陳仲林麗燕 程變巧 林仁河 蔣小玲

作者單位：350007 福州 1廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科；350014 福州 2福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，福建省腫瘤醫(yī)院病理科；350007 福州 3廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院肝膽內(nèi)科

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝臟最常見的惡性腫瘤，全球每年新發(fā)肝癌病例約840 000例，死亡病例約780 000例［1-2］。手術(shù)、肝移植、化療、局部放療等是治療肝癌的主要措施，但肝癌起病隱匿且尚缺乏特異性的早期檢測指標(biāo)，大部分患者確診時已處于晚期，失去手術(shù)治療機(jī)會，預(yù)后不良［3］。索拉非尼是晚期肝癌患者的主要治療藥物，可以顯著延長中位生存期，但治療后期常出現(xiàn)藥物耐受，且費(fèi)用昂貴［4］。因此亟需探尋可應(yīng)用于肝癌早期診斷、反映疾病預(yù)后的指標(biāo)及開發(fā)新的治療手段。

組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）是表觀遺傳學(xué)中組蛋白修飾的重要蛋白酶，對染色體結(jié)構(gòu)修飾和基因表達(dá)調(diào)控具有重要作用，在多種腫瘤中異常表達(dá)，并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管增生［5-6］。HDAC抑制劑（inhibitors of HDACs，HDACi）也是具有前景的抗腫瘤治療手段。但是HDACi在靶向特定酶方面尚缺乏特異性，可能導(dǎo)致廣泛的副作用。因此，在HCC組織中確定具有應(yīng)用前景的HDACs類型，進(jìn)而開發(fā)新的靶向治療藥物具有重要的臨床意義。本研究通過檢測人HCC組織中組蛋白去乙?；?（histone deacetylase 2，HDAC2）的表達(dá)情況，探討其表達(dá)水平與HCC患者臨床病理學(xué)參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，為尋找新的HCC預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2011年1月至2013年12月于廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院確診并行根治性切除術(shù)的142例HCC患者為研究對象，收集癌和癌旁組織（距腫瘤邊緣1 cm以上）石蠟樣本，所有患者均有完整的臨床病理資料。收集2018年6月至2018年10月手術(shù)切除的配對新鮮HCC組織及癌旁組織8例，離體后30 min內(nèi)置于-70℃冰箱內(nèi)保存，作為后續(xù)蛋白提取。所有患者均經(jīng)術(shù)后組織病理學(xué)診斷為HCC，術(shù)前均未接受化療、放療等輔助治療。本研究經(jīng)廈門大學(xué)附屬福州第二醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者知情同意。

1.2 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測HDAC2蛋白表達(dá)

分別取100 mg新鮮HCC及癌旁組織，加入RIPA裂解液提取組織蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，加入制備好的SDS-PAGE上樣緩沖液，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后，置于脫脂牛奶中室溫封閉2 h，孵育稀釋的一抗HDAC2（稀釋比例1∶1 000，購自美國Abcam公司），4℃過夜，TBST洗膜后，室溫孵育辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗β-actin（稀釋比例1∶2 000，購自美國Abcam公司）2 h，經(jīng)ECL熒光底物反應(yīng)后，膠片曝光顯影，掃描灰度。目的蛋白與內(nèi)參灰度的比值即為目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 免疫組化檢測HDAC2蛋白表達(dá)

1.3.1 免疫組化染色 采用EliVision plus兩步法對HCC石蠟組織樣本中的HDAC2蛋白進(jìn)行免疫組化分析。所有石蠟切片常規(guī)烤片、脫蠟、水化后，用檸檬酸熱修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，3%過氧化氫封閉20 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加稀釋的一抗HDAC2（1∶100），37 ℃濕盒內(nèi)孵育 1 h，PBS 洗滌后加入試劑A（增強(qiáng)劑），37℃濕盒內(nèi)孵育20 min；PBS洗滌后加入二抗（酶標(biāo)羊抗鼠/兔聚合物），37℃濕盒孵育30 min；PBS再次充分洗滌后DAB顯色，蘇木素復(fù)染1 min，1%鹽酸酒精分化3 s，沖水返藍(lán)10 min梯度酒精、二甲苯脫水，切片風(fēng)干后用中性樹膠封片。采用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3.2 免疫組化結(jié)果判讀 免疫組化結(jié)果由2位病理科醫(yī)師進(jìn)行雙盲閱片、評定。按染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例綜合評分。HDAC2蛋白陽性定位在細(xì)胞核上。染色強(qiáng)度評分定義：無色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。陽性細(xì)胞數(shù)比例評分在400倍視野下按陽性細(xì)胞數(shù)比例評定：0分為無陽性細(xì)胞；1分為陽性細(xì)胞比例＜25%；2分為陽性細(xì)胞比例為26%～50%；3分為陽性細(xì)胞比例為51%～75%；4分為陽性細(xì)胞比例＞75%。最終結(jié)果由染色強(qiáng)度評分和陽性細(xì)胞數(shù)比例評分的乘積判定，0～4分為定義低表達(dá)，＞4分為高表達(dá)。

1.4 TCGA數(shù)據(jù)庫檢索策略

檢索 Ualcan網(wǎng)站（http：//ualcan.path.uab.edu）基于TCGA數(shù)據(jù)庫的HCC組織及癌旁組織中HDAC2 mRNA的表達(dá)情況及與預(yù)后的關(guān)系。

1.5 隨訪

術(shù)后開始隨訪，通過查詢就診記錄及電話隨訪，每3個月隨訪1次，隨訪起止時間為2011年1月至2018年4月。無隨訪資料患者21例，隨訪期間，失訪7例，隨訪率為94.2%?？偵嫫诙x為從手術(shù)當(dāng)日至患者死亡或末次隨訪的時間。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。HCC癌組織與癌旁組織中HDAC2蛋白的表達(dá)比較采用配對t檢驗(yàn)。HDAC2蛋白表達(dá)水平與HCC患者一般臨床資料的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，用Log-rank檢驗(yàn)生存分析，多因素Cox回歸探討可能影響患者總生存期的獨(dú)立預(yù)后因素，計(jì)算風(fēng)險比（HR）及其對應(yīng)的95%可信區(qū)間（CI）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HDAC2在HCC組織和癌旁組織中的表達(dá)

檢索TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)果顯示，在HCC組織（n=371）中HDAC2 mRNA的表達(dá)高于正常肝組織（n=50）（P＜0.001），見圖 1A。Western blot檢測結(jié)果顯示，HDAC2蛋白在8例HCC組織中的表達(dá)高于相應(yīng)癌旁組織（P=0.025），見圖1B。免疫組化檢測結(jié)果顯示，HDAC2蛋白主要定位于細(xì)胞核上，染色呈棕黃色，在癌組織中的表達(dá)也高于癌旁組織，見圖2。

圖1 HDAC2在HCC及癌旁組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of HDAC2 in HCC and normal tissues

圖2 HDAC2在HCC及癌旁組織中的表達(dá)（EliVisionplus，×200）Fig.2 Expression of HDAC2 in HCC and normal tissues(EliVision plus,×200)

2.2 HCC組織中HDAC2蛋白表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

在142例HCC組織中，HDAC2蛋白高表達(dá)率為81%（115/142），低表達(dá)率為19%（27/142）。HDAC2 蛋白表達(dá)與腫瘤分化程度、脈管侵犯及復(fù)發(fā)相關(guān)（均P＜0.05），而與患者年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期、包膜侵犯及肝硬化無關(guān)（均P＞0.05），見表1。

表1 HDAC2蛋白表達(dá)水平與HCC患者臨床病理特征的關(guān)系（n=142）Tab.1 Relationship between HDAC2 expression level and clinicopathological charactersitics of HCC patients（n=142）

2.3 HDAC2表達(dá)與HCC預(yù)后的關(guān)系

TCGA數(shù)據(jù)庫顯示，HCC組織中HDAC2 mRNA高表達(dá)患者預(yù)后較差（P＜0.001），見圖3A。121例HCC患者中，Kaplan-Meier單因素分析結(jié)果顯示，HDAC2蛋白高表達(dá)患者1年、3年及5年生存率分別為75.5%、29.8%、5.3%，中位生存期為38個月；低表達(dá)患者1年、3年及5年生存率分別為100.0%、96.3%、44.4%，中位生存期為58個月。Log-rank檢驗(yàn)顯示，HDAC2高表達(dá)組患者總生存期低于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=19.245，P＜0.001），見圖 3B。

圖3 HDAC2高表達(dá)與低表達(dá)HCC患者的生存曲線?Fig.3 Survival curves of HCC patients with high and low expression of HDAC2

2.4 影響HCC患者術(shù)后總生存期的Cox回歸分析

121例HCC患者中，單因素Cox回歸分析顯示，HDAC2蛋白高表達(dá)、腫瘤分化程度及脈管侵犯與HCC患者術(shù)后不良預(yù)后有關(guān)。多因素Cox回歸分析顯示，HDAC2高表達(dá)是HCC患者術(shù)后預(yù)后不良的獨(dú)立危險因素（HR=12.255，95%CI：2.865～52.411），見表2。

表2 Cox回歸分析影響HCC患者術(shù)后總生存期的因素Tab.2 Cox analysis to identify the prognostic factors affecting postoperative overall survival in HCC patients

3 討論

HDACs通過使組蛋白N-末端的賴氨酸殘基去乙?；龠M(jìn)組蛋白八聚體與帶負(fù)電荷的DNA緊密結(jié)合，進(jìn)而限制轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合，從而抑制基因轉(zhuǎn)錄［7］。HDACs分為4個亞家族，常受轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子招募，通過失活抑癌基因啟動子，抑制抑癌基因活性，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［8-9］。HDAC2屬于Ⅰ型組蛋白去乙?；讣易宄蓡T，研究表明，HDAC2可以通過干擾腫瘤抑制基因p21位于啟動子區(qū)域內(nèi)的特異性蛋白1（Sp1）結(jié)合位點(diǎn)而抑制基因的活性［10］。HDAC2還可與SIN3形成復(fù)合物，與E-cadherin啟動子結(jié)合后，抑制 E-cadherin表達(dá)，并促進(jìn) MMP表達(dá)和腫瘤侵襲［11］。HDAC2通過抑制p53和促進(jìn)MYC表達(dá)還能抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程［12-13］。在肝癌細(xì)胞中上調(diào)HDAC2表達(dá)后可抑制microRNA-449表達(dá)，并通過抑制C-MET mRNA表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［14］。由此可見，HDAC2在腫瘤增殖和侵襲中具有重要作用。

LER團(tuán)隊(duì)在東南亞人群的研究結(jié)果顯示，HDAC2在HCC中高表達(dá)［15］。也有研究報道HDAC2高表達(dá)是HCC患者預(yù)后不良的危險因素［16］。進(jìn)一步通過Ualcan網(wǎng)站檢索TCGA數(shù)據(jù)庫，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，在HCC組織中HDAC2 mRNA的表達(dá)顯著高于正常肝組織。本研究通過Western blot檢測8例新鮮HCC組織和配對癌旁組織中HDAC2的表達(dá)，同樣發(fā)現(xiàn)HCC組織中HDAC2表達(dá)高于癌旁組織，免疫組化檢測結(jié)果也進(jìn)一步證實(shí)了HDAC2在癌組織中高表達(dá)。HDAC2蛋白表達(dá)與HCC患者臨床病理特征關(guān)系的分析結(jié)果顯示，HDAC2蛋白在中低分化HCC組織中的表達(dá)高于高分化組，提示HDAC2表達(dá)可能與HCC增殖相關(guān)。此外，HDAC2表達(dá)還與脈管侵犯及復(fù)發(fā)有關(guān)，提示HDAC2也可能與肝癌侵襲及進(jìn)展密切相關(guān)。進(jìn)一步分析HDAC2表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系，TCGA數(shù)據(jù)庫顯示，HCC組織中HDAC2 mRNA高表達(dá)的患者預(yù)后較差。臨床樣本的Kaplan-Meier分析顯示HDAC2高表達(dá)患者的總體生存期縮短，多因素Cox回歸分析結(jié)果證實(shí)HDAC2高表達(dá)是HCC患者術(shù)后預(yù)后不良的危險因素，說明HDAC2在HCC中具有重要的意義，靶向HDAC2可能是HDACi藥物研究的新方向。

綜上所述，HDAC2在HCC組織中高表達(dá)，并與腫瘤進(jìn)展及不良預(yù)后相關(guān)，可能是HCC患者預(yù)后判斷標(biāo)志物及潛在的治療靶點(diǎn)。