梅佳 李軍

作者單位：430014武漢 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院腫瘤科

我國胃癌的發(fā)病例數(shù)和死亡例數(shù)約占全世界的50%，疾病負擔較嚴重［1］。而目前胃癌的早診率依然較低，大部分患者確診時已處于進展期。手術(shù)、放療、化療、分子靶向及免疫治療等雖然在一定程度上改善了胃癌的治療效果［2-3］，但預(yù)后仍不理想［4］。其中復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌患者死亡的首要原因［5］。而胃癌的發(fā)生、進展和轉(zhuǎn)移是一個多基因、多條信號通路參與的復(fù)雜過程，具體作用機制仍不明確［3］。因此進一步探究胃癌發(fā)生發(fā)展過程中涉及的基因表達改變，有望找到新的治療靶點。沉默調(diào)節(jié)蛋白（sirtuin，SIRT）是一類煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）依賴的去乙?；讣易?，由SIRT1～7等7個成員組成，其異常表達與人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［6］。其中SIRT4是去乙酰化酶家族中特征最不明顯的成員之一，既往研究發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌、食管癌、結(jié)直腸癌和膀胱癌等多種實體惡性腫瘤中表達下調(diào)，且扮演抑癌基因的角色［7］。但SIRT4在胃癌中的作用尚未明確。本研究檢測117例胃癌組織中SIRT4的表達并分析其與患者臨床病理特征及預(yù)后的相關(guān)性，以期闡明SIRT4在胃癌中的作用及其作為治療靶點提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

回顧性收集2013年10月—2014年10月于武漢市中心醫(yī)院接受胃癌根治術(shù)治療的117例胃癌患者的癌組織及其癌旁正常組織（距癌組織邊緣5 cm以上）。入組標準：⑴經(jīng)組織病理學(xué)確診為胃腺癌；⑵術(shù)前均未接受抗腫瘤治療；⑶具有完整的臨床病理資料和5年隨訪信息。排除標準：⑴術(shù)前已轉(zhuǎn)移、接受姑息性切除的患者；⑵合并其他惡性腫瘤既往史者。納入患者的平均年齡為（63.7±9.0）歲；男性68例，女性49例。本研究經(jīng)武漢市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準，患者知情同意。

1.2 免疫組化檢測胃癌組織中SIRT4蛋白的表達

取組織石蠟切片置于恒溫箱中烘烤脫蠟，再置于二甲苯中脫蠟2次，酒精梯度水化后，3% H2O2去離子水（無色液體）孵育10～30 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性。山羊血清封閉15～30 min后，加入SIRT4一抗（1∶200稀釋，美國Abcam公司），4℃孵育過夜；次日滴加標記有HRP的二抗（山羊抗兔二抗，武漢賽維爾生物科技有限公司），室溫孵育30 min；顯色劑（DAB）顯色，顯微鏡下控制反應(yīng)時間；蘇木素復(fù)染，逐級脫水、透明、中性樹膠封片染色。在奧林巴斯光學(xué)顯微鏡下進行閱片和結(jié)果判定。

1.3 免疫組化染色結(jié)果判定

免疫組化染色結(jié)果判定根據(jù)染色強度及陽性細胞百分率進行。染色強度：0分（陰性），1分（弱陽性，淡黃色），2分（中等強度，黃色）和3分（強陽性，棕黃色或褐色）；陽性細胞百分率：0分（≤5%），1分（6%～25%），2分（26%～50%），3分（51%～75%），4分（≥76%）。兩項評分的乘積為最終評分，總分≤3分定義為低表達，＞3分定義為高表達。

1.4 資料收集及隨訪

收集患者性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、淋巴脈管浸潤狀況、神經(jīng)侵犯狀況、術(shù)前癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）水平及TNM分期等臨床資料，其中TNM分期采用國際抗癌協(xié)會（Union for International Cancer Control，UICC）第7版腫瘤分期系統(tǒng)。采用電話或門診復(fù)診隨訪，隨訪截止時間為2019年9月30日，記錄患者的總生存期（overall survival，OS）。OS定義為確診之日至死亡或末次隨訪的時間。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。采用配對樣本t檢驗分析SIRT4在胃癌組織及癌旁組織中的表達水平差異；采用χ2檢驗分析胃癌組織中SIRT4蛋白表達水平與患者臨床病理特征的關(guān)系；采用Kaplan-Meier法計算總生存率并繪制生存曲線，組間差異比較采用Log-rank檢驗；采用單因素Cox回歸分析影響患者OS的相關(guān)因素，將差異有統(tǒng)計學(xué)意義的因素納入多因素Cox比例風險模型。以雙側(cè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SIRT4蛋白在胃癌組織及癌旁組織中的表達

免疫組化檢測結(jié)果顯示，SIRT4蛋白表達主要定位于細胞質(zhì)，在胃癌組織和癌旁組織中均有表達，且在癌組織中的表達低于癌旁組織［（2.138±1.306）分vs（9.582±3.243）分，t=19.078，P＜0.001）］，見圖 1。

圖1 SIRT4蛋白在胃癌組織及癌旁組織中的表達Fig.1 The expression of SIRT4 in gastric cancer and paracancerous tissues

2.2 SIRT4蛋白表達水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

胃癌組織中SIRT4低表達率為62.39%（73/117），SIRT4蛋白表達水平與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴脈管浸潤、神經(jīng)侵犯及TNM分期有關(guān)（均 P＜0.05），見表 1。

表1 SIRT4蛋白表達水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系（n）Tab.1 Relationships between SIRT4 protein expression and clinicopathological characteristics of gastric cancer patients（n）

2.3 SIRT4表達水平與胃癌患者OS的關(guān)系

本組中位隨訪時間為58.2個月，隨訪期間，死亡60例，失訪11例。Kaplan-Meier生存分析及Log-rank檢驗結(jié)果顯示，SIRT4低表達組1年、3年、5年的總生存率分別為100.0%、61.6%、37.0%，SIRT4高表達組分別為100.0%、86.4%、68.2%，SIRT4低表達組的總生存率低于 SIRT4高表達組（χ2=11.244，P=0.001），見圖2。

圖2 SIRT4高表達和低表達胃癌患者的生存曲線Fig.2 The survival curves of gastric cancer patients with high and low expression of SIRT4

2.4 影響胃癌患者OS的單因素及多因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴脈管浸潤、神經(jīng)侵犯、TNM分期及SIRT4表達水平與胃癌患者OS有關(guān)（均P＜0.05）；進一步多因素Cox回歸分析顯示，SIRT4蛋白低表達是影響患者OS的獨立危險因素（HR=2.241，95%CI：1.252～4.165，P=0.021），見表 2。

表2 影響胃癌患者OS的單因素和多因素分析Tab.2 Univariable and multivariable analysis of OS in patients with gastric cancer

3 討論

SIRT4是位于線粒體上的NAD+依賴ADP核糖轉(zhuǎn)移酶，通過抑制谷氨酰胺脫氫酶活性可抑制細胞內(nèi)的谷氨酰胺代謝途徑，從而發(fā)揮抑癌基因功能，廣泛參與多種惡性腫瘤進程［7］。既往研究表明，SIRT4在多種惡性腫瘤中表達下調(diào)，且與不良預(yù)后有關(guān)［7-9］。MIYO等［8］研究發(fā)現(xiàn)，SIRT4在結(jié)直腸癌組織中表達降低，且其表達水平與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴脈管浸潤、遠處轉(zhuǎn)移及TNM分期呈顯著負相關(guān)，生存分析顯示低表達患者的無復(fù)發(fā)生存時間顯著縮短。也有研究報道SIRT4表達水平與食管癌患者臨床病理特征無關(guān)，但多因素分析顯示SIRT4低表達是影響預(yù)后的獨立危險因素［9］。GONG 等［10］通過分析 TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)SIRT4在非小細胞肺癌中高表達，且SIRT4高表達預(yù)示生存期更長。本研究發(fā)現(xiàn)SIRT4在胃癌組織中呈低表達，且SIRT4低表達與腫瘤分化程度、浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴脈管浸潤、神經(jīng)侵犯及TNM分期等不良臨床病理特征相關(guān)。進一步預(yù)后分析發(fā)現(xiàn)，SIRT4低表達患者的總生存期明顯縮短，且是影響預(yù)后的獨立危險因素，提示SIRT4在胃癌的發(fā)生發(fā)展中可能扮演抑癌基因角色。目前有研究表明，SIRT4可能通過影響腫瘤細胞的代謝和生物學(xué)活動參與腫瘤進展過程，從而影響患者預(yù)后［11-14］，但SIRT4抑制胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制仍尚未知，需進一步探索。

本研究結(jié)果證實，SIRT4蛋白在胃癌組織中低表達，且其低表達與患者的惡性臨床病理特征及不良預(yù)后密切相關(guān)，也是影響患者總生存期的獨立危險因素。因此，SIRT4有望成為胃癌患者預(yù)后評估標志物及潛在的治療靶點。但本研究為單中心回顧性研究，且樣本量有限，因此有關(guān)結(jié)論仍需進一步研究證實。