.1）、118/2010（KF373598.1）相似性最低，均為97.8%。

圖5 VP2 基因核苷酸同源性分析結果

2.4 VP2 基因遺傳進化樹分析

使用MEGA6.06 軟件將FPV CHN-HN-1 毒株與國內外26 株細小病毒VP2基因核酸序列進行比對，構建遺傳進化樹。結果（圖6）顯示，F(xiàn)PV CHN-HN-1 株與其他7 株FPV 同屬一個大的分支，與JN-FPV-96、TZ-FPV-112、FPV-SH2003、BJ051遺傳距離最近，與其他犬源和狐源的細小病毒參考毒株遺傳距離較遠。

圖6 基于VP2 基因的遺傳進化樹

3 討論

FPV 是一種單鏈DNA 病毒，在家養(yǎng)動物和野生動物中均有流行，動物感染后出現(xiàn)高熱、急性腸炎、嘔吐、白細胞減少和心肌炎等癥狀，對犬、貓、鼬等家養(yǎng)、圈養(yǎng)、經濟動物及野生貓科動物的危害十分嚴重。江蘇、安徽、湖北等10 余個省市都曾發(fā)生過FPV 感染事件[15-16]。近年來，由于家養(yǎng)犬、貓等動物疫苗的使用，細小病毒病得到很好地控制，但在野生動物中還時有發(fā)生[17-18]。曾有學者用血凝抑制試驗（HI）對我國某野生動物園圈養(yǎng)虎進行FPV 血清學調查，發(fā)現(xiàn)抗體陽性率接近50%[8]；2017 年李同義等[19]報道某動物園東北虎和非洲獅感染細小病毒?？梢?，大型貓科動物如虎、獅感染該病毒也十分普遍。到目前為止，國內雖然有關于虎細小病毒序列的分析報道，但暫未有獅源細小病毒序列的相關分析報道，因此應加強大型貓科動物FPV 監(jiān)測，以減少該病的發(fā)生與流行。

VP2 蛋白是FPV 主要的抗原蛋白，其非常保守，與病毒的血凝特性、致病性密切相關。本研究成功從疑似感染FPV 的非洲獅糞便中分離出FPV CHN-HN-1 毒株。對該分離株的VP2基因進行PCR 擴增測序，并分析其遺傳變異情況，結果發(fā)現(xiàn)分離株與26 株參考株的序列相似性為97.8%～100%，與JN-FPV-96、TZ-FPV-112、FPVSH2003、BJ051 高度同源，相似性均為100%，同時決定分離株VP2 蛋白的6 個關鍵氨基酸位點均未發(fā)生突變，這符合FPV 的序列特征。遺傳進化分析顯示，F(xiàn)PV CHN-HN-1 與其他7 株貓源細小病毒同屬一個分支，表明本株獅源FPV 與貓源FPV病毒親緣關系較近，與犬源和狐源的細小病毒株親緣關系較遠，遺傳進化分析進一步證明分離株FPV CHN-HN-1 起源于FPV。

動物園作為大型圈養(yǎng)貓科動物的主要活動場所，除了在動物早期進行免疫預防接種，加強環(huán)境消毒外，還應做好FPV 分子流行病學和遺傳變異機制研究，以便對該病的診斷和治療提供依據，也為后期相關疫苗的研制打下基礎，同時對野生動物保護也具有重要意義。