單炳丹 何干斌 李瑩希 李月 覃金菲 呂倩瑜 許瑞婕 莫有樺 朱樂玫

雙酚A(bisphenol-A，BPA)以其獨(dú)特性質(zhì)而被廣泛應(yīng)用于食品包裝、牙齒填充物等日用品制作過程，居民日常生活中極易通過飲食攝入和皮膚接觸BPA[1]。BPA是能模擬雌激素而干擾環(huán)境內(nèi)分泌的化學(xué)物，即使是極低劑量也能對生物體的生殖、神經(jīng)、免疫等功能產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響[2]。大量研究均證實，BPA可引起雄性動物性腺發(fā)育不良，降低精液質(zhì)量及精子數(shù)目[3-5]。還有有報道指出，氟化鈉(NaF)能激活ERK、JNK信號通路，抑制卵巢組織細(xì)胞活性，導(dǎo)致線粒體功能障礙，從而誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡[6]。同時，氟能引起雄性動物細(xì)胞曲細(xì)精管生殖細(xì)胞凋亡，造成少精或無精癥的發(fā)生。機(jī)體可以通過各種途徑攝入氟，機(jī)體內(nèi)攝入安全范圍內(nèi)的氟有利于機(jī)體預(yù)防齲齒、維持鈣磷代謝和保持神經(jīng)沖動傳導(dǎo)，但是長期攝入>4 mg/d劑量則會造成氟中毒[7]。因此，長期暴露BPA和NaF的人群，其生殖毒性可能會明顯增強(qiáng)，為探究NaF和BPA聯(lián)合作用對大鼠生殖系統(tǒng)的具體影響，為NaF、BPA安全使用及毒理學(xué)安全評價提供參考依據(jù)，特進(jìn)行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 2018年7月至2019年7月，對165只性成熟的雄性SD大鼠進(jìn)行了基礎(chǔ)對照試驗研究，大鼠均由長沙市天勤生物技術(shù)公司提供(編號SCXK湘-43006700016376)，體重250～300 g，平均(275.41±13.26)g。研究項目獲長沙醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(編號CY倫2018050801)。

1.2 儀器及藥劑 主要儀器包括無菌高速均質(zhì)機(jī)(寧波新藝超聲設(shè)備有限公司，中國)；DXI800化學(xué)發(fā)光性激素檢測儀(貝克曼庫爾特公司，美國)；全自動生化分析儀(奧林巴斯2700)；高速離心機(jī)(長沙湘銳離心機(jī)有限公司，中國)；Alpha-1900Splus紫外分光光度計(上海譜元儀器有限公司，中國)；Q-Sense E4石英晶體微天平(北京中儀科信科技有限公司，中國)等。主要藥劑包括BPA(純度>95%，米度生物技術(shù)有限公司，中國)；NaF(純度>95%，長沙中仁生物科技有限公司，中國)；睪酮(T)測定試劑盒、雌二醇(E2)測定試劑盒均由羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司提供；丙二醛(MDA)和氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 分組及處理 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后按照隨機(jī)數(shù)字表法均分為5組(空白對照組、BPA組、NaF組、低劑量BPA+NaF組、高劑量BPA+NaF組)，每組33只。各組大鼠獨(dú)立飼養(yǎng)，避免交叉影響。持續(xù)染毒28 d。見表1。

表1 5組大鼠經(jīng)口染毒方式及劑量 n=33

1.4 數(shù)據(jù)采集 納入研究的165只大鼠研究期間均無死亡，每日觀察大鼠活動情況(精神、飲食、外形等)，于研究第0、7、14、28天分4次進(jìn)行如下指標(biāo)檢測。每間隔7 d即處死1批次(每組11只)大鼠，處理前對大鼠禁食12 h，隔夜麻醉后股動脈取血6 ml分一式2份，供檢測和備檢使用。同時對大鼠進(jìn)行迅速解剖，取相關(guān)臟器制作組織切片進(jìn)行觀察。

1.4.1 性激素：動脈血液標(biāo)本放置25 min后高速離心(2 000 r/min)10 min，取上清液采用配套試劑盒定量檢測大鼠血清T、E2含量。

1.4.2 睪丸氧化指標(biāo)：處死后大鼠取單側(cè)睪丸，快速去除被膜，取組織塊(0.1～0.2 g)在冰浴條件下制作勻漿(10%)備用。采用配套試劑盒定量檢測SOD活性、MDA含量。

1.4.3 睪丸和附睪臟器系數(shù)：將睪丸和附睪去除周圍脂肪組織和結(jié)締組織，準(zhǔn)確稱量雙側(cè)睪丸和附睪的重量，計算各組實驗大鼠睪丸和附睪臟器系數(shù)，計算公式為：臟器系數(shù)(%)=臟器體重(g)/小鼠體重(g)×100%)[8]。

1.4.4 精子質(zhì)量：取單側(cè)附睪制作精子推片，具體方法如下：將單側(cè)附睪剪碎、孵育(37℃)、過濾得到懸液。取精子懸液(100 μl)與精子固定液(900 μl)混勻，精子固定液按NaHCO3(3.5 g)、甲醛(1 ml)、蒸餾水(100 ml)配制?；靹蛞沟斡谘蛴嫈?shù)板，靜置5 min后在顯微鏡下進(jìn)行精子頭計數(shù)(每次取中央5個中方格)數(shù)板內(nèi)的精子數(shù)記為R，以精子頭為計數(shù)范圍，推算單側(cè)附睪精子懸液中精子的數(shù)量(R×50 000×10/附睪質(zhì)量)，同時計算精子畸形率(畸形精子數(shù)/1 000)[9]。

2 結(jié)果

2.1 5組大鼠處理前后生化指標(biāo)變化情況 染毒后不同染毒方法大鼠血清E2濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.220，P<0.05)；不同染毒方法大鼠血清T濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=39.589，P<0.05)。同時，聯(lián)合染毒組會使實驗大鼠血清E2濃度升高，與空白組、單獨(dú)染毒組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，并且隨著聯(lián)合染毒組劑量的升高，聯(lián)合染毒對大鼠血清E2的提升作用越強(qiáng)(P<0.05)；BPA和NaF單獨(dú)染毒均會降低實驗大鼠血清T濃度(P<0.05)，二者聯(lián)合染毒對大鼠血清T的提升的作用較二者單獨(dú)染毒強(qiáng)(P<0.05)，并且隨著染毒劑量的增加二者聯(lián)合染毒對大鼠血清T濃度的降低作用越強(qiáng)(P<0.05)。不同染毒方法均會對大鼠睪丸組織造成氧化損傷導(dǎo)致MDA升高及SOD下降(P<0.05)。BPA染毒對大鼠睪丸組織的氧化損傷作用比NaF強(qiáng)(P<0.05)；二者聯(lián)合染毒對大鼠睪丸組織氧化損傷作用比二者單獨(dú)染毒作用大(P<0.05)；隨著二者聯(lián)合染毒劑量的加大，其氧化損傷作用增強(qiáng)(P<0.05)。見表2～4。

表2 5組大鼠處理前后E2和T變化情況

表3 5組大鼠處理前后睪丸MDA水平比較

表4 5組大鼠處理前后睪丸SOD水平比較

2.2 5組大鼠處理前后臟器系數(shù)和精子質(zhì)量變化情況 不同染毒方法均會對大鼠睪丸及附睪的臟器系數(shù)造成影響，不同組雄性大鼠睪丸及附睪臟器系數(shù)的比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。BPA與NaF單獨(dú)染毒均能降低大鼠睪丸及附睪臟器系數(shù)(P<0.05)；BPA與NaF聯(lián)合染毒較二者單獨(dú)染毒對大鼠睪丸及附臟器系數(shù)的影響大(P<0.05)；隨著BPA與NaF聯(lián)合染毒劑量的加大，二者對大鼠睪丸及臟器系數(shù)的影響加大(P<0.05)。不同染毒處理后，不同組雄性大鼠精子數(shù)對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)、精子畸形率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步統(tǒng)計分析顯示，BPA和NaF單獨(dú)染毒均能降低雄性大鼠的精子數(shù)量(P<0.05)，提高雄性大鼠精子畸形率(P<0.05)；BPA與NaF聯(lián)合染毒對降低大鼠精子數(shù)量以及提高精子畸形率的作用較二者單獨(dú)染毒時的作用強(qiáng)(P<0.05)；BPA與NaF聯(lián)合染毒對精子數(shù)量及畸形率的影響會隨著染毒劑量的增加而加大(P<0.05)。見表5～7。

表5 5組大鼠處理前后臟器系數(shù)和精子質(zhì)量變化情況

表6 5組處理前后精子數(shù)量比較

表6 5組處理前后精子數(shù)量比較

組別第0天第7天第14天第28天空白對照組50.53±2.7350.68±2.8951.0502.18±51.10±2.77BPA組51.08±2.3646.17±1.80*35.24±2.04*26.63±1.94*NaF組51.25±2.4143.25±1.07*#32.08±2.16*#26.98±3.23*低劑量BPA+NaF組51.08±2.1632.08±2.42*#△25.32±1.64*#△15.73±1.47*#△高劑量BPA+NaF組51.29±2.0728.01±1.63*#△☆15.09±1.11*#△☆9.54±0.32*#△☆

注:與空白組比較,*P<0.05；與BPA組比較,#P<0.05；與NaF組比較,△P<0.05；與低劑量BPA+NaF組比較,☆P<0.05

表7 5組大鼠處理前后精子畸形率比較

2.3 5組大鼠睪丸組織切片和精子形態(tài)學(xué)觀察 空白對照組大鼠睪丸的組織結(jié)構(gòu)清晰，曲細(xì)精管內(nèi)的各級支持細(xì)胞和生精細(xì)胞排列整齊，可見正常精子，精子頭部大小形態(tài)正常，尾部舒展自然。經(jīng)過染毒后，大鼠的睪丸發(fā)生了病理變化，在高劑量BPA+NaF組中，睪丸的曲細(xì)精管發(fā)生不同程度的變性，部分曲細(xì)精管含有精子，而部分不含精子，同時可見胖頭精子。在低劑量BPA+NaF組中，曲細(xì)精管的管腔壁結(jié)構(gòu)紊亂，但管腔內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰，同時可見香蕉頭精子。在BPA組中，可以觀察到管腔壁水腫分離的現(xiàn)象，且管腔內(nèi)存在脫落的細(xì)胞，同時可見無鉤精子。在NaF組中，亦可以觀察到管腔壁水腫分離的現(xiàn)象，且管腔內(nèi)存在脫落的細(xì)胞，同時可見嚴(yán)重畸形的三尾精子。見圖1～5。

3 討論

BPA是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，能夠模擬雌激素的作用，能與雌激素受體結(jié)合，干擾體內(nèi)天然激素的正?；顒?。氟能引起雄性動物細(xì)胞曲細(xì)精管生殖細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致少精或無精癥的發(fā)生[10]。BPA和NaF在我們的生活環(huán)境中都是廣泛存在并比較常見的有機(jī)化合物，生產(chǎn)環(huán)境中接觸比較多，兩種物質(zhì)可以在機(jī)體內(nèi)長時間存留半減期，單獨(dú)作用時的生殖毒性較為確切，但是聯(lián)合作用半減期的影響將是今后研究方向[11]。

本研究發(fā)現(xiàn)，NaF和BPA聯(lián)合染毒后血清E2明顯升高，血清T濃度明顯降低，NaF和BPA單獨(dú)染毒組都沒有出現(xiàn)該情況，推測二者長期聯(lián)合作用會抑制大鼠血清中T分泌并誘導(dǎo)E2分泌，可能具有協(xié)同作用。生殖相關(guān)激素正常分泌是保證精子發(fā)育成熟的重要條件，T是生精過程中的主要調(diào)節(jié)激素，在維持精子發(fā)生和正常性功能上的作用較為顯著。Li等[12]研究指出，E2則主要通過下丘腦-垂體-睪丸性腺軸的調(diào)節(jié)與T發(fā)生拮抗作用，E2/T的相對平衡對維持雄性大鼠生殖功能具有重要作用。研究還發(fā)現(xiàn)，NaF和BPA聯(lián)合染毒后對大鼠睪丸的MDA升高、SOD降低程度大于二者單獨(dú)染毒，提示NaF和BPA聯(lián)合染毒會加劇睪丸組織的氧化損傷。MDA是反應(yīng)機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度的重要指標(biāo)，能間接表明機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，進(jìn)而反映細(xì)胞損傷程度[13,14]。同樣，SOD作為機(jī)體內(nèi)抗氧化劑，其活性降低，通常表明其體內(nèi)清除自由基的能力下降，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞受損。

本次研究發(fā)現(xiàn)，NaF和BPA聯(lián)合染毒組損傷程度較其他組更為嚴(yán)重，推測二者聯(lián)合染毒可加大睪丸組織病理損傷。在睪丸組織中，睪丸支持細(xì)胞(Sertoli細(xì)胞)附著在精細(xì)小管的基膜上，向管腔方向伸展，頂端深入管腔，Sertoli細(xì)胞伸出一些細(xì)長的突起包圍著各級生精細(xì)胞，與各級生精細(xì)胞的生長有關(guān)。Douglas等[15]研究表明，BPA可引起未成熟大鼠的率丸Sertoli細(xì)胞的退化(出現(xiàn)幾個大空泡，細(xì)胞質(zhì)中有電密集物、不同大小的小空泡核濃縮)和數(shù)量減少。其退化程度與BPA的濃度有關(guān)系。染毒處理后的大鼠，精細(xì)小管管腔內(nèi)生殖細(xì)胞排列層次發(fā)生不同程度的紊亂，而生殖細(xì)胞周圍的Sertoli細(xì)胞數(shù)目稀少，說明BPA對小鼠率丸Sertoli細(xì)胞造成了損害，并降低了生精能力。有研究顯示，NaF對睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leyding細(xì)胞)具有直接毒作用，導(dǎo)致生精細(xì)胞周圍不能形成高濃度的睪酮，影響精子的發(fā)生[16]。

同時，NaF和BPA聯(lián)合染毒組精子數(shù)降低和畸形率升高成都明顯大于其他各組。分析原因，BPA可透過血睪屏障而干擾精子的生產(chǎn)發(fā)育過程，導(dǎo)致精子數(shù)量減少，活動精子百分率降低，精子畸形數(shù)升高。NaF對小鼠生殖細(xì)胞具有遺傳毒作用，使睪丸初級精母細(xì)胞染色體的畸變增加。同時，遺傳物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)受氟作用可能發(fā)生物理性狀發(fā)生，后續(xù)研究需結(jié)合基礎(chǔ)實驗進(jìn)一步探究。

綜上所述，BPA和NaF的聯(lián)合作用可能會促進(jìn)雄性大鼠雌二醇的分泌并抑制睪酮的分泌、降低雄性大鼠精子質(zhì)量，二者聯(lián)合作用比二者單獨(dú)作用強(qiáng)，并且隨劑量增加而加大。因此，在評估環(huán)境污染物對機(jī)體生殖功能的影響時，不能簡單根據(jù)單一毒物的實驗或調(diào)查結(jié)果，應(yīng)考慮污染物的聯(lián)合作用對機(jī)體的影響。但是，由于人與動物之間存在種屬差異，試驗結(jié)果不能直接外推到人類，但NaF和BPA作為現(xiàn)在環(huán)境中廣泛存在的物質(zhì)，雖然環(huán)境中檢出的劑量遠(yuǎn)低于本實驗染毒劑量，但長期接觸可能會導(dǎo)致污染物在體內(nèi)蓄積，應(yīng)重視其對接觸人群的生殖健康的長期影響。