趙天嬌耿建磊溫嬋任慧劉鋒魏平

作者單位：050051 石家莊 1河北省優(yōu)撫醫(yī)院普外科；河北省兒童醫(yī)院2普外科，3醫(yī)務(wù)處；4河北醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院

肝母細胞瘤起源于胚胎發(fā)生時的祖細胞，是兒童常見的肝臟惡性腫瘤［1］，發(fā)病率約占兒童惡性腫瘤總數(shù)的1%，發(fā)病率持續(xù)增長，且預(yù)后較差［2］。然而目前其發(fā)病分子機制尚未明確，也缺乏有效的治療靶點。microRNA（miRNA）是一類進化保守、長度較短的非編碼RNA，已被證實在腫瘤細胞增殖、凋亡及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化中發(fā)揮關(guān)鍵作用［3］。近年來，miR-491-5p也被發(fā)現(xiàn)在宮頸癌［4］、乳腺癌［5］等發(fā)揮抑癌作用。在肝母細胞瘤中也發(fā)現(xiàn)miR-491-5p低表達，且與腫瘤生長、轉(zhuǎn)移和糖酵解相關(guān)［6］。FGFR4是含有酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的家族成員之一，在乳腺癌和胃癌中高表達且與腫瘤侵襲和放化療抗性相關(guān)，而miR-491-5p通過調(diào)節(jié) FGFR4可促進胃癌細胞轉(zhuǎn)移［7-10］。在肝癌細胞中FGFR4同樣過表達且促進肝癌細胞進展［11］。但是FGFR4是否參與小兒肝母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展尚未明確。

GSK3β/β-catenin信號通路是腫瘤細胞增殖和遷移的重要通路，其中GSK3β是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過磷酸化β-catenin氨基末端的3個保守氨基酸殘基，調(diào)控細胞質(zhì)中β-catenin蛋白的穩(wěn)定性。當穩(wěn)定的β-catenin蛋白在細胞質(zhì)積累至一定量時，隨即轉(zhuǎn)入核內(nèi)，與核轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合并導致靶基因C-myc啟動子暴露，使其激活并表達，致使腫瘤細胞惡性增殖和遷移［12］。研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)FGFR4表達可介導GSK3β/β-catenin信號通路激活并促進結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移［13］。而miR-491-5p和FGFR4在肝母細胞瘤細胞增殖和遷移中是否具有調(diào)控作用有待進一步探討。本研究通過檢測miR-491-5p和FGFR4在肝母細胞瘤細胞中的表達并分析miR-491-5p與FGFR4的靶向關(guān)系及兩者對GSK3β/β-catenin信號通路的影響，為闡明肝母細胞瘤發(fā)病機制及尋找治療靶點提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

收集河北省兒童醫(yī)院2018年3月至2019年10月收治的15例小兒肝母細胞瘤組織樣本及其相應(yīng)的癌旁正常組織。所有患者年齡均<4歲，術(shù)后病理診斷為小兒肝母細胞瘤，術(shù)前未行化療或放療。本研究獲本院倫理委員會批準，家屬知情同意。

正常肝細胞LO2和肝母細胞瘤細胞HuH-6購自中國科學院上海細胞生物學研究所；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶和CCK-8試劑盒購自美國Gibco公司；Trizol試劑購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；qRT-PCR試劑盒購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；miR-491-5p mimics、miR-491-5p inhibitor由 Genepharma公司合成；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；pcDNA3.1質(zhì)粒購自云舟生物科技有限公司；雙熒光素酶活性檢測試劑盒和8 μm孔徑的Transwell小室購自北京平皓生物技術(shù)有限公司；FGFR4、GSK3β、p-GSK3β、β-catenin、p-β-catenin、C-myc和 p-C-myc抗體購自 Abcam 公司；兔抗β-actin抗體和兔抗鼠IgG抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

正常肝細胞LO2用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；肝母細胞瘤細胞HuH-6用含有15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。將FGFR4基因序列克隆進入pcDNA3.1載體。HuH-6細胞轉(zhuǎn)染前1 d用胰酶消化后計數(shù)，接種至6孔板（3.0×104/孔）內(nèi)過夜培養(yǎng)。按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書將 50 ng的miR-491-5p mimic、mimic NC分別轉(zhuǎn)染至HuH-6細胞，分別記為mimic組和mimic NC組，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，更換新鮮培養(yǎng)基。再將pcDNA3.1空載體和pcDNA3.1-FGFR4質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HuH-6細胞（已轉(zhuǎn)染miR-491-5p mimic），分別記為mimic+Pc組和mimic+Pc-FGFR4組，然后置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，更換新鮮培養(yǎng)基。

1.3 qRT-PCR檢測miR-491-5p和FGFR4 mRNA的表達

采用Trizol試劑提取組織樣本或細胞中的總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA；應(yīng)用qRTPCR法擴增miR-491-5p和FGFR4 mRNA的表達水平。PCR反應(yīng)條件：95℃變性15 s，57℃退火30 s，72℃延伸10 s，進行40個循環(huán)。反應(yīng)體系：cDNA模板2 ng，上下游引物各 0.4 μL，SYBR Primix Ex TaqTM 5 μL，ddH2O補充至10 μL。以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算miR-491-5p與FGFR4 mRNA的相對表達水平。miR-491-5p正向引物序列：5′-TTGACTTAGCTGGGTAGTGGGGA-3′，反向引物序列：5′-CAACCCAGCCAGGTAGAAGGGA-3′；FGFR4 正向引物序列：5′-TCCTACCTGAGGATGCTGGCCGCT-3′，反向引物序列：5′-ACCGTCGGCTCCGAAGCTGCTGCCGA-3′；β-actin正向引物序列：5′-CCGTTGCCCTGAGGCTCTTT-3′，反向引物序列：5′-GATCTGTCTGTCTTCTGTCTC-3′。

1.4 Western blot檢測 FGFR4 和 GSK3β/β-catenin 通路相關(guān)蛋白的表達

用RIPA細胞裂解液裂解未轉(zhuǎn)染及已轉(zhuǎn)染的HuH-6細胞，提取細胞總蛋白，用BSA法檢測細胞蛋白濃度。每組取120 μg蛋白進行變性、SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶4℃封閉1 h，然后加入鼠抗人的FGFR4、GSK3β、p-GSK3β、β-catenin、p-β-catenin、C-myc和p-C-myc抗體（均1∶1 500）搖床4℃孵育過夜，TBST洗膜3次；加入HRP標記的兔抗鼠二抗（1∶2 000），37℃孵育1 h，TBST洗膜3次后，顯影、曝光并采集圖片，用Image J軟件分析條帶灰度值。

1.5 Transwell小室實驗檢測細胞遷移能力

取轉(zhuǎn)染后的HuH-6細胞，更換無血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，用胰酶消化、培養(yǎng)基重懸細胞后計數(shù)。取200 μL細胞懸液（2.5×104個）接種于Transwell小室上室，下室加入15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h；用棉簽擦除上室細胞，95%乙醇固定10 min，結(jié)晶紫染色15 min，PBS洗滌3次后，在顯微鏡下觀察計數(shù)遷移細胞數(shù)。

1.6 CCK-8實驗測定細胞增殖能力

取未轉(zhuǎn)染的HuH-6細胞，經(jīng)胰酶消化、培養(yǎng)基重懸細胞后計數(shù)。以2.5×104/孔接種至96孔板，待細胞生長融合至60%時，按方法1.2進行細胞轉(zhuǎn)染，并置于上述條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每組設(shè)置5個復孔。分別于48 h和72 h，向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，繼續(xù)孵育2 h，用酶標儀檢測波長450 nm處的光密度（OD）值。

1.7 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-491-5p和FGFR4的靶向關(guān)系

將 FGFR4 3′UTR 野生型/突變型（WT/MUT）分別克隆至熒光素酶報告載體pmirGLO載體中，然后分別將miR-491-5p mimic和mimic NC與pmirGLO-FGFR4-WT或pmirGLO-FGFR4-MUT共轉(zhuǎn)染至HuH-6細胞中。48 h后收集上述共轉(zhuǎn)染的細胞，應(yīng)用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測熒光素酶的活性。

1.8 統(tǒng)計學方法

取3次獨立實驗結(jié)果，采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示。癌組織和癌旁正常組織miR-491-5p與FGFR4的表達比較采用配對樣本t檢驗。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Tukey檢驗。以雙側(cè)P＜0.05為差異統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-491-5p、FGFR4在小兒肝母細胞瘤組織和肝母細胞瘤細胞中的表達

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，小兒肝母細胞瘤組織中miR-491-5p的表達低于癌旁正常組織（t=54.653，P=0.005），而FGFR4的表達高于癌旁正常組織（t=32.592，P=0.015），見圖1A～B。HuH-6細胞中miR-491-5p mRNA的表達低于 LO2 細胞（t=26.371，P=0.012），見圖 1C；FGFR4 mRNA及蛋白表達則高于正常肝細胞LO2（t=39.572，P=0.013；t=79.158，P=0.011），見圖 1D～E。

2.2 過表達miR-491-5p的HuH-6細胞中FGFR4的表達

qRT-PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示，mimic組、mimic NC組和Control組細胞中FGFR4 mRNA和蛋白表達量差異均有統(tǒng)計學意義（F=13.715，P＜0.01；F=12.157，P＜0.01），多重比較結(jié)果顯示，mimic 組 FGFR4 mRNA和蛋白表達量低于Control組和mimic NC組（P＜0.05），見圖 2。

圖2 過表達miR-491-5p對HuH-6細胞中FGFR4表達的影響Fig.2 Effect of overexpression miR-491-5p on the FGFR4 expression in HuH-6 cells

2.3 miR-491-5p靶向結(jié)合FGFR4

通過靶基因預(yù)測網(wǎng)站TargetScan進行生物學信息預(yù)測，miR-491-5p與FGFR4 mRNA的3′UTR之間存在互補配對序列，見圖3A。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，與mimic NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-491-5p mimic的野生型組HuH-6細胞的熒光素酶活性降低（t=13.062，P=0.003），而轉(zhuǎn)染miR-491-5p mimic的突變型組HuH-6細胞的熒光素酶活性無明顯變化，見圖3B。

圖3 miR-491-5p與FGFR4的靶向關(guān)系Fig.3 Targeting relationship between miR-491-5p and FGFR4

2.4 過表達miR-491-5p抑制HuH-6細胞遷移和增殖

單因素方差分析顯示，mimic組、mimic NC組和Control組細胞遷移數(shù)及OD值比較差異均有統(tǒng)計學意義（F=18.527，P=0.016；F=20.916，P=0.013），多重比較發(fā)現(xiàn)，mimic組細胞遷移數(shù)及OD值均低于Control組與 mimic NC 組（P<0.05），見圖 4。

圖4 過表達miR-491-5p對HuH-6細胞遷移和增殖的影響Fig.4 Effect of overexpression of miR-491-5p on the migration and proliferation of HuH-6 cells

2.5 上調(diào)miR-491-5p和FGFR4表達促進HuH-6細胞增殖和遷移

單因素方差分析顯示，mimic組、mimic+Pc組、mimic+Pc-FGFR4組和Control組細胞遷移數(shù)及OD值比較差異有統(tǒng)計學意義（F=25.379，P=0.012；F=23.157，P<0.018）。多重比較發(fā)現(xiàn)，mimic組與mimic+Pc組的HuH-6細胞遷移數(shù)和OD值均低于Control組與mimic+Pc-FGFR4組（P<0.05），見圖 5。

圖5 上調(diào)miR-491-5p和FGFR4表達對HuH-6細胞增殖和遷移的影響Fig.5 Effect of up-regulation of miR-491-5p and FGFR4 expression on the proliferation and migration of HuH-6 cells

2.6 上調(diào)miR-491-5p和FGFR4表達促進GSK3β/βcatenin信號通路激活

單因素方差分析顯示，mimic組、mimic NC組和Control 組 p-GSK3β/GSK3β、p-β-catenin/β-catenin 及p-C-myc/C-myc比值比較差異有統(tǒng)計學意義（F=17.547，P=0.017），多重比較顯示，mimic組3項指標比值均低于 Control組與 mimic NC 組（P＜0.05），見圖6A。mimic組、mimic+Pc組、mimic+Pc-FGFR4組和 Control組p-GSK3β/GSK3β、p-β-catenin/β-catenin 及 p-C-myc/C-myc比值比較差異亦有統(tǒng)計學意義（F=25.108，P=0.015），其中mimic組與mimic+Pc組3項指標的比值均低于 Control組和 mimic+Pc-FGFR4組（P＜0.05），見圖6B。

圖6 上調(diào)miR-491-5p和FGFR4表達促進GSK3β/β-catenin信號通路激活Fig.6 Up-regulation of miR-491-5p and FGFR4 expression promoted the activation of GSK3β/β-catenin signaling pathway

3 討論

miRNA是一類小的單鏈非編碼RNA，通過轉(zhuǎn)錄后抑制特定目標mRNA的表達，成為基因表達的主要調(diào)控因子［14-15］。近年研究發(fā)現(xiàn)部分miRNA在腫瘤細胞包括肝母細胞瘤中表達量的改變是影響其功能的主要原因。如ECEVIT等［16］研究發(fā)現(xiàn)，miR-17在肝母細胞瘤組織中低表達且與預(yù)后相關(guān)。CUI等［17］報道m(xù)iR-186通過Wnt信號通路調(diào)節(jié)肝母細胞瘤進展。也有研究報道m(xù)iR-491-5p在小兒肝母細胞瘤中低表達［6］。本研究亦發(fā)現(xiàn)miR-491-5p在小兒肝母細胞瘤組織和肝母細胞瘤細胞HuH-6中低表達，且過表達miR-491-5p可抑制HuH-6細胞增殖與遷移。而既往研究顯示，miR-491-5p在腫瘤細胞中的功能發(fā)揮依賴于其與特定靶向基因的相互作用［18-19］。本研究通過靶基因預(yù)測網(wǎng)站TargetScan進行生物學信息預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miR-491-5p與FGFR4 mRNA的3′UTR之間存在互補配對序列，且在細胞中檢測發(fā)現(xiàn)過表達miR-491-5p可抑制FGFR4表達，說明在肝母細胞瘤細胞中miR-491-5p可靶向負調(diào)控FGFR4表達。

FGFR4是FGFR蛋白家族成員之一，在胚胎發(fā)育、傷口愈合和血管生成的多種生物學過程中發(fā)揮重要作用［20］。已有研究報道顯示，F(xiàn)GFR4在結(jié)直腸癌、乳腺癌中過表達，且與患者生存率低下有關(guān)［21-22］。在肝癌細胞研究中也發(fā)現(xiàn)沉默F(xiàn)GFR4可抑制細胞增殖和侵襲并促進細胞凋亡［23］。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR4在小兒肝母細胞瘤組織和HuH-6細胞中高表達，過表達FGFR4可逆轉(zhuǎn)miR-491-5p對HuH-6細胞增殖和遷移的抑制作用，說明miR-491-5p可能通過調(diào)控FGFR4影響HuH-6細胞增殖和遷移。而既往研究報道，miR-491-5p靶向基因FGFR4被激活后，會導致受體二聚、自磷酸化和下游信號通路激活，而這些信號通路影響細胞分化、增殖、轉(zhuǎn)移、血管生成和化療耐受等［24］。GSK3β/β-catenin信號通路是參與調(diào)控腫瘤增殖和遷移的重要通路［25］。研究顯示，F(xiàn)GF19激活FGFR4可介導GSK3β/β-catenin信號通路促進肝細胞癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化［26］。本研究進一步檢測 GSK3β/β-catenin 信號通路相關(guān)因子的表達，發(fā)現(xiàn)過表達miR-491-5p可抑制GSK3β/β-catenin信號通路激活，而過表達FGFR4不僅可逆轉(zhuǎn)miR-491-5p對HuH-6細胞增殖和遷移的抑制作用，還減弱了miR-491-5p對GSK3β/β-catenin信號通路的抑制作用，表明miR-491-5p可能通過FGFR4調(diào)控 GSK3β/β-catenin 信號通路。

綜上所述，miR-491-5p在小兒肝母細胞瘤組織中低表達，而FGFR4高表達，miR-491-5p可能通過靶向調(diào)控FGFR4表達而阻止GSK3β/β-catenin信號通路從而抑制肝母細胞瘤細胞增殖與遷移。