李金濤 李時(shí)軍 宋章興 向 奎 趙 華 崔應(yīng)東 田朝暉

1.湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，湖北恩施 445000；2.湖北省恩施土家苗族自治州民族醫(yī)院泌尿外科、男科，湖北恩施 445000；3.湖北省恩施土家苗族自治州民族醫(yī)院醫(yī)務(wù)部，湖北恩施 445000

男性不育是一個(gè)嚴(yán)重的全球性醫(yī)學(xué)和社會(huì)問題，據(jù)研究表明大約有15%的夫婦受到不育癥的影響，其中40%～50%的病例歸因于男性不育癥[1]。約有45%的男性不育原因不明，影響因素包括精索靜脈曲張、睪丸衰竭、內(nèi)分泌功能障礙、生殖道感染、肥胖、高齡、遺傳因素等[2]。腺嘌呤是一類腫瘤化療藥物，但由于其可抑制生精細(xì)胞的產(chǎn)生從而被應(yīng)用于建立動(dòng)物不育模型[3]。本研究應(yīng)用不同劑量的富硒當(dāng)歸淫羊藿方對(duì)腺嘌呤造模后的大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察藥物對(duì)模型大鼠睪丸超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）及血清卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、睪酮（testosterone，T）的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取6 周齡雄性SPF 級(jí)SD 大鼠58 只，體重150～180 g，由三峽實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（合格證號(hào)：SCXK 鄂2017-0012）。按照中華動(dòng)物倫理學(xué)要求飼養(yǎng)和處理動(dòng)物，造模前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，普通飼料，定時(shí)喂食，自由飲水，12 h 光照/d，室溫保持在20～26℃，飼養(yǎng)于恩施州中心醫(yī)院湖北硒與人體健康研究院。

1.2 藥物與試劑

富硒當(dāng)歸淫羊藿方中當(dāng)歸30 g（恩施富硒藥材）、淫羊藿20 g（恩施富硒藥材）、黃芪15 g（恩施富硒藥材）、丹參30 g、菟絲子20 g、小茴香15 g，由恩施州民族醫(yī)院藥劑科提供，常規(guī)方法煎煮，濃縮至生藥量1.66 g/mL，經(jīng)測(cè)得藥物含硒量為50 μg/mL，4℃冰箱保存。腺嘌呤（批號(hào)：S09S10D97125），購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；SOD 試劑盒（批號(hào)：20191210）、MDA 試劑盒（批號(hào)：20191209）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；LH 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：SE0RD094566）、FSH檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：SE0RD095822）、T 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：SE0RD098100）均購(gòu)自武漢云克隆科技股份有限公司。

1.3 儀器

NanoDrop2000 超微量分光光度計(jì)（Thermo 公司）；D3024R 臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)（DragonLab 公司）；AD18 高速分散勻漿機(jī)（上海昂尼有限公司）；KD-2258石蠟切片機(jī)、KD-P 攤片機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）；Pannoramic SCAN 數(shù)字全掃儀器（3DHISTECH 公司）。

1.4 方法

1.4.1 建立模型 隨機(jī)選取10 只雄性SD 大鼠作為正常組，余下大鼠參照隨機(jī)數(shù)字表法分為四組：模型對(duì)照組，富硒當(dāng)歸淫藿方高、中、低劑量組，各12 只。正常組大鼠灌胃0.9%氯化鈉溶液，灌胃量為10 mL/（kg·d），模型對(duì)照組和富硒當(dāng)歸淫羊藿方高、中、低劑量組灌胃500 mg/（kg·d）腺嘌呤混懸液，灌胃量為10 mL/（kg·d）。灌胃共15 d，造模結(jié)束。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)藥物干預(yù) 富硒當(dāng)歸淫羊藿方高、中、低劑量組大鼠依據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)》[4]確定給藥劑量，高劑量組每只大鼠灌服富硒當(dāng)歸淫羊藿方20.92 g/（kg·d），中劑量組每只大鼠灌服富硒當(dāng)歸淫羊藿方10.46 g/（kg·d），低劑量組每只大鼠灌服富硒當(dāng)歸淫羊藿方5.23 g/（kg·d），連續(xù)灌胃30 d。

1.4.3 取材 實(shí)驗(yàn)第46 天，稱重各組大鼠，用4%水合氯醛麻醉大鼠，心臟取血8～10 mL 于玻璃試管中，靜止3 h，離心4 min（4000 r/min，13.5 cm），吸取血清放置于-80℃低溫冰箱保存；分離睪丸組織，右側(cè)睪丸置于福爾馬林液中固定，用于制備睪丸病理切片，左側(cè)睪丸制備成組織勻漿，用于測(cè)定SOD 和MDA 的含量。

1.4.4 檢測(cè)項(xiàng)目 觀察各組大鼠體重、飲食、尿量等一般狀況；WST-1 法檢測(cè)睪丸組織勻漿SOD；酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)MDA 含量；酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清性激素FSH、LH、T 含量；比較各組大鼠睪丸病理切片結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)觀察

實(shí)驗(yàn)開始前各組一般狀態(tài)良好，飲食、尿量均正常，毛色光鮮亮麗。造模第4 天開始，模型對(duì)照組和富硒當(dāng)歸淫羊藿方各劑量組逐漸出現(xiàn)飲食量減少，尿量逐漸增加（需每日更換墊料），飲水量多，體重下降，弓背，毛發(fā)失去光澤，甚至逐漸出現(xiàn)死亡。造模結(jié)束后，模型對(duì)照組，富硒當(dāng)歸淫羊藿方高、中、低劑量組各死亡1 只。死亡大鼠經(jīng)解剖后，肺部未發(fā)現(xiàn)藥液殘留及出血點(diǎn)，排除灌胃致死的原因，腎臟出現(xiàn)腫大與出血點(diǎn)，提示因?yàn)槟I衰竭等原因致死。開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)藥物干預(yù)后，富硒當(dāng)歸淫羊藿方各劑量組逐漸出現(xiàn)飲食量增加，體重增加，尿量逐漸恢復(fù)如常，毛發(fā)也逐漸恢復(fù)光澤。灌胃腺嘌呤大鼠出現(xiàn)豎毛、瞇眼、弓背等臨床表現(xiàn)，見圖1。

圖1 灌胃腺嘌呤大鼠的臨床表現(xiàn)

2.2 富硒當(dāng)歸淫羊藿方對(duì)大鼠睪丸組織勻漿SOD、MDA 的影響

與正常組比較，模型對(duì)照組睪丸組織勻漿SOD 下降，MDA 上升，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，富硒當(dāng)歸淫羊藿方高、中劑量組SOD 均不同程度升高，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.01），但富硒當(dāng)歸淫羊藿方低劑量組與模型對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；與模型對(duì)照組比較，富硒當(dāng)歸淫羊藿方高、中、低劑量組MDA 均不同程度降低，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.01）。見表1。

表1 富硒當(dāng)歸淫羊藿方對(duì)大鼠睪丸組織勻漿SOD、MDA 的影響（）

表1 富硒當(dāng)歸淫羊藿方對(duì)大鼠睪丸組織勻漿SOD、MDA 的影響（）

注：與正常組比較，##P ＜0.01；與模型對(duì)照組比較，**P ＜0.01。SOD：超氧化物歧化酶；MDA：丙二醛

2.3 富硒當(dāng)歸淫羊藿方對(duì)大鼠血清FSH、LH、T 的影響

2.3.1 血清FSH 與正常組比較，模型對(duì)照組血清FSH上升，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；富硒當(dāng)歸淫羊藿方低劑量組血清FSH 與模型對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；與模型對(duì)照組比較，富硒當(dāng)歸淫羊藿方高、中劑量組血清FSH 下降，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.01）。見表2。

2.3.2 血清LH 與正常組比較，模型對(duì)照組血清LH上升，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；富硒當(dāng)歸淫羊藿方低劑量組血清LH 與模型對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；與模型對(duì)照組比較，富硒當(dāng)歸淫羊藿方高、中劑量組血清LH 下降，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.01）。見表2。

2.3.3 血清T 與正常組比較，模型對(duì)照組血清T 下降，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）；富硒當(dāng)歸淫羊藿方低劑量組血清T 與模型對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05）；與模型對(duì)照組比較，富硒當(dāng)歸淫羊藿方高、中劑量組血清T 升高，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P ＜0.01）。見表2。

2.4 睪丸組織病理學(xué)結(jié)果

正常組睪丸結(jié)構(gòu)正常，生精小管邊界完整，管腔飽滿，腔內(nèi)可見成熟精子，生精細(xì)胞層次分明，間質(zhì)細(xì)胞排列整齊；模型對(duì)照組睪丸生精小管病變嚴(yán)重，出現(xiàn)基膜塌陷，層次減少，排列不齊，生精小管間質(zhì)疏松水腫，可見生精細(xì)胞變性壞死，成熟精子減少，殘存的支持細(xì)胞管腔呈空洞樣；富硒當(dāng)歸淫羊藿方低劑量組與模型對(duì)照組比較，形態(tài)稍有好轉(zhuǎn)，生精小管結(jié)構(gòu)可見；富硒當(dāng)歸淫羊藿方中劑量組曲細(xì)精管形態(tài)有所恢復(fù)，管壁分層可見，少量的生精細(xì)胞可見。在生精小管管腔內(nèi)有積液充滿管腔，與模型對(duì)照組比較有了明顯好轉(zhuǎn)；富硒當(dāng)歸淫羊藿方高劑量組可見曲細(xì)精管形狀規(guī)整，生精小管管壁結(jié)構(gòu)良好，生精細(xì)胞明顯增多，可見精子細(xì)胞，生精小管間質(zhì)有輕微的疏松水腫和輕微的纖維增生?？傮w改善程度較富硒當(dāng)歸淫羊藿方低、中劑量組效果好。見圖2。

表2 富硒當(dāng)歸淫羊藿方對(duì)大鼠血清FSH、LH、T 的影響（）

表2 富硒當(dāng)歸淫羊藿方對(duì)大鼠血清FSH、LH、T 的影響（）

注：與正常組比較，##P ＜0.01；與模型對(duì)照組比較，**P ＜0.01。FSH：卵泡刺激素；LH：黃體生成素；T：睪酮

圖2 富硒當(dāng)歸淫羊藿方對(duì)大鼠睪丸組織病理組織結(jié)構(gòu)的影響（HE，200×）

3 討論

腺嘌呤是氮雜環(huán)嘌呤類化合物，臨床上被應(yīng)用于預(yù)防各種原因?qū)е碌陌准?xì)胞減少癥[5]。但由于腺嘌呤可導(dǎo)致慢性的肝腎功能不全，影響大鼠睪丸功能，因此也被用于構(gòu)建男性不育動(dòng)物模型[6]。其作用機(jī)制包括以下5 個(gè)方面。首先，大量攝入腺嘌呤后，腺嘌呤代謝產(chǎn)物尿酸會(huì)因過飽和形成尿酸結(jié)晶沉積于腎小管，造成腎小管堵塞和炎癥反應(yīng)；其次，攝入大量的腺嘌呤使黃嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）活性增加，從而產(chǎn)生大量氧自由基，減少精子和性激素的生成；同時(shí)腺嘌呤也會(huì)影響17β 羥基類固醇脫氫酶（17βhydroxysteroid dehydrogenase，17β-HSD）活性，導(dǎo)致T合成減少。最后，腺嘌呤也可導(dǎo)致腎素血管緊張素系統(tǒng)被破壞，影響性腺的血液循環(huán)[7-10]；最新研究還表明，腺嘌呤也可引起間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（Transformed growth factor-β，TGF-β）的表達(dá)增加和對(duì)稱性二甲基精氨酸（SMDA）蛋白的表達(dá)異常，使精子的產(chǎn)生受到抑制[11]。灌胃腺嘌呤后，大鼠會(huì)出現(xiàn)飲食下降、尿多、飲水量多、體型消瘦、弓背及毛發(fā)失去光澤等特點(diǎn)，本研究在大鼠造模期間逐漸出現(xiàn)上述癥狀，一定程度提示造模的成功，符合不育動(dòng)物模型的臨床表現(xiàn)。

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致精液質(zhì)量下降的原因之一，其中氧化應(yīng)激是由于產(chǎn)生過多活性氧和自由基引起。精子由于缺少細(xì)胞質(zhì)的保護(hù)容易受到活性氧的有害影響[12-13]?；钚匝豕艟拥倪^程中會(huì)產(chǎn)生MDA，因此MDA 的含量被廣泛用于反映精子所遭受的過氧化損傷的水平[14]。Kefer 等[15]認(rèn)為機(jī)體除了存在大量的氧化劑，也存在許多抗氧化劑。SOD 是一類重要的氧化劑清除劑，可催化超氧化物轉(zhuǎn)化為氧氣和過氧化氫；Walczak Jedrzejowska 等[16]認(rèn)為微量元素硒也是一種非酶類抗氧化劑，可防止精子DNA 的氧化損傷。實(shí)驗(yàn)表明，缺硒可導(dǎo)致生精上皮的萎縮、精子生成和成熟的障礙[17]。性激素對(duì)精子的生成也起著重要的作用，性激素含量的異常將影響精子的生成。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型對(duì)照組SOD 活力下降、MDA 含量上升，血清性激素FSH、LH、T 水平異常，提示過量的腺嘌呤在模型對(duì)照組大鼠體內(nèi)蓄積，通過氧化應(yīng)激造成大鼠睪丸的損傷。

湖北恩施地區(qū)有“世界硒都”[18]的稱號(hào)，有許多富硒的中草藥。富硒當(dāng)歸淫羊藿方由當(dāng)歸、淫羊藿、丹參、菟絲子、黃芪、小茴香6 味中草藥組成。其中當(dāng)歸、淫羊藿、黃芪均為恩施富硒藥材，經(jīng)權(quán)威部門檢測(cè)當(dāng)歸含硒量約為7.45 mg/kg，淫羊藿含硒量約為6.47 mg/kg，黃芪含硒含硒量約為14.47 mg/kg[19]。研究表明，當(dāng)歸中黃酮類化合物具有明顯的抗氧化作用，可使血清中SOD 活力明顯增高及MDA 含量降低；淫羊藿也具有延緩性腺衰老、促進(jìn)性激素分泌、增加精子數(shù)量的作用，用淫羊藿灌胃后的腎陽虛大鼠血清睪酮含量增加；菟絲子的提取物可增加精液SOD 活力、降低MDA 含量，并對(duì)氧化應(yīng)激造成睪丸損傷起保護(hù)作用；黃芪是另一類抗氧化的中藥材，黃芪可降低TGF-β 的表達(dá)和SMDA 蛋白的異常表達(dá)[20-27]，陳啟云等[28]運(yùn)用黃芪多糖干預(yù)沙門菌下暴露的大鼠，生精細(xì)胞的調(diào)亡和睪丸組織的破壞得到明顯的緩解；丹參也是一種具有多重作用的中藥材，除了具有抗炎、抗細(xì)胞凋亡的等作用外，丹參能降低MDA 的損傷，并提高SOD 的活性；另有研究也表明小茴香在清除超氧陰離子和抗氧化方面也具有重要的作用[29]。本研究結(jié)果顯示，灌胃富硒當(dāng)歸淫羊藿方中藥合劑后，與模型對(duì)照組比較，富硒當(dāng)歸淫羊藿方高、中劑量組大鼠出現(xiàn)了體重增加、SOD增加、MDA 水平降低、性激素水平趨于正常等變化，提示富硒當(dāng)歸淫羊藿方能一定程度緩解腺嘌呤對(duì)大鼠睪丸的損害。富硒當(dāng)歸淫羊藿方低劑量組情況較模型對(duì)照組雖有所好轉(zhuǎn)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＞0.05），提示低劑量的富硒中藥不能使大鼠生精功能恢復(fù)正常。富硒當(dāng)歸淫羊藿方高劑量組與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），提示高劑量富硒中藥可以改善腺嘌呤灌胃后對(duì)大鼠睪丸的氧化應(yīng)急損傷，能使生精功能恢復(fù)正常。但本研究尚未細(xì)致探討不同硒濃度是否對(duì)腺嘌呤造模后大鼠睪丸SOD、MDA 及血清性激素產(chǎn)生影響，故需后續(xù)實(shí)驗(yàn)予以證明。

綜述所述，富硒當(dāng)歸淫羊藿方可通過提升睪丸SOD 活力、降低睪丸MDA 水平，維持性激素FSH、LH、T 的穩(wěn)定，一定程度上緩解腺嘌呤對(duì)睪丸氧化應(yīng)激的損傷，維持睪丸性激素平衡。