吳鵬飛 王昀 秦虎 劉洋 吳金澤 王增亮

作者單位：830054 烏魯木齊 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科

腦膠質(zhì)瘤是常見的原發(fā)性顱腦惡性腫瘤，手術(shù)輔助放療或化療是目前臨床上的標(biāo)準(zhǔn)治療策略［1-2］。然而，由于持續(xù)的腫瘤生長或細(xì)胞侵襲，導(dǎo)致腦膠質(zhì)瘤患者的高死亡率，大多患者預(yù)后較差［3］。因此，眾多學(xué)者致力于闡明其發(fā)展機(jī)制并尋找特異性的治療靶點，以提高腦膠質(zhì)瘤的治療療效。瞬時受體電位（transient receptor potential，TRP）通道家族包括生物跨膜蛋白，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)信號和細(xì)胞反應(yīng)而在多種生理和病理過程中起重要作用［4］。M型順時受體電位通道7（melastatin transient receptor potential channel 7，TRPM7）是TRP通道家族的成員，具有非選擇性陽離子通道和蛋白激酶功能［5］。目前研究發(fā)現(xiàn)TRPM7在多種腫瘤中高表達(dá)［6-7］，且在惡性腫瘤進(jìn)展中起重要作用，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、黏附、凋亡、基因表達(dá)、細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移等［8-9］。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）已被證實在腫瘤的發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用［10］，且受多種信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)，包括PI3K/AKT和ERK等途徑［11-12］。本研究利用shRNA轉(zhuǎn)染腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞構(gòu)建TRPM7低表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞株，觀察沉默TRPM7對U251細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及PI3K/AKT/ERK信號途徑的影響，為明確TRPM7在腦膠質(zhì)瘤進(jìn)展中的重要性及其作為新的治療靶標(biāo)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

人正常星形膠質(zhì)HA1800細(xì)胞株、腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株（U251、U87、U373）購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Hyclone公司。TRIzol試劑、PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒和TB GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ試劑盒購自日本TaKaRa公司。shNC和shTRPM7購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司。8 μm孔徑的小室購自美國Promega公司。細(xì)胞免疫熒光染色試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司。RIPA裂解液、BCA試劑盒購自美國Abcam公司。TRPM7抗體購自美國Santa cruz公司。E-cadherin抗體、Vimentin抗體、PI3K 抗體、p-AKT抗體、AKT抗體、p-ERK1/2抗體、ERK1/2抗體購自美國 Cell Signaling Technology公司。熒光二抗（兔抗）購自賽默飛世爾科技有限公司。CKX53倒置生物顯微鏡購自日本Olympus公司。StepOnePlus實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d更換1次培養(yǎng)基。取對數(shù)期、狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

U251細(xì)胞以1×105/孔接種于24孔板，實驗分3組：U251組、U251/shNC組和U251/shTRPM7組。待細(xì)胞生長匯合率至60%左右，按照LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑說明書轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，U251/shNC和U251/shTRPM7組分別轉(zhuǎn)染shNC和shTRPM7，U251組為未轉(zhuǎn)染的U251細(xì)胞。其中shNC、shTRPM7的轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmol/L，轉(zhuǎn)染48 h后收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.4 細(xì)胞克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖能力

轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化，然后以1×103/孔接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中。10 d后，用結(jié)晶紫溶液染色細(xì)胞，并計數(shù)含有≥50個細(xì)胞的集落，顯微鏡拍攝代表性集落并統(tǒng)計。

1.5 Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力

細(xì)胞遷移能力檢測中各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為1×106/mL。在小室的上室加入細(xì)胞懸液100 μL，下室加入含10% FBS的完全培養(yǎng)基500 μL。將小室置于37℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育8 h。取出聚碳酸酯微孔膜，用棉簽輕輕擦去基底膠和上表面的細(xì)胞，然后用中性甲醛固定、蘇木素染色。用顯微鏡觀察遷移的細(xì)胞數(shù)量。細(xì)胞侵襲能力檢測方法同上，但用聚碳酸酯微孔膜包被人工基底膠。

1.6 細(xì)胞免疫熒光染色實驗檢測細(xì)胞中E-cadherin和Vimentin的表達(dá)

用4%多聚甲醛固定轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞10 min，然后在室溫下將細(xì)胞于0.1% Triton X-100中透化20 min，與一抗在4℃下孵育過夜，然后與熒光二抗在室溫下孵育1 h，PBS洗滌3次。DAPI復(fù)染，然后在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.7 qRT-PCR檢測細(xì)胞中TRPM7 mRNA的表達(dá)

采用TRIzol試劑提取細(xì)胞中的總RNA。紫外分光光度計檢測總RNA的純度和含量。使用PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。TRPM7引物序列：正向5′-TAGCCTTTAGCCACTGGAC-3′，反向 5′-GCATCTTCTCCTAGATTTGC-3′；β-actin 引物序列：正向 5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，反向 5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。用TB GreenTM Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進(jìn)行qRT-PCR。qRT-PCR條件：95℃ 30 s，1個循環(huán)；95℃ 5s、60℃ 30 s，40個循環(huán)。使用StepOnePlus實時PCR系統(tǒng)完成實驗后，采用2-△△Ct法分析數(shù)據(jù)。

1.8 Western blot檢測PI3K/AKT/ERK信號途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)

用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測定總蛋白含量。樣品經(jīng)變性后，采用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h，將PVDF膜分別與以下抗體4℃孵育過夜：TRPM7 抗體（1∶1 000）、PI3K 抗體（1∶1 000）、p-AKT 抗體（1∶1 000）、AKT 抗體（1∶1 000）、p-ERK1/2抗體（1∶1 000）、ERK1/2（1∶1 000）和 GAPDH 抗體（1∶2 000）。PVDF膜用TBST洗滌3次，與 IgG-HRP 抗體（1∶4 000）孵育 1h，TBST 洗滌 3次。顯影曝光，采用Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)分析蛋白條帶的灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)分布數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 TRPM7在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，TRPM7 mRNA在4株細(xì)胞系中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=23.05，P＜0.001），進(jìn)一步兩兩比較顯示，TRPM7 mRNA在3株腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)量均高于HA1800細(xì)胞（P<0.05），見圖1A。Western blot檢測結(jié)果顯示，TRPM7蛋白在4株細(xì)胞系中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=97.37，P＜0.001），進(jìn)一步兩兩比較顯示，TRPM7蛋白在3株腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)較HA1800細(xì)胞上調(diào)（P<0.01），見圖1B。其中U251細(xì)胞中TRPM7的表達(dá)水平最高（P<0.001），因此選擇U251細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)功能實驗。

圖1 TRPM7在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.1 TRPM7 expression in glioma cell lines

2.2 TRPM7沉默效果驗證

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，TRPM7 mRNA在U251組、U251/shNC組和U251/shTRPM7組中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=101.40，P=0.001），進(jìn)一步兩兩比較顯示，U251/shTRPM7組TRPM7 mRNA表達(dá)量均較其余兩組降低（P<0.001），見圖2A。Western blot檢測結(jié)果顯示，TRPM7蛋白在U251組、U251/shNC組和U251/shTRPM7組中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=65.15，P＜0.001），進(jìn)一步兩兩比較顯示，U251/shTRPM7組TRPM7蛋白表達(dá)水平均較其余兩組顯著下調(diào)（P<0.001），見圖2B。

圖2 轉(zhuǎn)染后U251細(xì)胞中TRPM7的表達(dá)Fig.2 Expression of TRPM7 in U251 cells after transfection

2.3 沉默TRPM7對U251細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞克隆形成實驗結(jié)果顯示，U251組、U251/shNC組和U251/shTRPM7組細(xì)胞集落數(shù)目差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=31.53，P＜0.001），進(jìn)一步兩兩比較顯示，U251/shTRPM7組細(xì)胞的集落數(shù)目均較其余兩組明顯減少（P<0.01），見圖 3。

圖3 沉默TRPM7對U251細(xì)胞增殖的影響Fig.3 The effect of silencing TRPM7 on the proliferation of U251 cells

2.4 沉默TRPM7對U251細(xì)胞遷移、侵襲的影響

Transwell實驗檢測結(jié)果顯示，U251組、U251/shNC組和U251/shTRPM7組細(xì)胞遷移數(shù)目和侵襲數(shù)目差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=45.70，38.21；均 P＜0.001），進(jìn)一步兩兩比較顯示，U251/shTRPM7組細(xì)胞遷移數(shù)目和侵襲數(shù)目均較其余兩組明顯減少（P<0.01），見圖4。

圖4 沉默TRPM7對U251細(xì)胞遷移、侵襲的影響Fig.4 The effect of silencing TRPM7 on the migration and invasion of U251 cells

2.5 沉默TRPM7對U251細(xì)胞EMT的影響

細(xì)胞免疫熒光染色實驗結(jié)果顯示，U251組、U251/shNC組和U251/shTRPM7組中E-cadherin和Vimentin陽性表達(dá)率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=77.94，35.54；均 P＜0.001），進(jìn)一步兩兩比較顯示，U251/shTRPM7組中E-cadherin陽性表達(dá)率較其余兩組增加（P<0.001），Vimentin陽性表達(dá)率較其余兩組降低（P<0.01），見圖 5。

圖5 沉默TRPM7對U251細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響Fig.5 The effect of silencing TRPM7 on U251 cell epithelial mesenchymal transition

2.6 沉默TRPM7對PI3K/AKT/ERK信號途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，U251組、U251/shNC組和U251/shTRPM7組中PI3K蛋白表達(dá)水平、AKT蛋白和ERK1/2蛋白磷酸化程度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=77.94，35.54，35.54；均 P＜0.001），進(jìn)一步兩兩比較顯示，U251/shTRPM7組中3個相關(guān)蛋白的表達(dá)水平均較其余兩組明顯降低（P<0.01），見圖6。

圖6 沉默TRPM7對PI3K/AKT/ERK信號途徑相關(guān)蛋白的影響Fig.6 The effect of silencing TRPM7 on PI3K/AKT/ERK signaling pathway-related proteins

3 討論

手術(shù)、化療和放療等綜合治療是目前臨床上常用的治療手段，但是難以徹底清除腫瘤組織，腫瘤易復(fù)發(fā)，患者致殘率和致死率均較高，在改善患者生存中的作用有限［13］。近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，針對腦膠質(zhì)瘤特異性的分子靶向治療也成為研究熱點，但是目前尚未找到理想的治療靶點，而針對腦膠質(zhì)瘤的分子靶向藥物治療亦尚未在臨床得到廣泛應(yīng)用。

TRPM7是非選擇性陽離子通道，可滲透Ca2+，Mg2+和其他陽離子，在多種生理過程（包括細(xì)胞生長、細(xì)胞死亡和發(fā)育）中起至關(guān)重要的作用［14］。目前TRPM7已在多種腫瘤中進(jìn)行研究，LUO等［15］在前列腺癌細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，香芹酚可抑制TRPM7表達(dá)從而抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。李愛迪等［16］報道沉默TRPM7可抑制人口腔頰黏膜成纖維細(xì)胞增殖和遷移能力。本研究首先采用qRT-PCR和Western blot檢測腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中TRPM7表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRPM7在腦膠質(zhì)瘤系中均呈高表達(dá)，且在U251細(xì)胞中表達(dá)量最高。因此，后續(xù)利用shRNA轉(zhuǎn)染腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞構(gòu)建TRPM7低表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，進(jìn)一步進(jìn)行功能實驗，同樣發(fā)現(xiàn)沉默TRPM7可使U251細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力下降。

目前研究已證實EMT在腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用［17］。因此認(rèn)為，有效抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞EMT可能是有效治療腦膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。而在多種惡性腫瘤研究中均發(fā)現(xiàn)TRPM7可影響EMT。通常在EMT期間，E-cadherin被下調(diào)而Vimentin被上調(diào)［18］。研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)TRPM7可抑制卵巢癌細(xì)胞EMT，其E-cadherin蛋白上調(diào)而Vimentin蛋白下調(diào)［19］。在結(jié)直腸癌細(xì)胞研究中也觀察到沉默TRPM7可能通過調(diào)節(jié)EMT而抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲［20］。本研究同樣發(fā)現(xiàn)沉默TRPM7可增加E-cadherin表達(dá)，并降低Vimentin表達(dá)，與上述文獻(xiàn)報道一致，提示TRPM7可能在腦膠質(zhì)瘤中誘導(dǎo)EMT，從而在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和遷移中發(fā)揮重要作用。

細(xì)胞的增殖、遷移和運動往往受到不同的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)，包括PI3K/AKT途徑、ERK途徑等［21］。腦膠質(zhì)瘤中也發(fā)現(xiàn)激活PI3K/AKT/Snail、MAPK/ERK和PI3K/AKT等信號通路可促進(jìn)細(xì)胞增殖和侵襲［22-23］。因此，推測TRPM7可能通過以上途徑在腦膠質(zhì)瘤中發(fā)揮作用。為此，本研究進(jìn)一步采用Western blot檢測沉默TRPM7后U251細(xì)胞中PI3K/AKT/ERK信號途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沉默TRPM7使PI3K蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，AKT和ERK1/2蛋白磷酸化程度也明顯降低，說明該途徑被激活，同時可能調(diào)節(jié)了E-cadherin和Vimentin蛋白的表達(dá)，從而抑制EMT。

綜上所述，TRPM7在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，沉默TRPM7可抑制U251細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和EMT，可能與激活PI3K/AKT/ERK信號途徑有關(guān)。TRPM7可能是腦膠質(zhì)瘤候選的預(yù)后生物標(biāo)志物和潛在的治療靶標(biāo)。